初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル

このプロトコルの全体的な目標は、ラット弁間質細胞または VIC を分離して、石灰性大動脈弁疾患のメカニズムを研究することです。この方法は、VICが石灰化する理由や、これらの細胞が石灰化するのを防ぐために何ができるかなど、弁の石灰化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さらなる研究のために細胞株に形質転換できる可能性と、アクセス可能性です。

すべての解剖は、サンプルと試薬の無菌性を確保するために、事前に70%エタノールで消毒した換気フードで行ってください。解剖ツールをオートクレーブ滅菌し、使用前にツールの先端を70%エタノールを含むビーカーに浸します。動物や組織と接触する前に、解剖ツールを洗浄バッファーのビーカーに浸します。

テキストプロトコルに記載されているようにラットを淘汰した後、動物をガラス製の解剖ボードの上に仰向けで置き、70%エタノールを噴霧して皮膚を消毒します。心臓を解剖するには、解剖ハサミを使用してラットの正中線に4センチの切開を行い、腹腔を露出させ、胸郭と肺を慎重に取り外して心臓を露出させます。鋭利なハサミで心臓を取り除きます。

解剖した心臓を氷冷洗浄バッファーに保管し、ラットのすべての肉眼的解剖が完了するまで保管します。.各心臓をマイクロダイセクションするには、解剖した心臓をウォッシュバッファーで覆われたペトリ皿に移します。スプリングストレートハサミで心筋をトリミングし、上行大動脈と大動脈基部を囲む小さな領域を左に向けます。

同じスプリングストレートハサミを使用して、左心室に向かって上行大動脈を慎重に切り開き、大動脈弁尖を露出させます。次に、開いた大動脈をハンクのバランスの取れた塩溶液で満たされた新鮮な滅菌ペトリ皿に移します。大動脈の基部にある独特のU字型でマークされた大動脈弁尖を、Vannasのはさみで解剖します。

すべての解剖が完了するまで、すべてのリーフレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーに保管します。.すべてのリーフレットを採取したら、100gで摂氏4度で1分間遠心分離し、洗浄バッファーを除去します。弁内皮細胞またはVECを除去するには、コラゲナーゼIIのミリリットルあたり425単位の100マイクロリットルで、摂氏37度で5分間リーフレットを消化します。.

200 マイクロリットルのピペットチップを使用して静かにピペッティングし、消化を中断します。100gで30秒間遠心分離し、リーフレットをペレット化します。上清を慎重に捨てた後、リーフレットを500マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄し、100gで30秒間遠心分離して細胞を再ペレット

リーフレットからVICを採取するには、100マイクロリットルのコラゲナーゼIIで摂氏37度で1.5〜2時間消化します。次に、200マイクロリットルのピペットチップを使用して静かにピペッティングしてVICを解放します。コラゲナーゼIIを19ミリリットルの培地で希釈し、670gで5分間遠心分離して、VICと残りの弁弁尖の破片をペレット化します。

上清を捨てた後、リーフレットとVICを培養プレートまたはフラスコに移します。VICを培養培地で5〜7日間培養し、5%CO2の存在下で摂氏37度でコンフルエントに達するまで、72時間後に培地を交換します。in vitro石灰化実験用の初代ラットVICを調製するために、6ウェルプレートにウェルあたり150,000細胞の密度で細胞を播種します。

細胞を90%の密度が高まるまで培養培地に保持します。VICを石灰化処理と対照培地で処理し、5%CO2の存在下で摂氏37度でさらに72時間インキュベートします。石灰化した初代ラットVICをその後の下流分析のために研究するには、石灰化培地またはコントロール培地を除去します。

単層を洗浄バッファーで洗浄し、非結合のカルシウムイオンとリン酸イオンを除去してから、テキストプロトコルに詳述されているようにラットVICの特性評価を行います。ラットVIC石灰化研究では、細胞単層を5%Alizarin Red S溶液で染色し、シェーカーで20分間静かに揺さぶります。その後、蒸留水で毎回5分間3回洗浄します。

カルシウム沈着を定量するには、生化学的カルシウムアッセイキットを使用します。0.6モルの塩酸を使用して、摂氏4度で24時間、穏やかに攪拌しながらカルシウムイオンをリーチします。上清を採取し、メーカーのガイドラインに従ってカルシウムアッセイキットを使用してカルシウム濃度を測定します。

最後に、テキストプロトコルに記載されているように、カルシウム濃度を全細胞タンパク質の一部分として計算します。単離された細胞のVIC表現型は、免疫蛍光法、VICマーカー、ビメンチンおよびアルファ平滑筋アクチンのプローブによって確認されました。また、VIC成長調節因子である組織成長因子β-1および2の発現をPCR解析により確認しました。

ウェスタンブロット分析も実施し、ラットVICが内皮細胞マーカーCD31に対して陰性であることを確認し、犬の僧帽弁VECを陽性対照として使用した。ラットVICは、病理学的高カルシウム血症および高リン血症の状態を模倣する高レベルのカルシウムおよびリン酸塩に曝露された。カルシウム沈着のためのアリザリンレッド染色および塩酸浸出後のカルシウムレベルの比色測定によって決定された、カルシウムおよびリン酸塩誘発石灰化によるVICの治療。

VICをカルシウムとリン酸塩で処理すると、骨形成マーカーMSX2、ALPL、およびPHOSPHO1のmRNA発現が有意に増加しました。一度習得すると、このテクニックは18弁の弁尖の消化を除いて、1〜2時間で行うことができます。この手順を試みる際には、解剖および消化中の無菌性を確保することが重要です。

このビデオを見た後、初代ラットVICを分離する方法と、それらを使用してVIC石灰化の背後にあるメカニズムを調査する方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、VICの生理学と挙動を研究するために、フローサイトメトリーや顕微鏡分析などの他の方法を実行できます。開発後、この技術は、心血管研究の分野の研究者がラットモデルを使用してヒトの大動脈弁分類のメカニズムを探求する道を開く可能性があります。