Name: 初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶラット由来弁間質細胞（VICs）の分離と培養法。大動脈弁石灰化の細胞・分子メカニズムを解明し、石灰化性大動脈弁疾患の治療戦略開発に貢献する新規モデルです。

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CD31 抗体の使用は、博士カレン ・ タン、エジンバラ大学から寛大な贈り物だった。本研究は、バイオ テクノロジーと研究所戦略的プログラム助成 (BB/J004316/1; の形で生物科学研究会議 (BBSRC) からの資金によって支えられました。BBS/E/D/20221657) (系粘弾性体と CF)、研究所キャリア パス交わり BB/F023928/1 (系粘弾性体)、および就労資金 BBSRC 場合就労 BB/K011618/1 (LC) を経由。

すべての動物実験は、ロスリン研究所の動物ユーザー委員会によって承認された、動物のケアとの動物の使用のためのホーム オフィス (イギリス) ガイドラインに従って維持されました。下記プロトコル、5 週間の古い、男性スプレイグ ラットが使用されました。
1. 試薬のレシピ
<ol><li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と栄養混合物 F-12 (DMEM/f12 キー) を使用して培養液の準備します。10% 滅菌熱不活化牛胎児血清 (FBS) と 1% のゲンタマイシンを追加します。</li>
	<li>培養液と 2.7 mM Ca/2.5 Pi を使用して石灰化媒体の準備します。<ol>
<li>CaCl2 555 mg を量り分けると 1 M CaCl2の 5 mL を作るため 5 mL の蒸留水に溶解して1 M 塩化カルシウム(CaCl2) を準備します。ソリューションをソリューションを殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターをフィルターします。</li>
		<li>計量 710 mg 無水塩基リン酸ナトリウム (Na2HPO4) うちと無水塩基性リン酸ナトリウム (NaH2PO4) 600 mg を 5 mL の蒸留水に溶解して1 M リン酸ナトリウムを準備します。水。ソリューションを殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通して 3,870 μ L の Na2HPO4 1,130 μ NaH2PO4とフィルターを組み合わせます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>準備、洗浄バッファーをハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) と 1% のゲンタマイシンを含有します。</li>
</ol>2. 解離フードの準備
<ol><li>以前サンプルおよび試薬の無菌性を確保するための 70% エタノールで消毒、換気フードのすべての解剖を実施します。</li>
	<li>郭清ツールをそれらを使用する前に 70% エタノールを含むビーカーにツールのヒントを浸すことによって続いたオートクレーブで滅菌します。</li>
	<li>ビーカー洗浄バッファーを含むを準備し、動物や組織と接触する前に洗浄バッファーで郭清ツールを浸します。すべての回で氷の上洗浄バッファーを保持します。</li>
</ol>3. 初代ラット VICs の抽出
注: 以下に示すプロトコルの 5 週間の古い、男性スプレイグ ラットが使用されました。
<ol><li>ラットを処分 (~ 100 g) 英国ホーム オフィスのガイドラインに従って子宮頸の転位で。</li>
	<li>各ラットの心臓を解剖するには、ガラス解剖板に動物の仰臥位を配置し、70% エタノールを噴霧して皮膚を消毒します。</li>
	<li>ラットの腹腔内を公開し、胸郭と肺、心臓を公開する慎重に取り外します、解剖はさみの助けを借りて正中線で 4 cm の切開を行います。</li>
	<li>シャープのペアで心臓を取り出して曲線はさみを春ラットの総解剖のすべてが完了するまで氷冷洗浄バッファーで切り裂かれた心を保管します。</li>
	<li>マイクロ - それぞれの心の解剖、ペトリ皿に転送、後者は洗浄バッファーで説明します。小さな周辺では、上行大動脈、大動脈と左に春まっすぐハサミ (6 mm 刃) と心筋をトリムします。</li>
	<li>同じを使用してまっすぐはさみ (6 mm 刃) の春、慎重に左心室に向かって上行大動脈を切開、大動脈弁のリーフレットを公開します。</li>
	<li>新鮮な滅菌シャーレ HBSS でいっぱいに開いた大動脈を転送します。Vannas 型 capsulotomy マイクロ剪刀 (刃 3 mm) のペアで、大動脈の基部、ユニークな 'U' の形状によって特徴づけられる、大動脈弁のリーフレットを解剖します。</li>
	<li>すべてのチラシを 1 mL の氷冷洗浄バッファーすべて解剖が完了するまでは、1.5 mL 遠心チューブに格納します。</li>
	<li>すべてのチラシが収穫された後は、洗浄バッファーを削除する 4 ° C で 1 分 100 × g で遠心します。</li>
	<li>滅菌を確実に細胞文化フードで後続の手順を実行します。100 μ L 425 U/mL コラゲナーゼ II 37 ° C で 5 分間のリーフレットを消化、VECs を削除するには200 μ L ピペット チップを使って軽くピペッティングして消化を中断します。</li>
	<li>100 × g で遠心する 30 s、リーフレットをペレットし、上澄みを慎重に廃棄します。500 μ L の洗浄バッファーで 2 回洗浄し、30 の 100 × g で遠心分離によって細胞を再ペレット s。</li>
	<li>チラシから VICs を収穫するには、2 h 425 U/mL コラゲナーゼ II の 100 μ L で消化し、上下に 200 μ L ピペット チップを使用して軽くピペッティングして VICs を解放します。</li>
	<li>19 ml 培養液とビックスと残りの弁尖の残骸をペレットに 5 分間、670 × g で遠心するコラゲナーゼ II を希釈します。培養上清を破棄し、それに応じて文化板/フラスコにリーフレットや VICs を転送 (表 1)。</li>
	<li>培養 72 時間後のメディアの変更培地、37 ° c、5% (二酸化炭素) CO2の存在下での confluency に到達するまでに 5-7 日間 VICs。In vitroの実験でその後の使用のための通路 5 回まで合流したら 100% に達する。</li>
</ol>4. ラット VICs の石灰化の誘導
注: すべての実験のため、診断とセルをカウントします。
<ol><li>シードと汚染を防ぐために滅菌のフードの継のすべての一次電池を実行します。石灰化実験の in vitroの初代ラット VICs を準備をするには、細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 150,000 の密度で細胞を播きます。≥ 90% の confluency (通常 72 h) まで培地の維持します。</li>
	<li>石灰化を制御媒体対 VICs を扱い、37 ° c、5% CO2、さらに 72 時間の存在下で孵化させなさい。</li>
	<li>以降の下流解析の石灰化の初代ラット VICs を勉強するには、石灰化/制御媒体を削除および非バインドの Ca と Pi のイオンを除去するのに洗浄バッファーで単分子膜を洗浄します。</li>
</ol>5. ラット ヴィックのキャラクタリゼーション
<ol><li>ビメンチンと α-SMA のシード細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 150,000 の密度でラット VICs などの表現型マーカーを監視する免疫染色を含むカバー スリップ (セルはカバー スリップの表面に増加します)、50% の confluency まで成長しておきます。</li>
	<li>培養培地を吸引し、5 分毎回 10 分のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回を洗濯する前に 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と細胞膜を修正します。 注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります。</li>
	<li>ブロックと透過バッファーでセル単一層を孵化させなさい (1 × PBS、二次抗体と同じ種から正常な血清の 5%、0.3% トリトン X-100) 室温で 1 時間。</li>
	<li>細胞膜を抗体希釈バッファーで希釈し、マウス抗ビメンチンとウサギ抗 α SMA の抗体とインキュベート (1% ウシ血清アルブミン + 0.3 %pbs でトリトン X-100) 一晩 4 ° c、そっとロッカーに揺れ。 注: 否定的なコントロールから成って非共役マウス IgG とウサギ IgG、テスト サンプルとして同じ希釈液を使用します。</li>
	<li>次の日 3 回 5 分たびに PBS の一次抗体を洗浄します。</li>
	<li>ロッカーに優しく揺れ、常温で 1 h の蛍光標識二次抗体と細胞膜を孵化させなさい。</li>
	<li>PBS 洗浄 3 回、鉗子、coverslip 含む 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 上の場所のペアを持つ coverslips (ラット VICs を含んだ) を軽くピンセットで抜きます。蛍光顕微鏡による可視化の前に 4 ° C で、少なくとも 24 時間を治すためスライドを残します。</li>
	<li>西部のしみの分析の 150,000 の密度で VICs 6 ウェル プレートで細胞/ウェルと合流まで 100% 成長培地のままのラットをシードします。</li>
	<li>CD31 の発現を測定し、VEC 汚染を排除するのに西部のしみを実行するのに蛋白質の 8 μ g を使用します。 注: 標準的な西部のしみのプロトコルは、9を前述のように続いた。</li>
	<li>遺伝子研究、製造元のガイドラインに従って商業キットを使用してリボ核酸 (RNA) を抽出します。</li>
	<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用してターゲット遺伝子発現を測定する逆のトランスクリプションを使用して cDNA を取得およびリアルタイム PCR (RT-PCR 法; 別名 qPCR) 緑蛍光検出、以前として参照の遺伝子としてGapdhの使用10を説明します。<ol>
<li>PCR 解析の次のプログラムを使用: 94 ° C の 3 分の 1 サイクル 30 サイクル 94 ° C の 30 s、63 ° C、30 s、72 ° C、35 s、および 5 分の 72 ° C の最後に 1 サイクル。</li>
		<li>QPCR 分析のために次のプログラムを使用: 95 ° c、10 分間 1 サイクル 95 の 40 のサイクルの 30 s、95 ° C、30 ° C 15 秒、1 分、1 分、55 ° C の 95 ° C の追加サイクルの 60 ° C の s。</li>
	</ol>
</li>
	<li>トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE) バッファーに 2% の agarose のゲルを使用して PCR の製品を分析するゲルの電気泳動を実行します。</li>
</ol>6. ラット ヴィック石灰化研究
<ol><li>アリザリン赤 S および生化学的な石灰化研究は、セクション 4 で説明されているシードと石灰化のガイドラインに従ってください。</li>
	<li>5% アリザリンレッド S 溶液、20 分間、シェーカーで優しくロッキングと細胞膜を染色します。その後 5 分間たびに、蒸留水で 3 回を洗ってください。各ウェルの画像を取得します。</li>
	<li>Ca 沈着を定量化するには、生化学的 Ca 測定キットを使用します。穏やかな動揺と、4 ° C で 24 時間 0.6 M 塩酸 (HCl) を使用して Ca2 +イオンを溶出します。</li>
	<li>収穫 Ca アッセイを用いた Ca 濃度キット (材料表参照) 清とメジャー メーカーのガイドラインに従います。</li>
	<li>総細胞蛋白質の一部分としてカルシウム濃度を計算します。0.1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) + 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) と細胞膜から細胞蛋白質を変化します。製造元のガイドラインに従って、互換性のある洗剤 (DC) 蛋白質のアッセイを用いた総蛋白濃度を決定します。</li>
</ol>

<ol><li>Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+stenosis%3A+a+disease+of+the+valve+and+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).</li>
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</ol>

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この詳細なプロトコルでは、初代ラット VICs、酵素消化によるラット心臓弁からこれらのセルの隔離の有効化の獲得のための実用的な方法について説明します。私たちのメソッドは、さらにサポートし、大動脈弁石灰化13を勉強する以前に報告されたラットの in vitroモデルの用途が広がります。大動脈弁からの VICs の隔離は、隣接 VECs から汚染の可能性を紹介します。ただし、蛍光抗体法によりデータは初期消化手順が VECs は、血管内皮細胞マーカー、CD31 陰性隔離されたセルのレンダリングを削除するための十分なことを確認します。さらに、α SMA の染色は、石灰化12に必要な VICs のアクティブ化された表現型を確認します。
ビクトリア州の分離は、以前報告されている大型動物モデル6,7,8。ただし、これらの種は、限られた下流の研究だけでなく、世界中の研究所で、アクセシビリティが制限されて利用可能なツールの遺伝学的および分子によって制限されます。対照的に、このようなツールは容易に入手できる齧歯動物およびしたがって、ラット由来の VICs により大容量の実験的なデザインを分離する機能に定評。幼若ラットから VICs の使用はまた細胞が比較的より古いラット、したがってより多くの細胞を生成するための動物を必要とするよりも増殖を意味します。マウスが容易にアクセスできるが、マウスのため、分離の特に小さい心を持つマウスの主の VICs は、時間がかかるだろうし、かなり多くの動物はラットのモデルとしてセルの同じ収量を分離する必要があります。
この記述方法の重要な利点は VICs が野生型遺伝子導入ラットと心血管疾患と弁の傷害のモデルラットから一時的に分離することができます。モデルラットを用いた多数動物の大規模な実験、したがってをする必要が動物の使用を減らす、初代ラット VICs は一度も特徴とされているセルの行を生成する変換ことができます。
CAVD の厳しい臨床的意義が広く認識しながら根本的な原因となるメカニズムまだ覚悟しなければなりません。さらに、できなくなり、大動脈弁の石灰化を治す可能性のある治療法は利用できませんでの効果的な薬を提示します。石灰化する条件の下で VICs の文化したがって、CAVD の関連性の高い体外モデルを提供します。Ca と Pi レベルの上昇がラット骨遺伝子マーカー Msx2、 Alpl、およびPhospho1の発現の増加と VICs の試験管に石灰化を誘導するを紹介します。広く、これらのマーカーは、血管石灰化14,15,16の病理学的プロセスに関連付けられているを設立します。我々 のデータしたがってラット VICs 石灰化する中での文化が大動脈弁石灰化の培養を研究するための適切なモデルであることを示します。確かに、当研究室の最近の研究は、Ca がヴィック由来の小胞の17のアネキシン VI 濃縮によって大動脈弁の石灰化を促進することを示すこのモデルを活用しています。
ラット VICs とその効率的な特性を使用しての利点があるにもかかわらず、いくつかの制限はまだ存在します。まず、ラット バルブ内のビクトリア州人口のサイズは非常に小さい、従って多くの動物は広範な生体外で研究の十分なセル番号を生成するために必要な。ただし、不死化弁間質細胞ライン、18、私たちによって最近報告されて、確認し、これらの調査結果を拡張後に初代培養を用いた予備的な調査を実施しこの制限を克服することが可能です。
要約すると、この方法は、分離を成功させる、カルチャ、およびプライマリ ラット VICs は、その後様々 な生化学的な試金蛋白質など分析・ RNA 解析を使用して査定されるかもしれないの石灰化について説明します。このモデルは、CAVD体外、調査される信頼性と便利なシステムを提供しています、この破壊的な疾患の分子機構を調査するための貴重なツールを提供します。

健康な大動脈弁は、バルブの開閉時の機械的応力分布は均等に分配する 3 つのリーフレットで構成されます。弁尖が定義した 3 つの層の構造: 線維、海綿と ventricularis、どの家が優勢な細胞型と間質細胞 (VICs) をバルブします。これらの 3 つの層に挟まれた弁血管内皮細胞 (VECs)12 台のベッド。
VICs は、進行の石灰性大動脈弁石灰化 (CAVD)、西部の世界で最も一般的な心臓弁疾患で重要な役割を果たします。CAVD は積極的に弁膜組織とその周囲の微小環境によって調節される進歩的な条件として記述されます。携帯電話の変更は、当初、線維性肥厚と最終的に大動脈弁尖の広範な石灰化を引き起こします。これは、重要な大動脈弁狭窄につながる、最終的には、左室流出路閉塞2、唯一の可能な治療として外科的な弁置換を残してします。
CAVD の病態が複雑な生理学的な骨の鉱化作用の3に同じようなメカニズムを共有します。ながら、研究の数は、骨トランス分化および石灰化4,5を受けるための VICs の能力を示している、このプロセスを支えるメカニズムがまだ完全に解明されて強調表示、CAVD の実現と関連する体外モデルの重要な要件です。
研究所の数によって前作が正常にブタとウシのモデルから VICs を分離し、石灰化条件6,7,8の下でこれらの細胞を培養します。これらのモデルの大動脈弁のサイズが大きいため酵素消化を通って細胞の分離はセルの純粋な人口を生成する非常に効果的なされています。ただし、これらのモデルは大型動物種における分子ツールの限定のために制限することができます。対照的に、齧歯動物モデルの比較的低コスト、遺伝子操作の可能性、容易に利用可能な分子ツールの広範な配列による有利なまま。ただし、小型動物モデルからの VICs の隔離は広く採用されない、小さい組織サンプルを扱うときの問題の起こりそうな結果であります。
この詳細なプロトコルは、ラット VICs の直接の隔離のための包括的な法を報告します。酵素の消化力のシリーズに続く、バルブを細かくして VICs を分離し、さまざまな実験、細胞培養、石灰化と遺伝子発現を含むで採用できます。この関連性の高い体外モデル CAVD の間違いなくこの病理学的プロセスの私達の知識の向上に不可欠な貢献になります。

<table><tbody><tr><td>解剖はさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>14393</td><td>オートクレーブ使用前に。</td></tr><tr><td>スプリングストレート(8mmブレード)</td><td>ワールド精密機器</td><td>15905</td><td>オートクレーブ使用前に。</td></tr><tr><td>SuperFine Vannasハサミ(5mm刃、8cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>オートクレーブ使用前。</td></tr><tr><td>デュモン #5 ピンセット (11 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>オートクレーブ使用前。</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイ</td>オ11320074 <td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10500064</td><td>培地に加える前にフィルター。</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E/0650DF/17</td><td>蒸留水で70% v/vに希釈します。</td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H1150PB17</td>蒸留<td>水で0.6Mに希釈します。</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>UN1823</td>蒸留<td>水で0.1Mに希釈します。</td></tr><tr><td>DAPI</td>、<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td>、<td>P36931</td><td></td></tr>、<tr><td>Alexa Fluor、594、ヤギ抗マウス抗体</td><td>、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>、A11005</td>、<td>抗体希釈バッファーで1/250希釈。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21206</td><td>1/250 希釈液 in antibody dilution buffer.</td></tr><tr><td>Superscript II kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P/N58875</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymerase kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18038026</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Bolation/EDTA (TBE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9863</td><td>1x に希釈使用前に水を蒸留しました。</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16500</td><td>2% 1x Tris/Bolation/EDTA(TBE)。</td></tr><tr><td>溶解バッファー(RIPA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>T75 フラスコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>T175 フラスコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>159920</td><td></td></tr><tr><td>qPCR プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB0990</td><td></td></tr><tr><td>ラット Msx2 プライマー</td><td>Qiagen</td><td>QT01084090</td><td></td></tr><tr><td>ラットアルプリンプライマー</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00190680</tr><tr><td>ラット Enpp1 プライマー</td><td>Qiagen</td><td>QT00181426</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>シグマ</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 フラスコ</td><td>シグ</td><td>マ CLS430639</td><td></td></tr><tr><td>一塩基性リン酸塩</td><td>Σ</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸塩</td><td>Σ</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>0.1M NaOHで0.1%に希釈します。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PBSで4%に希釈します。</td></tr><tr><td>トリトン X100</td><td>シグマ</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>アリザリンレッド S</td><td>シグマ</td><td>A5533</td><td>蒸留水で最大2%まで作り、pH 4.2に調整します。</td></tr><tr><td>TGF&beta;-1 プライマー ペア: f: GCTACCATGCCAACTTCTGTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA</td><td>シグマ</td><td></td><td>使用濃度: 10 &mu;M</td></tr><tr><td>TGF&beta;-2 プライマー ペア: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG</td> シ<td>グマ</td><td></td><td>使用濃度: 10 &mu;M</td></tr><tr><td>モノクローナル抗β;-アクチン&マイナス;マウス</td><td>Sigma</td><td>A3854</td> で産生されたペルオキシダーゼ抗体、<td>トリス緩衝生理食塩水 + 0.1% Tween (TBS/T) の 5% BSA で 1/50000 希釈。</td></tr><tr><td>マウス抗ビメンチン抗体</td><td>Sigma</td><td>v6389</td><td>1/900 希釈液 <強>抗体希釈バッファー</強> (1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1% ウシ血清アルブミン (BSA)、0.3% Triton X-100) で希釈。</td></tr><tr><td>マウスIgG</td><td>Sigma</td><td>I5381</td><td>抗体希釈バッファーで希釈する前に、マウス抗ビメンチン抗体と同じストック濃度に希釈します。</td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX35035</td><td>抗体希釈バッファーで希釈する前に、ウサギの抗アルファ-平滑筋アクチン抗体と同じストック濃度に希釈します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗アルファ-平滑筋アクチン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>1/200希釈抗体希釈バッファー中。</td></tr><tr><td>ウサギ抗CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>5% BSA inTBS/Tでの1/50希釈。</td></tr><tr><td>HRP標識ヤギ抗ウサギ抗体</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>TBS/Tの5%BSAで1/3000希釈。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII</td><td>ワージントン</td><td>41512862</td><td>蒸留水で425 U/mLに調整し、ろ過します。</td></tr><tr><td>SYBR green mastermix</td><td>Primerdesign</td><td>PrecisionPLUS-MX-SY</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムアッセイキット</td><td>Randox</td><td>CA590</td><td></td></tr><tr><td>DC タンパク質アッセイキット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>ECL 試薬</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN2109</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>GE ヘルスケア</td><td></td><td></td>10600007</tr><tr><td>PCR ladder</td><td>Bioline</td><td>BIO-33057</td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動用ローディング色素</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター (0.22 &mu;m)</td><td>メルクミリポア</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ科学</td><td>研究所用品株式会社</td><td>MIC3100</td><td></td></tr><tr><td>血球計算計</td><td>マリエンフェルドスーペリア</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Alizarinの赤い画像用にセットアップされたカメラ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ニコンD800</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ニコンAF_sマイクロ、日光105ミリメートル、1:2.8 GED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子10センチメートル、湾曲した端</td><td>世界精密機器</td><td>15915</td><td>オートクレーブ使用前に。</td></tr></tbody></table>

初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

石灰性大動脈弁疾患 (CAVD) は、大動脈弁のリーフレットの進歩的な肥厚が特徴です。一般的高りん血症、高カルシウム血症に苦しむ人腎臓病 (ESRD) 患者、高齢者や終末期に頻繁にある状態です。現時点では、その進行を止めることができます薬物療法がないです。この病理学的プロセスの基になるメカニズムは不明します。大動脈弁尖が弁血管内皮細胞 (VECs) の薄層弁間質細胞 (VICs)、VECs に挟まれたとの大動脈弁尖の外側表面上で構成されます。ラット モデル使用する生体内でphysiopathological 血清リン酸 (Pi) と高りん血症、高カルシウム血症に苦しむ患者のカルシウム (Ca) 濃度に基づく異所性石灰化の生体外で研究。記述されていたプロトコル ヴィック マーカーの式で示すように、純粋なラット ビクトリア州人口の分離の詳細: α-平滑筋アクチン (α SMA) ビメンチンと組織成長因子 β (TGFβ) 1、2 と分化 (CD) 31、VEC のクラスターがない場合マーカー。これらの VICs を展開して研究し、CAVD を支える重要な仲介物質を解明する生化学的、遺伝子およびイメージングの研究を実行できます。

このプロトコルの目的は、初代ラット VICs の分離を記述し、石灰化の in vitro実験のためそれらの文化でした。上記の方法を採用し、ラット VICs できます正常に分離して、CAVD 機構の研究のために拡張します。
ラット一次 VICs を共同設立ヴィック マーカーとローカライズします。
ヴィックのマーカーの調査によって蛍光抗体法を通じて単離細胞のヴィックの表現型を確認した: ビメンチンと α SMA (赤と緑、それぞれ、図 1 a)、以前レポート11,12と一致しています。図 1 bは、非共役のマウスおよびウサギ IgG による代表的なネガティブ コントロールを示しています。さらに、PCR を用いた (図 1) ヴィック成長調整剤 TGFβ 1 TGFβ 2 の発現が確認されました。ラット摘出主 VICs 内皮細胞汚染から解放されたラットを確認する西部のしみの分析を行ったことを確認するために VICs が陰性で血管内皮細胞マーカー、CD31、肯定的なコントロール (として犬の僧帽弁 VECs の使用図 1)。
Ca と Pi は、ラット ヴィック石灰化を誘発します。
全身 Ca や Pi 濃度通常 VICs体外の石灰化はドライブします。ラット VICs の石灰化潜在性を認めて、細胞は Ca と Pi の慢性腎不全患者における高カルシウム血症と高りん血症病態を模倣のレベルが上昇にさらされました。アリザリン赤 S 染色 (図 2 a) Ca 沈着と次の HCl (81 倍の溶出 Ca 濃度の比色定量法が定める、2.7 mM Ca/2.5 Pi と VICs の治療による石灰化、p < 0.05 使用学生のt-テスト;図 2 b)。
ヴィックの石灰化に関連する遺伝子発現の変動:
培養血管細胞の石灰化は、異なる分子プロファイルに関連付けられます。本研究では 2.7 mM Ca/2.5 Pi と VICs の治療による骨のマーカーの発現が大幅に増加: Msh ホメオ ボックス 2、 Msx2 (2.04 倍変更;p < 0.01;図 3 a)、アルカリホスファターゼ、 Alpl (1.49 倍変更;p < 0.001;図 3 b) と phosphoethanolamine/phosphocholine ホスファターゼ、 Phospho1 (4.7 倍変更;一方向の分散分析; を使用してp < 0.01図 3)。しかし、骨のマーカー、 Runx2, 石灰化阻害剤 ectonucleotide pyrophasphatase、 Enpp1式は変更されません (図 3 D-E) 残った。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig1.jpg"> 図 1。ヴィックのマーカーの発現します。(A) 蛍光二重染色と α-平滑筋アクチン (α SMA; グリーン) とビメンチン弁間質細胞 (VICs) で表示します。(B) マウスおよびウサギ IgG を使用して否定的なコントロールの代表的なイメージ。核が青色 4', 6-diamidino-2-phenylindole を使用して (DAPI) で染色します。スケールバー = 50 μ m. トランスフォーミング増殖因子 β 1 (TGFβ 1) の存在 (C) と VICs のTGFβ 2 (レーン 1-3) PCR 解析によって示すように。レーン 4、水コントロールです。使用される参照の遺伝子は、 Gapdhだった。(D) 西部のしみの分析 VICs でない式と比較して犬の僧帽弁内皮細胞 (VECs) CD31 の豊かな表情を示します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig2.jpg"> 図 2。石灰化の in vitroラット VICs 。VICs の Ca 沈着治療 2.7 mm Ca/2.5 Pi によって決定される: (A) ワカ アリザリン赤 S はまあ、および (B) 次の塩酸溶出 Ca 濃度の比色定量のセル全体を単分子膜の染色します。学生のt-2 つのデータ グループ間の意義を分析する試験を行った。± S.E.M. を意味するように結果が表示されます *p < 0.5 コントロールと比較して(n = 4)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig3.jpg"> 図 3。ヴィックの石灰化に関連する遺伝子発現変動。(A) Msx2 Alpl(B)、(C) Phospho1、(D) Runx2、骨マーカーの発現の変更フォールドと VICs で (E) Enpp1治療 Ca/2.5 mM の Pi 2.7 mM48 h. mRNA 発現は内因性の参照の遺伝子と比較してフォールドの変更として表示されますGadph.複数のグループ間の意義を分析する対比較を組み込む一般的な線形モデルを用いた一方向の分散分析を行った。± S.E.M. を意味するように結果が表示されます * *p < 0.01;p < 0.001 コントロールと比較して(n = 6)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>弁尖の数</td>
			<td>文化プレート/フラスコ</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 に 9</td>
			<td>12 ウェル プレートでよく 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 に 30</td>
			<td>6 ウェル プレートでよく 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>30 +</td>
			<td>T25</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.初期シードに必要なチラシの数のための一般的なガイドライン。

このプロトコルでは、分離、カルチャ、および石灰化弁のラット由来間質細胞の石灰性大動脈弁疾患 (CAVD) の高い生理生体外モデルをについて説明します。このモデルラットの搾取は、CAVD セルとこの複雑な病理学的プロセスの根底にある分子メカニズムを探る研究を促進します。

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

本プロトコルの全体的な目的は、石灰化大動脈弁疾患のメカニズムを研究するために、ラット弁間質細胞（VICs）を単離することです。この手法は、なぜVICsが石灰化するのか、また、これらの細胞の石灰化を防ぐために何ができるのかといった、弁石灰化分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、アクセスのしやすさと、さらなる研究のために細胞株へと変換できる可能性があることです。サンプルおよび試薬の無菌性を確保するため、すべての解剖は、あらかじめ70% ethanolで消毒した換気フード内で行ってください。解剖器具はオートクレーブで滅菌し、使用直前に器具の先端を70% ethanolが入ったビーカーに浸してください。動物または組織に触れる前に、解剖器具を洗浄バッファーが入ったビーカーに浸してください。本文のプロトコルに従ってラットを安楽死させた後、動物をガラス製解剖板の上に仰臥位で置き、70% ethanolをスプレーして皮膚を消毒します。心臓を摘出するために、解剖用はさみを用いてラットの中央線に4 cmの切開を入れ、腹腔を露出させ、肋骨と肺を慎重に取り除いて心臓を露出させます。鋭いはさみを用いて心臓を摘出します。ラットのすべての肉眼解剖が完了するまで、摘出した心臓を氷冷した洗浄バッファー中に保存します。各心臓を顕微解剖するために、摘出した心臓を洗浄バッファーで満たしたペトリ皿に移します。上行大動脈と大動脈根の周囲にわずかな領域が残るように、スプリング直剪刀を用いて心筋を切り揃えます。同じスプリングストレート鋏を使用し、上行大動脈を左心室に向かって慎重に切開し、大動脈弁尖を露出させます。次に、切開した大動脈を、Hank's Balanced Salt Solutionを満たした新しい滅菌ペトリ皿に移します。大動脈の基部にある、特徴的なU字型をした大動脈弁尖をVannas鋏で切り出します。すべての弁葉を、1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の1 mLの氷冷洗浄バッファーに、すべての解剖が完了するまで保存します。すべての弁葉を回収した後、100gで1分間、4°Cで遠心分離し、洗浄バッファーを除去します。弁内皮細胞（VEC）を除去するため、425 U/mLのCollagenase II 100 µLを用いて、弁葉を37°Cで5分間消化します。200 µLのピペットチップを用いて、穏やかにピペッティングを行い、消化を停止させます。100gで30秒間遠心分離し、弁葉をペレット化します。上清を注意深く除いた後、500 µLの洗浄バッファーで弁葉を洗浄し、再び100gで30秒間遠心分離して細胞をペレット化します。弁尖からVICを回収するには、100 µLのCollagenase IIを用い、37 °Cで1.5〜2時間消化します。次に、200 µLのピペットチップを用いて穏やかにピペッティングし、VICを遊離させます。Collagenase IIを19 mLの培地で希釈し、670gで5分間遠心分離して、VICおよび残存する弁尖の破片をペレット化します。上清を廃棄した後、リーフレットとVICを培養プレートまたはフラスコに移します。37 °C、5% CO2条件下で、コンフルエントになるまで5〜7日間、培養液中でVICを培養し、72時間後に培地を交換します。in vitro石灰化実験用にラット一次VICを調製するには、6ウェルプレートに1ウェルあたり150,000 cellsの密度で細胞を播種します。細胞をコンフルエンシーが90%以上になるまで培養液で維持します。VICを石灰化誘導培地または対照培地で処理し、5% CO2存在下の37°Cでさらに72時間インキュベートします。その後のダウンストリーム解析のために石灰化したラット初代VICを調べるには、石灰化誘導培地または対照培地を除去します。本文のプロトコルに詳述されているラットVICの特性評価を行う前に、未結合のカルシウムイオンおよびリン酸イオンを除去するため、モノレイヤーを洗浄バッファーで洗浄します。ラットVICの石灰化研究では、細胞モノレイヤーを5% Alizarin Red S溶液で染色し、シェーカーで20分間緩やかに揺らします。その後、蒸留水で5分間ずつ3回洗浄します。カルシウム沈着量を定量するには、生化学的カルシウム測定キットを使用します。0.6 M 塩酸を用い、4 °Cで24時間、緩やかに撹拌しながらカルシウムイオンを浸出させます。上清を回収し、製造元の指示に従ってカルシウム測定キットを用いてカルシウム濃度を測定します。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、全細胞タンパク質に対する割合としてカルシウム濃度を算出します。単離した細胞のVIC表現型は、VICマーカーであるvimentinおよびalpha smooth muscle actinに対する免疫蛍光染色により確認しました。さらに、VIC成長調節因子であるtissue growth factor beta-1および2の発現を、PCR解析を用いて確認しました。また、ラットVICが血管内皮細胞マーカーであるCD 31に対して陰性であることを確認するため、イヌ僧帽弁VECを陽性対照としてウェスタンブロット解析を行った。ラットVICを、病的な高カルシウム血症および高リン血症の状態を模倣した高濃度のカルシウムおよびリン酸に曝露させた。VICをカルシウムおよびリン酸で処理したところ、カルシウム沈着に対するアリザリンレッド染色、および塩酸浸出後のカルシウムレベルの比色定量により、石灰化が誘導されることが確認された。VICsをカルシウムおよびリン酸で処理したところ、骨形成マーカーであるMSX2、ALPL、およびPHOSPHO1のmRNA発現が有意に増加しました。この手法に習熟すれば、18個の弁葉の消化時間を除いて1〜2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、解剖および消化中の無菌性を確保することが重要です。このビデオを視聴することで、ラット原代弁尖間質細胞（VIC）の単離方法と、VIC石灰化の背後にあるメカニズムを調査するためにそれらを利用する方法について十分に理解できるはずです。この手順に続き、フローサイトメトリーや顕微鏡解析などの他の手法を行うことで、VICの生理学的特性や挙動を研究することが可能です。この手法が確立されることで、心血管研究分野の研究者が、ラットモデルを用いてヒトの大動脈弁石灰化のメカニズムを探索する道が開かれます。

isolation-characterization-primary-rat-valve-interstitial-cells-new

Research

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