蛍光顕微鏡の人間の脳をホルマリン固定組織で背景の蛍光性の単純な除去

免疫蛍光顕微鏡観察における一般的な問題は、信号を妨害する内因性背景蛍光の存在です。多くの場合、この自家蛍光によって結果の解釈が不可能になることがあります。本プロトコルでは、市販のLEDデスクランプを用いた光退色により、ヒト脳組織サンプルから自家蛍光を除去する方法を実演します。

本手法の主な利点は、有効性を損なうことなく現在の技術に比べて大幅なコスト削減が可能であること、およびサンプルに外来化合物が導入されないことです。開始前に、1倍のトリス緩衝生理食塩水（TBS）および10%アジ化ナトリウムのストックソリューションを準備してください。処理したい標準サイズの顕微鏡スライド3枚につき、スライドチャンバーとして100 mm × 100 mmの正方形ペトリ皿が1枚必要になります。

各スライドチャンバーにつき、1倍TBS 50 mLに10%アジ化ナトリウム 25 mLを加えて、0.5%アジ化ナトリウム含有TBSを50 mL調製します。ランプヘッドが下に収まるように、スライドチャンバーを高くするための足場を作成します。100 mm四方のペトリ皿を使用する場合、同サイズのプラスチック製食品容器を適切な形状に切り出して使用できます。

サンプルの光路を妨げずにスライドチャンバーを確実に持ち上げることができるものであれば、何でも使用可能です。白色蛍光LEDデスクランプを用意し、光源を覆っているディフューザーや不透明なプラスチックを取り除きます。LEDアレイを上向きに配置します。

この目的には、フレキシブルネック付きのランプが推奨されます。スライドチャンバーとスキャフォールドを十分に覆えるサイズのボックスの内側をアルミホイルでライニングし、装置用の反射ドームカバーを作成します。シングルチャンバーの場合は、1mmピペットチップボックスを使用できます。

このビデオでは、ホルマリン固定したヒトFTLD-T眼窩前頭回脳組織に光退色前処理を施しました。組織の調製およびアミノ染色手順は、組織切片の由来、固定方法、および包埋方法によって異なる場合があります。4°Cの低温室、コールドキャビネット、または冷蔵庫内で、ランプをスキャフォールドの下に配置し、サンプルチャンバーをスキャフォールドの上に設置してください。

サンプルチャンバーにアジ化ソーダ含有TBSを50 milliliters充填します。標準的なガラス製顕微鏡スライドに貼付した厚さ10 micrometerの組織切片を、清潔なピンセットを用いてサンプルチャンバー内に浸漬させます。装置を反射ドームで覆い、LEDランプを点灯させます。

サンプルを48時間フォトブリーチングさせます。このインキュベーション時間は、ランプの強度や組織内の自家蛍光物質の量によって異なる場合があります。フォトブリーチングの前処理後、目的の組織およびタンパク質に応じた標準的なプロトコルに従って、スライドの免疫染色を行うことができます。

デモンストレーションのため、Alexa 488およびTexas Redを結合させた二次抗体を用いて、FTLD-T脳組織のリン酸化タウを染色しました。核の対比染色にはDAPIを使用しました。抗原賦活化バッファー500 milliliters、0.025% Triton X-100含有TBS 500 milliliters、1% 牛血清アルブミン（BSA）含有TBS 10 milliliters、およびBSA TBSにヤギ血清を加えたブロッキング溶液 2 millilitersを準備します。

スライドコレクターに入れ、抗原賦活化緩衝液に光退色させたスライドを浸して抗原賦活化を行います。コレクターを90 °Cで30分間加熱します。加熱処理後、コレクターを取り出し、チャンバーを室温で30分間冷却させることが重要です。

スライドをすぐに取り出すと、切片が乾燥してしまいます。一次抗体混合液を製造者の推奨に従って準備します。本例では、anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8抗体をBSA含有TBSで100倍に希釈し、氷上に置いておきました。

切片1枚あたり150 µLの抗体混合液が必要です。切片を30分間冷却した後、スライドを抗原賦活化用容器からTBS Tritonを満たした染色瓶に移します。この溶液中でスライドを緩やかに揺らしながら5分間洗浄します。

TBS Tritonを捨てて新しいものに交換し、この洗浄ステップを2回目として繰り返します。洗浄後、染色瓶からスライドを取り出し、余分なバッファーを吸い取ります。疎水性ペンを使用して、組織の周囲にアウトラインを描きます。

これにより、溶液がスライドから流れ出すのを防ぐことができます。スライドを乾燥させないように注意してください。ブロッキング溶液 200 µL をスライドにピぺッティングして組織をブロッキングし、加湿チャンバーに入れます。

このチャンバーは、濡れたペーパータオルを入れたピペットチップボックス内のスライドラックのような簡単なもので構いません。組織サンプル全体がブロッキング液で覆われていることを確認してください。室温で2時間インキュベートします。

アスピレーターまたはピペットを使用して、ブロッキング溶液を除去します。一次抗体混合液を100～150 µL、スライド上にピペットで滴下します。サンプル全体が抗体溶液で覆われていることを確認し、抗体溶液が不均一に溜まるのを防ぐため、切片を水平な面に保持してください。

加湿チャンバー内で、一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします。翌日、二次抗体混合液を調製します。本例では、goat anti-mouse Alexa 488およびgoat anti-mouse Texas RedをBSA TBSを用いて100倍に希釈しました。

組織切片を回収し、アスピレーターまたはピペットを用いて一次抗体溶液を除去します。前回と同様の方法で、TBS Tritonを満たした染色瓶を用いて、1回5分間、計2回の洗浄を行います。洗浄後、余剰なバッファーを吸い取ります。

二次抗体溶液を100〜150 µLピペットで加え、組織サンプル全体が完全に覆われていることを再度確認します。加湿チャンバー内にて、室温・暗所で2時間インキュベートします。メーカーの推奨事項または段階希釈に従い、TBSを用いて0.1 µg/mLのDAPI対比染料を調製します。

DAPIストック溶液は不溶性がある可能性があるため、十分に混合してください。スライドを回収し、二次抗体混合液を除去します。サンプルを2回洗浄しますが、TBS Tritonの代わりに、通常のTBSを使用してください。

残りの洗浄液を吸引またはピペットで取り除き、100〜150 µLのDAPI染色液を組織切片に滴下します。室温、暗所で10分間インキュベートします。サンプルを回収し、2回ではなく3回、TBSのみで洗浄します。

洗浄後、残った洗浄液を慎重に取り除きます。封入剤を塗布してください。サンプルの上にカバーガラスを被せ、スライドの封入を完了させます。

カバースリップの一端を先に載せ、反対側をピンセットで非常にゆっくりと下ろすことで、気泡の混入を防ぎます。封入剤を乾燥させた後、4°Cの暗所で保存します。これでスライドの観察準備が整いました。

蛍光顕微鏡の設定は、染色のために使用した蛍光色素および顕微鏡によって異なります。蛍光ランプ、顕微鏡、およびコンピューターの電源を入れ、ランプを15分間ウォームアップさせます。染色済みの組織スライドを蛍光顕微鏡にセットします。

明視野を用いて、10倍の倍率で組織の位置を確認します。適切な組織領域が見つかったら、サンプルのカバーガラスの上に水を1滴滴下します。その後、20倍の水浸レンズに切り替えます。

最高の信号を得るために、個別のトラックで各蛍光色素に適したレーザー励起波長および蛍光波長を選択します。設定および使用した波長の詳細は、付随する論文をご参照ください。各トラックの信号強度を最適化するために、レーザー出力とゲイン設定を調整します。

適切な設定と視野が決定したら、各トラックの蛍光データを含む合成画像を保存します。各チャンネルの蛍光強度を可視化するために、ImageJ用のRGB Profile Toolsマクロをインストールしてください。ImageJでlsm共焦点画像ファイルを開き、[Image]、[Color]、[Channel Tool]の順に進むことで、3つのスタックからなる合成画像をRGBに変換します。

Compositeを選択し、3つのチャンネルすべてにチェックを入れます。次に、ImageからTypeを選択し、RGB Colorを指定します。RGB Profile Toolsアイコンを選択し、プロファイルを作成したい画像上の領域にわたって線を引きます。

このビデオでは、背景蛍光を抑制するために組織サンプルの光退色前処理を行う手順について説明します。この手順は、抗原賦活化および免疫染色の前段階として、あらゆる標準的な免疫蛍光プロトコルに追加することが可能です。光退色に使用される装置は安価で入手しやすく、市販のコンポーネントで構成されています。

白色蛍光LEDは広範な波長のスペクトルで光を放出するため、広範囲のフォトブリーチング（光褪色）に非常に適しています。入手容易なLEDデスクランプを用い、染色していないヒトFTLD-T脳組織サンプルを、Texas RedおよびAlexa 488で染色した場合に適した波長でフォトブリーチングし、撮像しました。未処理のサンプルでは、大量の自家蛍光が認められました。

対照的に、光退色によって、リポフスチンに類似した自家蛍光スペックルおよび全般的な背景蛍光の強度が著しく減少しました。本手法をさらに検証するため、FTLD-Tの脳組織検体を用いて、この疾患において異常に折り畳まれ、明確な封入体として蓄積するタンパク質である過リン酸化tauの染色を行いました。tauのラベル化と非特異的な蛍光をより明確に区別するため、2種類の異なる二次抗体を使用しました。

これらの合成画像において、Alexa 488とTexas Redの共局在は黄色で示されており、これは正しく染色されたtauタンパク質を表しています。赤色または緑色の領域が現れている場合は、非特異的な蛍光か、あるいはいずれかの発色団の消光を示しています。未処理のコントロールサンプルでは、特にTexas Redチャネルにおいて、顕著なバックグラウンドおよび非特異的なシグナルが見られます。

光退色前処理と化学的クエンチャーの適用のいずれにおいても、バックグラウンド信号の著しい低減が見られます。蛍光チャンネルを分離し、より高倍率で画像を確認することで、より詳細な観察が可能です。未処理のコントロールでは、すべてのチャンネルでバックグラウンド蛍光が認められるほか、主にTexas Redチャンネルにおいて、tau特異的標識と同程度の強度を持つ非特異的な特徴が認められます。

もしtau封入体に明確で予測可能な形態がなかった場合、これらの自家蛍光特性の存在により、Texas Redの結果を誤認した可能性があります。フォトブリーチングの前処理を行うことで、tau特異的なTexas RedおよびAlexa 488シグナルの大部分を維持しつつ、これらのTexas Red非特異的な特性を完全に消失させることができます。しかしながら、フォトブリーチングはDAPIの背景蛍光にはほとんど影響を及ぼさないと考えられます。

化学的クエンチャーは、フォトブリーチングと同等に効果的に Alexa 488 チャネルの背景蛍光を減少させました。しかし、DAPI と Texas Red の両方の蛍光強度も低下させており、一部に逆効果なクエンチングが存在することが示唆されました。これらの影響の定量的な結果は、シグナルプロファイルで確認できます。

ご覧のように、この方法により、混同を招く特徴のないクリアな画像が得られます。このフォトブリーチング前処理を標準的なアミノ蛍光プロトコルに組み込むことで、自家蛍光を除去し、高品質で曖昧さのない結果を得ることができます。