蛍光顕微鏡の人間の脳をホルマリン固定組織で背景の蛍光性の単純な除去

免疫蛍光顕微鏡の一般的な問題は、シグナルに干渉する可能性のある内因性のバックグラウンド蛍光の存在です。多くの場合、この自家蛍光により、結果が解釈不能になる可能性があります。このプロトコルでは、市販のLEDデスクランプによる光退色を使用して、ヒトの脳組織サンプルから自家蛍光を除去する方法を示します。

この方法の主な利点は、有効性を犠牲にすることなく、現在の技術に比べて大幅なコスト削減が可能であることと、外因性化合物がサンプルに導入されないことです。始める前に、トリスバッファー生理食塩水、TBS、および10%アジ化ナトリウムの1倍のストック溶液を準備します。処理する標準サイズの顕微鏡スライド3枚につき、スライドチャンバーとして100mm×100mm四方のシャーレが1枚必要になります。

各スライド チャンバーごとに、TBS の 1 倍 50 ミリリットルに 10% アジ化ナトリウム 25 ミリリットルを加えて、TBS 中の 05% アジド 50 ミリリットルを準備します。足場を作成して、スライド チャンバーを持ち上げ、ランプ ヘッドが下に収まるようにします。100mm四方のシャーレの場合、同サイズのプラスチック製の食品容器を形にカットできます。

光がサンプルに到達するのを妨げずにスライドチャンバーを確実に持ち上げることができるものなら何でも使用できます。白色蛍光体LEDデスクランプを入手し、光源を覆っているディフューザーまたは不透明なプラスチックをすべて取り外します。LEDアレイを上向きにします。

この目的のために、柔軟なネックを備えたランプが推奨されます。スライドチャンバーと足場をアルミホイルで覆うのに十分な大きさのボックスの内側を照らすことにより、装置用の反射ドームカバーを構築します。シングルチャンバーの場合、1mmのピペットチップボックスを使用できます。

このビデオでは、ホルマリン固定されたヒトFTLD-T眼窩前頭回脳組織に光退色前処理を施しました。組織調製およびアミノ染色の手順は、組織切片のソース、固定、および包埋によって異なる場合があります。摂氏4度の冷蔵室、冷蔵キャビネット、または冷蔵庫で、ランプを足場の下に置き、サンプルチャンバーを足場の上に置きます。

サンプルチャンバーに50ミリリットルのアジドTBSを充填し、標準的なガラス顕微鏡スライドに取り付けられた厚さ10マイクロメートルの組織切片をきれいな鉗子を使用してサンプルチャンバーに浸します。装置を反射ドームで覆い、LEDランプをオンにします。

サンプルを48時間光漂白します。このインキュベーション時間は、ランプの強度や組織中の自己蛍光物質の量によって異なります。光退色前処理後、スライドは、目的の特定の組織およびタンパク質に対する標準プロトコルで免疫染色できます。

デモンストレーションのために、Alexa 488およびTexas Redに結合した二次抗体を用いて、FTLD-T脳組織をリン酸化タウについて染色しました。DAPIは核対比染色として使用されました。500ミリリットルの抗原賦活化緩衝液、500ミリリットルの0.025%Triton X-100をTBSに、10ミリリットルの1%ウシ血清アルブミン、BSAをTBSに、および2ミリリットルのブロッキング溶液を調製します、BSA TBSにヤギ血清を添加します。

光退色させたスライドをスライドコレクター内の抗原賦活化バッファーに沈めることにより、抗原賦活化を行います。コレクターを摂氏90度で30分間加熱します。コレクターを熱処理から取り外したら、チャンバーを室温で30分間冷却することが重要です。

スライドをすぐに取り外すと、セクションが乾燥します。一次抗体混合物は、メーカーの推奨に従って調製してください。この場合、抗リン酸化PHFタウp-セリン202とスレオニン205 AT8抗体をBSA TBSで100分の1に希釈し、氷上に放置しました。

1セクションあたり150マイクロリットルの抗体混合物が必要です。切片を30分間冷却した後、抗原賦活化コレクターからスライドをTBS Tritonで満たされた染色ジャーに移します。スライドをこの溶液で5分間、穏やかに振って洗います。

TBS Tritonを空にして交換し、この洗浄手順をもう一度繰り返します。洗浄後、スライドを染色ジャーから取り出し、余分なバッファーを吸い取ります。疎水性ペンを使用して、組織の周りに輪郭を描きます。

これにより、ソリューションがスライドから外れるのを防ぐことができます。滑り台が乾かないように注意してください。200マイクロリットルのブロッキング溶液をスライドにピペッティングして組織をブロックし、加湿チャンバー内に置きます。

このチャンバーは、濡れたペーパータオルが入ったピペットチップボックスの内側のスライドラックのような単純なものでもかまいません。組織サンプル全体がブロッキング溶液で覆われていることを確認してください。室温で2時間インキュベートします。

吸引器またはピペットで詰まった溶液を取り除きます。100〜150マイクロリットルの一次抗体混合物をスライドにピペットで移します。抗体の不均一な溜まりを避けるために、サンプル全体が抗体溶液で覆われ、切片が平らな面に保

一次抗体と4°Cで加湿チャンバー内で一晩インキュベートします。翌日、二次抗体混合物を調製します。この場合、ヤギのマウス対策のAlexa 488とウサギのマウス対策のTexas RedをBSA TBSを使用して100分の1に希釈しました。

組織切片を取り出し、吸引器またはピペットで一次抗体溶液を除去します。TBS Tritonを充填した染色ジャーを使用して、前回と同様の方法でスライドを2回洗浄し、各洗浄で5分間洗浄します。洗浄後、余分なバッファーを吸い取ります。

100〜150マイクロリットルの二次抗体溶液をピペットで取り出し、組織サンプルが完全に覆われていることを再度確認します。暗所の加湿チャンバー内で室温で2時間インキュベートします。TBS中に0.1マイクログラム/ミリリットルのDAPI対比染色を、メーカーの推奨または段階希釈に従って調製します。

DAPIストック溶液は不溶性があるため、必ず十分に混合してください。スライドを取り出し、二次抗体混合物を取り出します。サンプルを2回洗浄しますが、TBSトリトンを使用する代わりに、プレーンなTBSを使用します。

残りの洗浄液を吸引またはピペットで取り除き、100〜150マイクロリットルのDAPI染色を組織切片にピペットで移します。暗所で室温で10分間インキュベートします。サンプルを取り出し、プレーンTBSで2回ではなく3回洗浄します。

洗浄後、残った洗浄液を慎重に取り除いてください。封入剤を塗布します。サンプルをガラスカバースリップで覆ってスライドの取り付けを完了します。

カバーの一方の端を滑り落ちさせ、鉗子を使用して反対側の端を非常にゆっくりと下げることで、気泡を避けます。封入剤を乾燥させてから、暗所で摂氏4度で保管してください。これで、スライドを視覚化する準備が整いました。

蛍光顕微鏡の設定は、染色に使用する蛍光色素と顕微鏡によって異なります。蛍光ランプ、顕微鏡、コンピューターの電源を入れ、ランプを15分間ウォームアップします。染色した組織スライドを蛍光顕微鏡に置きます。

明視野を使用して、10倍の倍率で組織を見つけます。組織の適切な領域が見つかったら、サンプルのカバースリップの上に水滴を追加します。20倍水浸レンズに交換します。

最適なシグナルを得るために、各蛍光色素に適したレーザー励起波長と発光波長を別々のトラックで選択してください。使用される設定と波長の詳細については、添付の原稿を参照してください。レーザー出力とゲインの設定を調整して、各トラックの信号強度を最適化します。

適切な設定と視野が見つかったら、各トラックの蛍光データを含む合成画像を保存します。各チャンネルの蛍光強度を可視化するには、ImageJ の RGB プロファイルツールマクロをインストールします。ImageJでlsm共焦点画像ファイルを開き、Image、Color、Channel Toolに移動して、3つのスタックから合成画像をRGBに変換します。

[コンポジット] を選択し、3 つのチャネルすべてをオンにします。次に、[画像]、[タイプ]、および[RGBカラー]に移動します。[RGB プロファイル ツール] アイコンを選択し、プロファイルする画像内のセクションに線

このビデオでは、組織サンプルの光退色前処理を行い、バックグラウンド蛍光を生成する手順について説明しました。この手順は、抗原賦活化およびアミノ染色の前に、任意の標準的なアミノ蛍光プロトコールに追加することができます。光退色に使用される装置は、既製のコンポーネントで構成されており、安価で容易に入手できます。

白色蛍光体LEDは、広範囲の波長にわたって光を放射するため、広範囲の光退色に非常に適しています。すぐに利用できるLEDデスクランプを使用して、未染色のヒトFTLD-T脳組織サンプルを光退色し、これらのサンプルをTexas RedおよびAlexa 488で染色した場合に適した波長でイメージングしました。未処理のサンプルは、大量の自家蛍光を示しました。

対照的に、光退色は、リポフスチンに似た自家蛍光スペックルの強度、および一般的なバックグラウンド蛍光の強度を有意に減少させました。この技術をさらに検証するために、FTLD-T脳組織サンプルを、この疾患で異なる封入体として誤って折り畳まれて蓄積するタンパク質である過剰リン酸化タウについて染色しました。タウ標識と非特異的蛍光をよりよく区別するために、2つの異なる二次抗体を適用しました。

これらの合成画像では、Alexa 488とTexas Redの共局在が黄色で示されており、これは正しく染色されたタウタンパク質を表しています。赤または緑の領域の出現は、非特異的な蛍光または発色団の1つの消光を示しています。未処理のコントロールサンプルでは、特にテキサスレッドチャネルで、有意なバックグラウンドシグナルと非特異的シグナルが見られます。

光退色前処理と化学クエンチャーの適用の両方により、バックグラウンドシグナルが大幅に減少します。蛍光チャンネルを分割して、より高い倍率で画像を見ると、より詳細な観察が可能になります。未処理のコントロールは、すべてのチャネルにわたってバックグラウンド蛍光を有し、主にテキサスレッドチャネルにおいて、タウ特異的標識と同様の強度を持つ非特異的な特徴を有しています。

タウ包在体が明確で予測可能な形態を持っていなかった場合、これらのテキサスレッドの結果は、これらの自己蛍光特性の存在により誤って解釈された可能性があります。光退色前処理は、これらのテキサスレッドの非特異的な特徴を完全に排除する一方で、タウ特異的なテキサスレッドおよびアレクサ488シグナルの大部分を保持します。しかし、光退色はDAPIバックグラウンド蛍光にほとんど影響を与えないようです。

ケミカルクエンチャーは、Alexa 488チャンネルのバックグラウンド蛍光を光退色と同じくらい効果的に低減しました。しかし、DAPIとTexas Redの両方の蛍光強度も低下し、逆効果のクエンチングが存在することが示唆されました。これらの影響の定量化は、信号プロファイルで見ることができます。

ご覧のとおり、この方法では、交絡する特徴のないクリーンな画像が生成されます。この光退色前処理は、任意の標準的なアミノ蛍光プロトコルに組み込むことができ、自家蛍光を除去し、高品質で明確な結果を得ることができます。