Name: 蛍光顕微鏡の人間の脳をホルマリン固定組織で背景の蛍光性の単純な除去 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: 学ぶ ホルマリン固定人間脳組織における蛍光顕微鏡の背景蛍光除去法。LEDデスクラインプを用いた光漂白により、コストを抑えつつ自己蛍光を効果的に除去し、免疫蛍光染色の結果解釈を改善する。

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この研究では、カナダのコンソーシアムの神経変性、加齢 (CCNA)、カナダの研究所の健康研究 (機構)、カナダ (ALS)、ALS 協会・ アルツハイマー協会カナダ (ASC) の全体または一部を支えられました。著者はスルタン Darvesh と海上脳組織銀行から FTLD の脳組織を提供するため時空をターゲットと増幅の放射線応答 (STTARR) プログラムおよび関連会社からミラノ グリー Andrew Reid を感謝したいです。埋め込み、区分のサービス、および、高度な光学顕微鏡施設 (AOMF) 顕微鏡の楽器を提供するための組織のための機関の資金調達。ケビン ハドリーは原稿の批判的検討の感謝の意を。

注: 国際会議の調和 (ICH) の国際組織の医療科学 (協議) 協議会を含む国際規格に準拠しての作品発表を行った、およびヘルシンキ宣言の原則。ヒト組織大学健康ネットワーク研究倫理委員会の承認を得ていた。人間の脳は海上の脳組織銀行の一部として採取。コレクションの時に、全ての患者からインフォームド コンセントを得た。
 1 です。 のフォトブリーチング装置ソリューション <ol><li>準備在庫ソリューション。
	<ol><li>X 8.77 g 塩化ナトリウムとトリスの 6.06 g を溶解することにより在庫トリス緩衝生理食塩水 (1 x TBS) ソリューション (150 mM NaCl、50 mM トリス-Cl、pH 7.4) 1 の準備 1 L ddH 2 O の 800 mL でベースし、7.4 塩酸ボリューム 1 L とオートクレーブを育てることを使用するために pH を調整します </。li > <li>ddH 2 O (10%、200 x の在庫) 10 mL におけるアジ化ナトリウムの 1 g を溶解することによりアジ化ナトリウム 10% (200 x の在庫) を準備します</li>。
	</ol></li> <li>1-3 標準サイズのスライド、スライド室としてシングル 100 × 100 mm の透明な正方形のシャーレを使用します。単一のスライド室 0.05% アジ化 TBS ソリューションにするため 1 x TBS 50 mL に 200 x ナトリウムのアジ化物の在庫の 0.25 mL を追加します。垂直方向に追加のスライドを処理する 2-3 スライド室をスタックします。各商工会議所のアジ化 TBS ソリューションの追加の 50 mL を準備します</li>。
	<li>は、ランプの頭の下に合うことができるようにスライド chamber(s) を昇格する足場を作成します。
	<ol><li>のための 100 mm x 100 mm スライド室は底と 100 mm x 100 mm x 30 mm プラスチック製食品容器の側面の開口部をカットし、コンテナーを反転します。側の開口部が大きいので、LED 光源を合わせて、下部開口部は、光源からの光は支障なく試料室に達するよう十分な大きさを確保することを確認します</li>。
		<li>は、足場足場とサンプル室/卓上型のグリップを高めるために電気テープを適用します。それは安全にサンプルに達することからのライトを妨げることがなくスライド室を高めますので足場を構築する任意の代替材料を使用します</li>。
	</ol></li> <li>デスク ランプからサンプルを (可能な場合) に直接 LED ライトを妨げることがありますし、上方の LED 配列の向きからディフューザーや不透明なプラスチックを削除します。LED アレイ上の足場とスライド chamber(s) を配置します。簡単な操作で柔軟な首とランプを使用します</li>。
	<li>構造反射ドームをスライド室とアルミ箔で足場をカバーするのに十分な大きさのボックスの内側をライニングによって装置のカバーします。単室の 150 mm × 150 mm x 複数の 150 mm 段ボール箱 1 mL ピペット チップ ボックスを使用して、垂直方向にチャンバーを積み上げ</li>。
</ol> 2。ティッシュ セクションのフォトブリーチング前処理 注: ティッシュ セクションの準備組織、固定および使用する方法を埋め込むのソースによって異なる場合があります。ここでは、FTLD T のケースから脳組織 (眼窩脳) は ~ 2 日間ホルマリン、ショ糖密度勾配を 10 月に埋め込まれ、クライオスタットを使用して 10 の μ m 厚いセクション カットで修正しました。
<ol><li>では 4 ° C の冷たい部屋、冷たいキャビネットや冷蔵庫、足場の下でランプの向きし、足場に試料室を配置します。試料室にアジ化 TBS 溶液 50 mL を注ぐ</li>。
	<li>埋没ティッシュ セクションはきれいな鉗子を使用してアジ化 TBS を含むスライド室に標準的なガラス顕微鏡スライドにマウントされています。複数のスライドのスライドが単一のレイヤー上商工会議所で置かれることを確認します</li>。
	<li>反射型のドームを持つ装置をカバー、LED ランプを点灯、4 ° C で 48 時間インキュベートします</li>。
</ol> 3。蛍光 <ol><li>染色 DAPI 対比染色とアレクサ 488 - とテキサス赤共役二次抗体を使用してリン酸化タウの組織、最初の抗原検索、透過、妨害、およびプライマリのソリューションを準備するには抗体の結合。
	<ol><li>準備 500 mL の抗原検索のバッファー (10 mM クエン酸、2 mM エチレンジアミン四酢酸、0.05% Tween 20; pH 6.2) 0.92 g クエン酸と ddH 2 O. 調整 pH の 500 mL のエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 0.37 g 溶解NaOH で 6.2 に Tween 20 0.25 mL を追加します</li>。
		<li>500 ml 0.025% のトリトン X-100 の 0.125 mL を 500 mL の 1 に追加することによって TBS ソリューション (TBS-トリトン) でトリトン X-100 TBS. x</li>
		<li>0.1 g 10 mL TBS. に BSA を溶解することにより TBS (BSA TBS バッファー) の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションの準備</li>
		<li>1.8 mL の 1% にヤギ血清 0.2 mL を追加してブロッキング溶液を調製 BSA/TBS.</li>
		<li>抗リン-PHF タウ pSer202 + Thr205 の 1.5 μ L 分注による一次抗体溶液 (1: 100 希釈) 150 μ L を準備、スライドごとに 1% BSA TBS バッファーし、氷をつけっぱなしの 148.5 μ L に (AT8) 抗体</li>
	</ol></li> <li>25 mL の抗原検索バッファーを含むスライド コレクターの垂直 photobleached のスライドが水没抗原検索を実行します。コレクターが風呂の水に落ちないようにテープや文字列が付いているコレクターを保護します。30 分 90 ° C の水浴のコレクターを熱し、スライドを削除する前に 30 分間室温に冷却するコレクターを許可します。それとしてすぐにスライドになります乾燥するセクションは削除されません</li>。
	<li>30 ml TBS トリトンの染色瓶に抗原検索コレクターからスライドをコピーして穏やかな揺れで軌道シェーカー上で 5 分間セクションを洗います。新鮮な TBS トリトンで一度洗浄を繰り返します。芯糸くず組織概要疎水性ペンで組織と離れて余分なバッファー。スライドを乾燥しないように注意してください。
	<ol><li>スライドごとに、組織にソリューションをブロックの 200 μ L 分注により、組織をブロックし、加湿チャンバー内でスライドを配置。湿らせたペーパー タオルを含むピペット チップ ボックスの内側スライド ラックを置くことによって部屋を構築します。レベルの表面上で 2 時間室温で孵化させなさい。ブロッキング液が組織を完全にカバーすることを確認します</li>。
	</ol></li> <li>吸引によりブロックのソリューションを削除し、組織に一次抗体溶液の 100-150 μ L をピペットします。十分な量の抗体が存在し、セクションは 1 つの側面に抗体溶液のプールを避けるために平らな面を確認します。加湿チャンバーで一晩 4 ° C でインキュベートします</li>。
	<li>は、二次抗体の混合物と、DAPI ーシスを準備します。
	<ol><li>、スライドごとにヤギ抗マウス アレクサ 488 の 1.5 μ L とヤギ抗マウス BSA TBS の 147 μ L にテキサス赤の 1.5 μ L を追加することによって二次抗体の混合物 (1: 100 希釈) の 150 μ L を準備し氷のまま</li>
		<li>準備 0.1 μ g/mL DAPI シリアル希釈による対比染色。徹底的に原液を混合し、ストック 5 mg/mL 5 μ g/mL の溶液の 1 mL をする TBS の 999 の DAPI の 1 μ L を希釈します。スライドごとに希釈 3 μ5 μ g/mL の溶液を最終濃度 0.1 μ G/ml の TBS の 147 μ L で L. 
		注意: DAPI 既知変異原物質は、注意して処理する必要があります</li>。
	</ol></li> <li>吸引により一次抗体を削除します。TBS トリトンの軌道シェーカーで穏やかな混合で 5 分間洗浄 30 mL を含む jar を染色、ガラスのスライドが水没します。新鮮な TBS トリトン洗浄手順を繰り返します。離れて余分な TBS トリトンを芯し、各スライドに二次抗体の混合物の 100 に 150 μ L をピペットします。
	<ol><li>組織は抗体の混合物で完全に覆われていることを確認します。暗闇の中で加湿チャンバーに室温で 2 時間インキュベートします</li>。
	</ol></li> <li>吸引により二次抗体の混合物を削除し、TBS (トリトン) 30 mL を含む jar を染色グラスにスライドを転送します。軌道シェーカーで穏やかな混合 5 分間洗ってください。繰り返し新鮮な TBS と洗浄ステップは 0.1 μ g/mL DAPI 対比染色の 100 に 150 μ L を各スライドに適用し、暗闇の中で室温で 10 分間インキュベートします</li>。
	<li>は TBS を含む jar を染色ガラス スライドを転送し、各洗浄のため新鮮な TBS を使用して 5 分ごとに、穏やかな混合で 3 回を洗います。芯の距離余分なバッファーします</li>。
	<li>水土台媒体組織への適用の 3 が値下がりしました。鉗子を使用すると、組織は、1 つの端から始まると気泡の捕捉を避けるためにもう一方の端をゆっくりと下げる上にきれいなガラス基板をゆっくりと下ろします。場合はすぐにイメージング、coverslip が外れないように注意してください。それ以外の場合、暗闇の中で 4 ° C で保存する前に乾燥するメディアをマウントを許可します</li>。
</ol> 4。蛍光顕微鏡 <ol>蛍光ランプ、顕微鏡とコンピューターで <li>ターン ランプ 15 分染色組織スライド蛍光顕微鏡ステージの場所間のウォーム アップをし。10 倍の倍率の組織を検索する明視野画像を使用します</li>。
	<li>DdH 2 O のドロップを coverslip 表面に適用し、20 x 水浸対物レンズ (NA = 1.0)。設定 4 直線の平均平面スキャンを選択します。ピンホール サイズを与える 〜 3 μ m の光学的スライス 1 の風通しの良いユニットに設定します。最高の信号を別々 のトラックで各 fluorophore レーザー励起発光波長を選択します 。
	注: Alexa 488: ex λ = 488 nm (アルゴン レーザー) λ em = 493 570 nm;テキサスの赤: λ ex = 561 nm (DPSS 561 nm レーザー)、λ em = 601 635 nm;DAPI: λ ex = 405 nm (405 ダイオード レーザー)、λ em = 410 507 nm。
	<ol><li>は、レーザー パワーを調整し、各トラックの信号強度を最適化する設定を得る。合成画像を収集し、保存します。同じレーザー設定を使用して、別のスライドで蛍光強度を比較します</li>。
	</ol></li> <li>各チャネルにおける蛍光強度の可視化は、ImageJ 10 RGB プロファイル ツール マクロをインストールします。Web ページからテキスト ファイル (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) としてマクロを保存します。ImageJ メニューから選択プラグイン - &#62; マクロ - &#62; インストール;RGB プロファイル ツールをインストールするテキスト ファイルを選択します。
	<ol><li>ImageJ のコンフォーカル画像ファイルを開き、次を実行することによって RGB 3 スタックから合成画像に変換: 画像 - &#62; の色 - &#62; チャンネル ツール。選択 &#34; 複合 &#34; 3 つのチャネルすべてのドロップ ダウン メニューとチェックから。次に、イメージを選択 &#62; タイプ - &#62; RGB 色</li>。
		<li>は、RGB プロファイル ツール アイコンを選択し、プロファイルするイメージのセクションの間で線を引きます。強度データをプロットするためのスプレッドシートとして保存します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li>
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<li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia%3A+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li>
<li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticobasal+degeneration%3A+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿に記載されている組織のフォトブリーチング前処理は、既製のコンポーネントを使用して蛍光の効果的な除去が可能です。プロトコルでは、アレクサ 488 とテキサス赤、核の対比染色として DAPI の二次抗体を使用して人間の脳をホルマリン固定組織におけるリン酸化タウ凝集体の蛍光イメージングについて説明します。メソッドを適用すると、他の組織に、開始点としてサンプルに 48 h フォトブリーチング前処理を実行することをお勧めします。退色、製造元の推奨事項に従う抗体の希薄を使用して興味の機能のためのプロトコルを汚す標準蛍光を実行します。背景の蛍光性がまだ存在する場合退色時間や手順を汚す抗体を変更する必要があります。退色の期間、装置やサンプルの蛍光のレベルを構築する選択ランプによって異なります。それぞれのユニークなランプ装置に最適の漂白時間を決定する必要があります。これは無染色、coverslipped 組織切片 TBS アジにマウントされ、蛍光顕微鏡を用いた 12 時間間隔でスライドの内因性蛍光測定退色によって行うことができます。以前のレポートで粒子解析によるリポフスチン退色を監視、指数関数的減衰をカーブフィッティング関数<sup class='x...

ターゲット特定の蛋白質の抗体を使用して蛍光顕微鏡は細胞培養や組織に興味の蛋白質を視覚化する使用します。蛍光抗体法で明確かつ決定的な画像の取得に主要な合併症が引き起こされること内生的哺乳類体内年齢色素リポフスチン、エラスチンとコラーゲン1のような蛋白質、蛍光 2。蛍光の他の源をアルデヒド固定3などのサンプル準備の手順を導入できます。主に酸化修飾タンパク質と脂質分解残基から成るリポフスチン顆粒は加齢2長い生きている細胞に蓄積されます。これにより脳や心臓や骨格筋などの後組織イメージングの難しさ、リポフスチンの蛍光発光スペクトルが広い、変数、頻繁に使用される一般的な fluorophores の発光波長に合わせ、4をラベリングします。これらの要因は、特に挑戦的な前頭側頭葉変性症 (FTLD) など晩発性神経変性疾患の例から人間の脳組織のイメージングを作る。
蛍光を減らすためには、我々 は、白色発光ダイオード (LED) 配列家庭用デスク ランプ5を使用するとスライド マウントの切片を照射法を考案しました。この単純なテクニックは、酢酸アンモニウムまたはスーダン黒い B やエリオクロム ブラック T6などの染料を焼入れ市販 CuSO4など化学の消す物を使用する方法に代わるものを提供します。大幅なコスト削減にマルチ スペクトルがあります LED ランプ フォトブリーチング法と合併症や工芸品デジタル蛍光除去方法スペクトル非混合7,8などから生成を回避できます。白色蛍光体 Led ある、広い発光スペクトル、高輝度と低製造コスト、退色様々 な発色団5,9の既製のコンポーネントとして最適です。
このプロトコルでは、アクセス可能なコンポーネントを使用して退色装置の建設を示すし、退色をタウ陽性介在物 (FTLD T) リン酸化タウの特異抗体を使用してを含む FTLD 組織の場合に適用します。2 つの一般的に使用される発色団を用いる蛍光標識抗体をイメージングに退色の影響を示す: アレクサ 488 とテキサス赤。未処理のセクション対退色の影響または商業化学クェンチャーの治療を受けた人は定量化し、比較します。この退色前処理は、生体試料の蛍光を削除する任意の標準的な蛍光汚損のプロトコルに組み込むことができます。

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム クロロライド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>カレドン ラボラトリー 化学薬品</td><td>1506656</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>バイオショップ カナダ</td><td>SAZ001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 100 mm x 20 mm ピトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.9923.422</td><td>フォトブリーチャーのすべてのコンポーネントは、可用性に基づいて置き換えることができます</td></tr><tr><td>6 W LED調光可能なデスクランプ</td><td>DBPower</td><td>DS501</td><td>フォトブリーチャーのすべてのコンポーネントは、可用性に基づいて置き換えることができます</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C-2404</td><td></td></tr>エ<tr><td>チレンジアミン四酢酸&nbsp;(EDTA)</td><td>BioShop Canada</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>BioShop</td><td>Canada</td><td>SHY700.1</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Haake Fisons</td><td>K15</td><td></td></tr><tr><td>スライドコレクター</td><td>FisherScientific</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Staining Jar</td><td>FisherScientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ベルコグラス</td><td>&nbsp;7744-08115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7878</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>FisherScientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Aurion</td><td>905.002</td><td></td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Tau (Ser202, Thr205) モノクローナル抗体 (AT8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス二次抗体, Texas Red-X</td><td>ThermoFisher</td><td>T862</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>封入媒体</td><td>ThermoScientific</td><td>28-600-42</td><td></td></tr><tr><td>ガラススオーバースリップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア ZEN 2012 ブラックエディション 11.0</td><td>ツァイス</td><td>LSM710</td><td>ソフトウェアは、共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>RGB プロファイルツール マクロ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td></tr><tr><td>商業化学クエンチャー</td>に付属<td>バイオタム</td><td>23007</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡の人間の脳をホルマリン固定組織で背景の蛍光性の単純な除去

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

蛍光は細胞内コンパートメントを可視化する組織サンプル中の特定の蛋白質の局在を決定するために使用する一般的な方法です。高品質の蛍光画像の取得に大きな障害は老化色素リポフスチンなどによって生じたアルデヒド固定などの一般的なサンプル準備プロセスによって組織の内因性蛍光。このプロトコルでは、どのように背景の蛍光性が大幅蛍光プローブと白色蛍光体発光ダイオード (LED) 治療前に配列を使用して退色を軽減できますをについて説明します。白色蛍光体の広域スペクトル発光 Led の放出ピークの範囲にわたって fluorophores の漂白を可能にします。非常に低コストで既製のコンポーネントから構築することができますのフォトブリーチング装置および市販化学消す物にアクセス可能な代替手段を提供しています。従来の蛍光染色に続いて組織の退色の前処理は、バック グラウンド蛍光の無料画像を生成します。に比べてプローブとしてバック グラウンドを低減する化学の消す物を確立する信号をそれは効果的に背景とリポフスチンの蛍光を軽減しながら退色処理いたプローブの蛍光強度に及ぼす影響。退色には、前処理のためのより多くの時間が必要ですが、退色時間を短縮する高輝度 LED アレイが使えます。この簡単な方法は、さまざまな組織、脳などのリポフスチンの蓄積後特に組織や心臓や骨格筋に潜在的適用できます。

フォトブリーチング用前処理ステップは、直前の抗原検索や免疫染色 (図 1 a) 標準的な蛍光プロトコルに追加できます。フォトブリーチング用装置の組立は、様々 なを使って行うこともできる安価な既製のコンポーネント (図 1 b)。白色蛍光体の発光スペクトル Led は以前レポート (図 1)5,11に同意させる幅広い退色に適した波長の広い範囲をカバーしています。48 h 退色後リポフスチンとして一般的な背景の蛍光性のようにされるスペックルの強度は無染色で FTLD T (図 1) の両方の発光波長でかなり減少しました。フォトブリーチング効果を発揮で 2 つの異なる二次抗体を使って、FTLD-T の場合病的タウ介在物を視覚化...

生体試料のバック グラウンド蛍光はしばしば高齢の人間後組織を中心に、蛍光イメージング技術を複雑にします。このプロトコルは、これらのサンプルから蛍光ことができる効果的に削除する方法について説明します photobleach 免疫染色の前にサンプル ソース市販発光ダイオード光を使用します。

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

免疫蛍光顕微鏡観察における一般的な問題は、信号を妨害する内因性背景蛍光の存在です。多くの場合、この自家蛍光によって結果の解釈が不可能になることがあります。本プロトコルでは、市販のLEDデスクランプを用いた光退色により、ヒト脳組織サンプルから自家蛍光を除去する方法を実演します。本手法の主な利点は、有効性を損なうことなく現在の技術に比べて大幅なコスト削減が可能であること、およびサンプルに外来化合物が導入されないことです。開始前に、1倍のトリス緩衝生理食塩水（TBS）および10%アジ化ナトリウムのストックソリューションを準備してください。処理したい標準サイズの顕微鏡スライド3枚につき、スライドチャンバーとして100 mm × 100 mmの正方形ペトリ皿が1枚必要になります。各スライドチャンバーにつき、1倍TBS 50 mLに10%アジ化ナトリウム 25 mLを加えて、0.5%アジ化ナトリウム含有TBSを50 mL調製します。ランプヘッドが下に収まるように、スライドチャンバーを高くするための足場を作成します。100 mm四方のペトリ皿を使用する場合、同サイズのプラスチック製食品容器を適切な形状に切り出して使用できます。サンプルの光路を妨げずにスライドチャンバーを確実に持ち上げることができるものであれば、何でも使用可能です。白色蛍光LEDデスクランプを用意し、光源を覆っているディフューザーや不透明なプラスチックを取り除きます。LEDアレイを上向きに配置します。この目的には、フレキシブルネック付きのランプが推奨されます。スライドチャンバーとスキャフォールドを十分に覆えるサイズのボックスの内側をアルミホイルでライニングし、装置用の反射ドームカバーを作成します。シングルチャンバーの場合は、1mmピペットチップボックスを使用できます。このビデオでは、ホルマリン固定したヒトFTLD-T眼窩前頭回脳組織に光退色前処理を施しました。組織の調製およびアミノ染色手順は、組織切片の由来、固定方法、および包埋方法によって異なる場合があります。4°Cの低温室、コールドキャビネット、または冷蔵庫内で、ランプをスキャフォールドの下に配置し、サンプルチャンバーをスキャフォールドの上に設置してください。サンプルチャンバーにアジ化ソーダ含有TBSを50 milliliters充填します。標準的なガラス製顕微鏡スライドに貼付した厚さ10 micrometerの組織切片を、清潔なピンセットを用いてサンプルチャンバー内に浸漬させます。装置を反射ドームで覆い、LEDランプを点灯させます。サンプルを48時間フォトブリーチングさせます。このインキュベーション時間は、ランプの強度や組織内の自家蛍光物質の量によって異なる場合があります。フォトブリーチングの前処理後、目的の組織およびタンパク質に応じた標準的なプロトコルに従って、スライドの免疫染色を行うことができます。デモンストレーションのため、Alexa 488およびTexas Redを結合させた二次抗体を用いて、FTLD-T脳組織のリン酸化タウを染色しました。核の対比染色にはDAPIを使用しました。抗原賦活化バッファー500 milliliters、0.025% Triton X-100含有TBS 500 milliliters、1% 牛血清アルブミン（BSA）含有TBS 10 milliliters、およびBSA TBSにヤギ血清を加えたブロッキング溶液 2 millilitersを準備します。スライドコレクターに入れ、抗原賦活化緩衝液に光退色させたスライドを浸して抗原賦活化を行います。コレクターを90 °Cで30分間加熱します。加熱処理後、コレクターを取り出し、チャンバーを室温で30分間冷却させることが重要です。スライドをすぐに取り出すと、切片が乾燥してしまいます。一次抗体混合液を製造者の推奨に従って準備します。本例では、anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8抗体をBSA含有TBSで100倍に希釈し、氷上に置いておきました。切片1枚あたり150 µLの抗体混合液が必要です。切片を30分間冷却した後、スライドを抗原賦活化用容器からTBS Tritonを満たした染色瓶に移します。この溶液中でスライドを緩やかに揺らしながら5分間洗浄します。TBS Tritonを捨てて新しいものに交換し、この洗浄ステップを2回目として繰り返します。洗浄後、染色瓶からスライドを取り出し、余分なバッファーを吸い取ります。疎水性ペンを使用して、組織の周囲にアウトラインを描きます。これにより、溶液がスライドから流れ出すのを防ぐことができます。スライドを乾燥させないように注意してください。ブロッキング溶液 200 µL をスライドにピぺッティングして組織をブロッキングし、加湿チャンバーに入れます。このチャンバーは、濡れたペーパータオルを入れたピペットチップボックス内のスライドラックのような簡単なもので構いません。組織サンプル全体がブロッキング液で覆われていることを確認してください。室温で2時間インキュベートします。アスピレーターまたはピペットを使用して、ブロッキング溶液を除去します。一次抗体混合液を100～150 µL、スライド上にピペットで滴下します。サンプル全体が抗体溶液で覆われていることを確認し、抗体溶液が不均一に溜まるのを防ぐため、切片を水平な面に保持してください。加湿チャンバー内で、一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします。翌日、二次抗体混合液を調製します。本例では、goat anti-mouse Alexa 488およびgoat anti-mouse Texas RedをBSA TBSを用いて100倍に希釈しました。組織切片を回収し、アスピレーターまたはピペットを用いて一次抗体溶液を除去します。前回と同様の方法で、TBS Tritonを満たした染色瓶を用いて、1回5分間、計2回の洗浄を行います。洗浄後、余剰なバッファーを吸い取ります。二次抗体溶液を100〜150 µLピペットで加え、組織サンプル全体が完全に覆われていることを再度確認します。加湿チャンバー内にて、室温・暗所で2時間インキュベートします。メーカーの推奨事項または段階希釈に従い、TBSを用いて0.1 µg/mLのDAPI対比染料を調製します。DAPIストック溶液は不溶性がある可能性があるため、十分に混合してください。スライドを回収し、二次抗体混合液を除去します。サンプルを2回洗浄しますが、TBS Tritonの代わりに、通常のTBSを使用してください。残りの洗浄液を吸引またはピペットで取り除き、100〜150 µLのDAPI染色液を組織切片に滴下します。室温、暗所で10分間インキュベートします。サンプルを回収し、2回ではなく3回、TBSのみで洗浄します。洗浄後、残った洗浄液を慎重に取り除きます。封入剤を塗布してください。サンプルの上にカバーガラスを被せ、スライドの封入を完了させます。カバースリップの一端を先に載せ、反対側をピンセットで非常にゆっくりと下ろすことで、気泡の混入を防ぎます。封入剤を乾燥させた後、4°Cの暗所で保存します。これでスライドの観察準備が整いました。蛍光顕微鏡の設定は、染色のために使用した蛍光色素および顕微鏡によって異なります。蛍光ランプ、顕微鏡、およびコンピューターの電源を入れ、ランプを15分間ウォームアップさせます。染色済みの組織スライドを蛍光顕微鏡にセットします。明視野を用いて、10倍の倍率で組織の位置を確認します。適切な組織領域が見つかったら、サンプルのカバーガラスの上に水を1滴滴下します。その後、20倍の水浸レンズに切り替えます。最高の信号を得るために、個別のトラックで各蛍光色素に適したレーザー励起波長および蛍光波長を選択します。設定および使用した波長の詳細は、付随する論文をご参照ください。各トラックの信号強度を最適化するために、レーザー出力とゲイン設定を調整します。適切な設定と視野が決定したら、各トラックの蛍光データを含む合成画像を保存します。各チャンネルの蛍光強度を可視化するために、ImageJ用のRGB Profile Toolsマクロをインストールしてください。ImageJでlsm共焦点画像ファイルを開き、[Image]、[Color]、[Channel Tool]の順に進むことで、3つのスタックからなる合成画像をRGBに変換します。Compositeを選択し、3つのチャンネルすべてにチェックを入れます。次に、ImageからTypeを選択し、RGB Colorを指定します。RGB Profile Toolsアイコンを選択し、プロファイルを作成したい画像上の領域にわたって線を引きます。このビデオでは、背景蛍光を抑制するために組織サンプルの光退色前処理を行う手順について説明します。この手順は、抗原賦活化および免疫染色の前段階として、あらゆる標準的な免疫蛍光プロトコルに追加することが可能です。光退色に使用される装置は安価で入手しやすく、市販のコンポーネントで構成されています。白色蛍光LEDは広範な波長のスペクトルで光を放出するため、広範囲のフォトブリーチング（光褪色）に非常に適しています。入手容易なLEDデスクランプを用い、染色していないヒトFTLD-T脳組織サンプルを、Texas RedおよびAlexa 488で染色した場合に適した波長でフォトブリーチングし、撮像しました。未処理のサンプルでは、大量の自家蛍光が認められました。対照的に、光退色によって、リポフスチンに類似した自家蛍光スペックルおよび全般的な背景蛍光の強度が著しく減少しました。本手法をさらに検証するため、FTLD-Tの脳組織検体を用いて、この疾患において異常に折り畳まれ、明確な封入体として蓄積するタンパク質である過リン酸化tauの染色を行いました。tauのラベル化と非特異的な蛍光をより明確に区別するため、2種類の異なる二次抗体を使用しました。これらの合成画像において、Alexa 488とTexas Redの共局在は黄色で示されており、これは正しく染色されたtauタンパク質を表しています。赤色または緑色の領域が現れている場合は、非特異的な蛍光か、あるいはいずれかの発色団の消光を示しています。未処理のコントロールサンプルでは、特にTexas Redチャネルにおいて、顕著なバックグラウンドおよび非特異的なシグナルが見られます。光退色前処理と化学的クエンチャーの適用のいずれにおいても、バックグラウンド信号の著しい低減が見られます。蛍光チャンネルを分離し、より高倍率で画像を確認することで、より詳細な観察が可能です。未処理のコントロールでは、すべてのチャンネルでバックグラウンド蛍光が認められるほか、主にTexas Redチャンネルにおいて、tau特異的標識と同程度の強度を持つ非特異的な特徴が認められます。もしtau封入体に明確で予測可能な形態がなかった場合、これらの自家蛍光特性の存在により、Texas Redの結果を誤認した可能性があります。フォトブリーチングの前処理を行うことで、tau特異的なTexas RedおよびAlexa 488シグナルの大部分を維持しつつ、これらのTexas Red非特異的な特性を完全に消失させることができます。しかしながら、フォトブリーチングはDAPIの背景蛍光にはほとんど影響を及ぼさないと考えられます。化学的クエンチャーは、フォトブリーチングと同等に効果的に Alexa 488 チャネルの背景蛍光を減少させました。しかし、DAPI と Texas Red の両方の蛍光強度も低下させており、一部に逆効果なクエンチングが存在することが示唆されました。これらの影響の定量的な結果は、シグナルプロファイルで確認できます。ご覧のように、この方法により、混同を招く特徴のないクリアな画像が得られます。このフォトブリーチング前処理を標準的なアミノ蛍光プロトコルに組み込むことで、自家蛍光を除去し、高品質で曖昧さのない結果を得ることができます。

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Research

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