点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論
2017年8月25日
このプロトコルは哺乳類細胞における点突然変異の修復システムを編集 CRISPR/Cas9 ベースの遺伝子のワークフローについて説明します。ここで、ターゲット ・ サイトで塩基形成測定の詳細な後続実験的戦略と遺伝子編集へのコンビナトリアル アプローチを使用-本質的に、オンサイトの突然変異を分析します。
この実験手順の全体的な目標は、ターゲット部位の遺伝的不均一性を信頼性と堅牢性で測定するための詳細な方法論における基本的なアプローチを概説することです。この方法は、オンサイト変異導入をどのように分析および測定できるかなど、遺伝子編集分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、一本鎖オリゴヌクレオチドを用いた相同性指向修復または遺伝子修正のための標準化された方法論であることです。
プロトコールを開始するには、T-175フラスコでHTT116細胞を培養するために、事前に調製した培地25ミリリットルでHTT11619細胞を増殖させます。培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで細胞を洗浄し、PBSを吸引します。次に、5ミリリットルのピペットを使用して、トリプシンをT-175フラスコに滴下します。
インキュベーター内で細胞を分離させます。フラスコを軽くたたいて細胞を取り除き、8ミリリットルの完全培地でフラスコの表面全体に細胞を急冷します。次に、混合物を複数回ピペットで上下させて細胞の塊を分解し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。
細胞をスピンダウンする前に、15ミリリットルの円錐管から10マイクロリットルを取り出し、10マイクロリットルのトリパンブルーと組み合わせて細胞を数え、細胞をペレット化します。トリパンブルーと混合した細胞の10マイクロリットルを血球計算盤に移し、外側の4つのグリッドを数えます。同期する細胞の10センチメートルプレートごとに、5ミリリットルの完全な培地と6マイクロモルのアフィジコリンを追加します。
次に、再懸濁した細胞ペレット100マイクロリットルを各センチメートルプレートに移し、プレートを穏やかに撹拌して混合します。プレートをインキュベートして、G1S境界で細胞を同期させます。ターゲティングの4時間前に、培地を吸引し、PBSで洗浄します。
PBSを吸引し、5ミリリットルの完全培地を追加します。プレートをインキュベーターに4時間戻します。変異型EGFP遺伝子配列をZane Labsのオンラインジェネレーターに入力し、標的部位に近接して結合するCRISPRガイド配列を選択します。
RNAを45マイクロモルに等しいモル濃度で混合します。1.5ミリリットルの遠心分離管に、200マイクロモルのCR RNAストック6.75マイクロリットルとトレーサーRNAの200マイクロモルストックの6.75マイクロリットルを加えます。次に、16.50マイクロリットルのIDTバッファーを追加して、最終容量を30マイクロリットルにします。
次に、PCRマシンで混合物を摂氏95度で5分間加熱します。サンプルを室温まで冷まします。各サンプルについて、2.22マイクロリットルのCR RNAをトレーサーRNA複合体に希釈し、2.78マイクロリットルのIDTバッファーを最終容量5マイクロリットルに希釈します。
60マイクロモルのストックから1.67マイクロリットルのCas9タンパク質を3.33マイクロリットルの低血清培地に希釈し、最終容量を5マイクロリットルにします。5マイクロリットルのCas9タンパク質と5マイクロリットルの複合RNAを混合します。培地を吸引し、5ミリリットルのPBSで洗います。
PBSを吸引し、10センチメートルのプレートごとに1ミリリットルの予熱したトリプシンを追加します。プレートをインキュベーターに入れます。次に、10センチメートルのプレートを軽くたたいて、すべての細胞が取り除かれていることを確認し、プレートの表面全体に分散させて、4ミリリットルの完全培地でそれらを急冷します。
ピペットを何度も上下させて細胞の塊をバラバラにし、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。15ミリリットルの円錐管から10マイクロリットルを取っておき、それを10マイクロリットルのトリパンブルーと組み合わせて細胞を数えます。室温で125 x Gで5分間回転することにより、細胞をペレット化します。
メディウムを吸引し、5ミリリットルのPBSで洗います。125 x Gを室温で5分間スピンアウトして細胞を剥離します。細胞懸濁液の100マイクロリットルを各エレクトロポレーション4ミリメートルギャップキュベットに移します。
100マイクロリットルの細胞に10マイクロリットルのRNP複合体を、5×10の5番目の細胞密度で加えます。各サンプルに2マイクロモルODNを添加します。次に、ラックをエレクトロポレーションマシンに持っていきます。
各サンプルを軽くフリックし、チャンバーに入れます。ラックをフードに戻し、各サンプルを6ウェルプレートに2ミリリットルの完全な培地が入ったウェルに移します。補正レベルを確認する前に、プレートをインキュベートします。
培地を吸引し、細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄します。PBSを500マイクロリットルの予熱済みトリプシンと交換し、6ウェルプレートの各ウェルに取り付けます。プレートをインキュベーターに入れます。
次に、プレートを軽くたたいてすべての細胞が取り除かれていることを確認し、1ミリリットルの完全培地でウェルの表面全体に分散させて急冷します。細胞を1.5ミリリットルの遠心分離チューブとペレットに通します。細胞をペレット化した後、培地を吸引し、細胞ペレットを500マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。
100マイクロリットルあたり5×10の濃度で同期および放出されたHTT11619細胞をエレクトロポレーションし、RNP複合体を100ピコモル、72NTODNの100ピコモルを2.0マイクロモルでエレクトロポレートします。細胞を6ウェルプレートに移し、72時間回復させます。次に、EGFPプラスマイナス用の488ナノメートルレーザーを備えたFACソーターを使用して、細胞を96ウェルプレートに個別に選別します。
増殖しているウェルから、市販のDNA分離キットを使用して細胞gDNAを単離します。PCRを介してターゲットベース周辺の領域を増幅します。最後に、サンプルのDNAシーケンシング解析を行います。
インキュベーションフローサイトメトリー解析の72時間後、緑色蛍光タンパク質の機能修復を確認します。RNPと72NTの協調レベルが増加するにつれて、段階的な用量反応が観察されました。RNP粒子の非存在下での遺伝子編集反応により、10倍高濃度の72NTオリゴヌクレオチドを用いた場合、標的細胞の約1%が修正された遺伝子編集反応
が単剤で得られた。EGFP陽性サンプルのクローン16クローンを選択し、標的部位を取り巻く遺伝的完全性をDNAシーケンサーで解析しました。16個のEGFP陽性細胞すべてに、標的部位で予測されるヌクレオチド交換が含まれていました。15の非緑色クローン分離株を、標的部位の不均一性について分析しました。
DNA塩基交換は、サンプルの約半数で観察されませんでした。調査したクローン増殖の残りの部分は、欠失突然変異の不均一な集団を示しました。欠失サイズは、1塩基から19塩基の範囲であった。
CRISPR、Cas9、および一本鎖オリゴヌクレオチド供与体DNA分子が連携して働くと、EGFP遺伝子の点変異の正確な修復につながる可能性があり、これは、ドナーDNAが変異塩基の修復のための複製テンプレートにアクセスする分子経路である点突然変異の修復のためのこの新しいモデルで示されています。このプロセスは、ExACTと名付けられています。その開発後、この技術は、遺伝子編集の分野の研究者が、細胞株の遺伝子編集活性の結果として、標的部位の不均一性の程度を調査する道を開きました。
概要
本プロトコルでは、哺乳類細胞における点突然変異を修復するためのCRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集システムについて概説します。ここでは、遺伝的な不均一性の測定およびオンサイトの変異導入解析のための手法を詳しく説明します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 遺伝子編集
- CRISPR/Cas9技術
- 分子生物学
背景
- CRISPR/Cas9は、遺伝子編集における革命的なツールです。
- オンサイト変異導入を理解することは、遺伝子治療にとって極めて重要です。
- 標準化された手法は、実験の再現性を向上させます。
- 本プロトコルでは、一本鎖オリゴヌクレオチドを用いた相同組換え修復に焦点を当てます。
研究目的
- 標的部位における遺伝的変化を分析するための信頼性の高い手法を提供すること。
- 遺伝子矯正技術への理解を深めること。
- 今後の遺伝子編集研究に向けた標準的なアプローチを確立すること。
使用方法
- HTT11619細胞の細胞培養および同期化。
- CRISPR RNAおよびCas9タンパク質複合体の調製。
- RNP複合体を用いた細胞のエレクトロポレーション。
- 遺伝子編集結果を確認するためのフローサイトメトリー解析。
主な結果
- 緑色蛍光タンパク質の機能的修復が確認された。
- 標的部位におけるインデル形成を測定した。
- RNP濃度に応じた用量依存的な反応が観察された。
- 標的細胞において約1%の矯正が達成された。
結論
- この手法は、遺伝子編集研究のための堅牢なフレームワークを提供します。
- 標準化は、遺伝子治療研究における再現性の鍵となります。
- 今後の応用により、遺伝性疾患に対する治療戦略が強化される可能性があります。
よくある質問
業界への実用的関連性
本プロトコルは、CRISPR/Cas9を用いた点変異修復におけるオンサイト変異導入を定量化するための標準化された手法を提供します。これは、治療法開発に向けたゲノム編集アプローチの安全性と精度を評価する上で極めて重要な要素です。標的部位でのindel形成を測定することで、本手法は相同組換え修復戦略のメカニズム的なリスク軽減を可能にし、リード化合物の特定および前臨床段階への移行判断における予測の信頼性を高めます。このアプローチは、真の矯正と付随的な遺伝的病変を区別するという、探索段階における主要な課題を解決し、それによって初期段階の遺伝子治療パイプラインにおけるgo/no-go判断に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 標的部位における正確な点変異修復と意図しないインデル形成を区別することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値： 遺伝的不均一性を定量化するための再現可能なワークフローを提供し、修復精度の評価を通じて機能的な標的バリデーションをサポートする。
- 予測的価値： オンターゲット遺伝子座におけるオフターゲット様の活性を測定し、生物学的なリスク低減および遺伝子編集構築物のポートフォリオ選別に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 実験条件全体を通じて編集結果を一貫して測定するため、標準化された細胞ベースモデル（変異eGFP発現HCT116）を構築します。
- 定量的な出力： アッセイの最適化および試薬の滴定のための機能的なリードアウトとして、測定可能なindel頻度およびサイズ分布（1–19 bpの欠失）を提供します。
- 拡張性： 補正精度の指標を必要とするダウンストリームのスクリーニングキャンペーンに向け、検証済みの生物学的システムの調製をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：治療候補における許容可能な変異導入レベルの基準を定義することで、探索段階の編集精度を前臨床検証へと結びつけます。
- リスク調整後の推進：修復触媒の関数として標的部位での変異導入度を定量化し、コンストラクトの進展に関するデータ駆動型の意思決定を可能にします。
- メカニズムによるリスク低減：観察された修正が真の相同組換え修復によるものか、あるいはエラーが発生しやすいメカニズムによるものかを明確にし、安全性プロファイルに反映させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、創薬から前臨床に至る一連の流れに組み込まれており、特に、疾患関連システムにおける機能的に検証される前の段階で、編集精度の定量的指標を提供することにより、リード化合物の同定を支援します。
- 探索生物学： CRISPR/Cas9およびssODNがヌクレオチド置換およびindel形成に与える寄与を切り分けることで、修復メカニズムの仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 同期させた細胞調製と定義されたエレクトロポレーションパラメータを通じてアッセイの標準化を可能にし、反復試行間の再現性を向上させます。
- 分析： 定量的な従属変数（indelサイズ、頻度、クローン分布）の測定値を生成し、RNPとドナーオリゴヌクレオチドの投与条件の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 標的部位における許容可能なオフターゲット様活性のしきい値を設定することで、分子レベルの精密な結果を前臨床リスク評価へと結びつけます。
- 企業レベルの再利用： ヒト細胞におけるあらゆるCRISPR/Cas9ベースの点変異矯正戦略を評価するための、基礎的で再利用可能なワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 見かけ上の矯正の攪乱要因となるオンサイトの変異誘発を直接測定することにより、遺伝子編集の精度の予測信頼性を提供します。
- 運用的価値： 詳細な細胞同期、RNP調製、およびエレクトロポレーションのプロトコルを通じて標準化を保証し、遺伝的結果の測定におけるばらつきを低減します。
- 戦略的価値： 観察された矯正に有意なindel形成が伴っているかを明らかにすることで、go/no-goの意思決定を改善し、後半段階における生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響： 定量化された変異誘発プロファイルに基づいて遺伝子編集アプローチのリスク調整後の優先順位付けを可能にし、前臨床投資における資本効率を向上させます。
実施上の検討事項
- 哺乳類細胞培養、フローサイトメトリー、およびgDNA単離とPCR増幅のための分子クローニングの専門知識が必要です。
- 4 mmギャップキュベットを備えたエレクトロポレーション装置およびEGFPに基づくシングルセルソーティングが可能なFACSソーターへのアクセスが前提となります。
- 再現性のある結果を得るには、ラボ間での細胞周期同期（アフィジコリン処理）およびRNP複合体調製の標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適応させる場合、エレクトロポレーション条件およびドナーオリゴヌクレオチドの導入効率の最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限：本アッセイは内因性の突然変異を測定しますが、追加のメカニズム阻害剤を用いない限り、修復経路の寄与を区別することはできません。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Cell Line, Culture Conditions, and Harvest
1:57
Plating the Cells and Releasing Them from Aphidicolin Synchronization
2:44
RNA Complexing
4:13
Harvesting the Cells for Targeting
5:30
Targeting Samples
6:13
Analysis of Gene Edited Cells and Transfection Efficiency
6:57
DNA Sequence Analysis
7:56
Results: Effective Point Mutation Repair
9:41
Conclusion
