点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

この実験手順の全体的な目標は、ターゲット部位の遺伝的不均一性を信頼性と堅牢性で測定するための詳細な方法論における基本的なアプローチを概説することです。この方法は、オンサイト変異導入をどのように分析および測定できるかなど、遺伝子編集分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、一本鎖オリゴヌクレオチドを用いた相同性指向修復または遺伝子修正のための標準化された方法論であることです。

プロトコールを開始するには、T-175フラスコでHTT116細胞を培養するために、事前に調製した培地25ミリリットルでHTT11619細胞を増殖させます。培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで細胞を洗浄し、PBSを吸引します。次に、5ミリリットルのピペットを使用して、トリプシンをT-175フラスコに滴下します。

インキュベーター内で細胞を分離させます。フラスコを軽くたたいて細胞を取り除き、8ミリリットルの完全培地でフラスコの表面全体に細胞を急冷します。次に、混合物を複数回ピペットで上下させて細胞の塊を分解し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。

細胞をスピンダウンする前に、15ミリリットルの円錐管から10マイクロリットルを取り出し、10マイクロリットルのトリパンブルーと組み合わせて細胞を数え、細胞をペレット化します。トリパンブルーと混合した細胞の10マイクロリットルを血球計算盤に移し、外側の4つのグリッドを数えます。同期する細胞の10センチメートルプレートごとに、5ミリリットルの完全な培地と6マイクロモルのアフィジコリンを追加します。

次に、再懸濁した細胞ペレット100マイクロリットルを各センチメートルプレートに移し、プレートを穏やかに撹拌して混合します。プレートをインキュベートして、G1S境界で細胞を同期させます。ターゲティングの4時間前に、培地を吸引し、PBSで洗浄します。

PBSを吸引し、5ミリリットルの完全培地を追加します。プレートをインキュベーターに4時間戻します。変異型EGFP遺伝子配列をZane Labsのオンラインジェネレーターに入力し、標的部位に近接して結合するCRISPRガイド配列を選択します。

RNAを45マイクロモルに等しいモル濃度で混合します。1.5ミリリットルの遠心分離管に、200マイクロモルのCR RNAストック6.75マイクロリットルとトレーサーRNAの200マイクロモルストックの6.75マイクロリットルを加えます。次に、16.50マイクロリットルのIDTバッファーを追加して、最終容量を30マイクロリットルにします。

次に、PCRマシンで混合物を摂氏95度で5分間加熱します。サンプルを室温まで冷まします。各サンプルについて、2.22マイクロリットルのCR RNAをトレーサーRNA複合体に希釈し、2.78マイクロリットルのIDTバッファーを最終容量5マイクロリットルに希釈します。

60マイクロモルのストックから1.67マイクロリットルのCas9タンパク質を3.33マイクロリットルの低血清培地に希釈し、最終容量を5マイクロリットルにします。5マイクロリットルのCas9タンパク質と5マイクロリットルの複合RNAを混合します。培地を吸引し、5ミリリットルのPBSで洗います。

PBSを吸引し、10センチメートルのプレートごとに1ミリリットルの予熱したトリプシンを追加します。プレートをインキュベーターに入れます。次に、10センチメートルのプレートを軽くたたいて、すべての細胞が取り除かれていることを確認し、プレートの表面全体に分散させて、4ミリリットルの完全培地でそれらを急冷します。

ピペットを何度も上下させて細胞の塊をバラバラにし、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。15ミリリットルの円錐管から10マイクロリットルを取っておき、それを10マイクロリットルのトリパンブルーと組み合わせて細胞を数えます。室温で125 x Gで5分間回転することにより、細胞をペレット化します。

メディウムを吸引し、5ミリリットルのPBSで洗います。125 x Gを室温で5分間スピンアウトして細胞を剥離します。細胞懸濁液の100マイクロリットルを各エレクトロポレーション4ミリメートルギャップキュベットに移します。

100マイクロリットルの細胞に10マイクロリットルのRNP複合体を、5×10の5番目の細胞密度で加えます。各サンプルに2マイクロモルODNを添加します。次に、ラックをエレクトロポレーションマシンに持っていきます。

各サンプルを軽くフリックし、チャンバーに入れます。ラックをフードに戻し、各サンプルを6ウェルプレートに2ミリリットルの完全な培地が入ったウェルに移します。補正レベルを確認する前に、プレートをインキュベートします。

培地を吸引し、細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄します。PBSを500マイクロリットルの予熱済みトリプシンと交換し、6ウェルプレートの各ウェルに取り付けます。プレートをインキュベーターに入れます。

次に、プレートを軽くたたいてすべての細胞が取り除かれていることを確認し、1ミリリットルの完全培地でウェルの表面全体に分散させて急冷します。細胞を1.5ミリリットルの遠心分離チューブとペレットに通します。細胞をペレット化した後、培地を吸引し、細胞ペレットを500マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。

100マイクロリットルあたり5×10の濃度で同期および放出されたHTT11619細胞をエレクトロポレーションし、RNP複合体を100ピコモル、72NTODNの100ピコモルを2.0マイクロモルでエレクトロポレートします。細胞を6ウェルプレートに移し、72時間回復させます。次に、EGFPプラスマイナス用の488ナノメートルレーザーを備えたFACソーターを使用して、細胞を96ウェルプレートに個別に選別します。

増殖しているウェルから、市販のDNA分離キットを使用して細胞gDNAを単離します。PCRを介してターゲットベース周辺の領域を増幅します。最後に、サンプルのDNAシーケンシング解析を行います。

インキュベーションフローサイトメトリー解析の72時間後、緑色蛍光タンパク質の機能修復を確認します。RNPと72NTの協調レベルが増加するにつれて、段階的な用量反応が観察されました。RNP粒子の非存在下での遺伝子編集反応により、10倍高濃度の72NTオリゴヌクレオチドを用いた場合、標的細胞の約1%が修正された遺伝子編集反応

EGFP陽性サンプルのクローン16クローンを選択し、標的部位を取り巻く遺伝的完全性をDNAシーケンサーで解析しました。16個のEGFP陽性細胞すべてに、標的部位で予測されるヌクレオチド交換が含まれていました。15の非緑色クローン分離株を、標的部位の不均一性について分析しました。

DNA塩基交換は、サンプルの約半数で観察されませんでした。調査したクローン増殖の残りの部分は、欠失突然変異の不均一な集団を示しました。欠失サイズは、1塩基から19塩基の範囲であった。

CRISPR、Cas9、および一本鎖オリゴヌクレオチド供与体DNA分子が連携して働くと、EGFP遺伝子の点変異の正確な修復につながる可能性があり、これは、ドナーDNAが変異塩基の修復のための複製テンプレートにアクセスする分子経路である点突然変異の修復のためのこの新しいモデルで示されています。このプロセスは、ExACTと名付けられています。その開発後、この技術は、遺伝子編集の分野の研究者が、細胞株の遺伝子編集活性の結果として、標的部位の不均一性の程度を調査する道を開きました。