Name: マウスの早い妊娠の特性の三次元の高周波超音波の新規な使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶマウスの早期妊娠を高周波超音波で三次元的にモニタリングする手法。非侵襲的に着床後の発生を追跡し、生殖生物学研究における縦断的データ収集を可能にする。

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我々 は非常に栄趙、杰李 Ying ヤンの協力をありがとうございます。

ケアと健康の国民の協会によって公開された実験動物の使用および機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認された動物のプロトコル ガイドに従って行われたこれらの研究議定書の下で薬の Baylor の大学の数、4203。
 1。 超音波妊娠マウスの作製 1700 以降 <ol><li><ol><li>実績のある肥沃な男性とダムの場所を 交尾のタイミング をマウスに一晩開始。別のダムと男性 0700 時間 (h)、関係なく妊娠の正確な年代測定を確保するために膣にプラグがある場合 。
		注: 0.5 日と見なされる交尾後の朝のポストの coitum 定め (d.p.c.) です</li>。
	</ol></li> <li>超音波のための準備 <ol><li>シール麻酔誘導コンテナーで妊娠中のマウスを配置します</li>。
		<li>落ち着いたイソフルラン (2%) 吸入麻酔薬と酸素 (1 L/分) まで動物を失い立ち直り反射 (約 1-2 分のサイズに応じてマウスの)、(呼吸) 以外にも自発的な動きが観察されていません</li>。
		<li>にノーズコーンとイソフルレン (2%) 吸入麻酔薬と酸素 (1 L/分) で仰臥位で鎮静マウスを置く。動物に眼軟膏を適用 &#39; s 目</li>。
		<li>綿棒で腹部全体、膣、胸骨に脱毛クリームを適用し、外側を側面します</li>。
		<li>は、最大 3 分のままにクリームを許可する、クリームとティッシュで髪を取り外します。残りの髪は画像品質が低下、すべての髪が削除されることを確認します</li>。
	</ol></li></ol> 2。超音波ステージの準備 <ol><li>探触子をオンにします</li>。
	<li>トランスデューサーに 3-D モーター段階モーター ステージを添付します。
	<ol><li>3 D にプラグ モーター、3 D モーター ケーブルを背面パネルの 3 D モーター コネクタに接続します。3 D モーター システムをイメージング ステーションに接続する上にクイック リリース ポストを使用してマウント システムにアタッチとクイック リリース マウント トランスデューサー クランプを貼る下</li>。
	</ol></li> <li>探触子クランプにプローブを接続します</li></ol>。
 3。 妊娠マウスをイメージング開始 <ol><li>場所マウス監視プラットフォームで仰臥位。マウスは継続的にイソフルラン麻酔 (1.5-2.5%) の間を受け取ると鼻の円錐形を介して酸素 (1 L/分)。心拍数監視プラットフォーム上のパッドにすべての足をそっとテープします。
	<ol><li>上腹部超音波伝送ゲルの 1-2 の mL を適用します</li>。
	</ol></li> <li>手動モーター ステージを使用して下腹部に超音波プローブを置きます。
	<ol><li>膀胱は、膣の開口部に頭の方だけ液体で満たされた暗闇の円として表示されますを見つけます</li>。
		<li>膀胱が見つかったら、プローブを移動非常にゆっくりと頭の方妊娠中の子宮は、妊娠サイトで丸いエリアと円柱の形として表示されますを視覚化します。これはチェーンに真珠のように見えるとして記述することができます</li>。
		<li>したら 2 D イメージング、妊娠子宮が発見されました</li>。
	</ol></li></ol> 4。2 D 超音波イメージング (図 1) <ol><li>妊娠子宮を特定したら、膀胱に最も近い妊娠サイトから始まり、ゆっくりと順番には妊娠のサイトの数と場所を決定するため頭側移動します</li>。
	<li>腎臓、脾臓や肝臓が可視化プローブの位置を変更近い尾 (に近い膀胱) ユーザーがあまりにも頭の方まで行っていると</li>。
	<li>同じ方法で採卵をイメージします</li>。
	<li>超音波フレームは後の分析や測定のために保存する注入/妊娠サイトの中心部でときに画像をフリーズする 。
	注: それは冷凍して後で分析のために保存画像の 1 秒未満かかります</li>。
	手動でクリックしてマーカーとしてエコー エストロージェン反応を利用した <li>測定注入距離、&#34; メジャー &#34; まず、ツールし、1 つの注入のサイトの場所をクリックします。次に、着床しコンピューターが自動的にその距離をレポート ラインを描画するをクリック、次にカーソルをドラッグします。ソフトウェアは、手動測定が報告が。この手順はないコンピューターですが、プログラムは測定先決を提供 decidualized サイト間の線で decidualized のサイト間の距離をマークするユーザーに依存している</li>
	<li>注入、胎嚢サイズ、胎児極サイズを測定します</li>。
</ol> 5。胎児心拍 注: 9.5 d.p.c. で胎児の心臓の鼓動を明確に視覚化する必要があります。
<ol><li>プローブを非常にまだ維持しながらパルス波ドップラーをオンにし、表示のハートビートにこれを置きます</li>。
	<li>レコード、心臓鼓動脈動 。
	注: 中心部から離れてこの手順も記録できます脈動に臍帯</li>。
</ol> 6。 3-D 超音波買収 <ol><li>後、妊娠中の子宮は 2 D 画像の可視化されて目的の 3-D イメージのおおよその中間点にある領域にプローブを位置づけ。たとえば、3-D でリンゴを撮像された 1 つ場合プローブされるべきである最初する位置 (すなわちオブジェクトの真ん中) をリンゴの芯が予測されています</li>。
	<li>の目的のイメージの中にプローブを用いた 3-D 取得を取得します。3 D モーター ステージは一連の手順またはフレームのために子宮全体でこの距離を旅行、どのような調査官の欲望全体に取り込むつもりで</li>。
	<li>意図されていた構造がリアルタイム超音波部分を完了する前に 3 D スキャンで完全にキャプチャされたことを確認します。後でポスト処理のためこの 3次元の情報を保存します。2 D と 3 D の超音波取得の所要時間は約 10-20 分経験のあるユーザーによって実行されるときです</li>。
</ol> 7 3次元再構成後処理 (図 2) <ol><li>3次元画像処理の必要なデータをロードします。</li>。
	<li>選択 &#34; 平行・回転メソッド &#34;、すべての 3 D 画像のフレーム 1 つの 3-D に負荷が &#34; ボックス &#34; ユーザーは、フレーム単位での目的のオブジェクトをトレースし。ステップを選択サイズ 0.08 mL。画像ブロックの一方の端から始まり、空間内で撮影されている画像を理解するスクロールします。
	<ol><li>イメージと手動でトレース オブジェクトのアウトラインの一方の端で開始します</li>。
		<li>次の 2 D イメージ スライスをスクロールまたは &#34; フレーム &#34; オブジェクトのアウトラインを手動でトレースと</li>。
		<li>手動で注釈/トレース ユーザーによってすべてのフレームがされるまで、このプロセスを続行します</li>。
		<li>をクリックして &#34; を終了 &#34; 3次元画像と総体積の計算を取得する</li>。
	</ol></li> <li>メッシュと左上隅の矢印は、固体のオーバーレイを選択します</li>。
	<li>を保持または削除する周辺の超音波イメージ情報をわかりやすくするために選択します。それぞれの 3次元復元が 10 〜 20 分間かかることがあります</li>
</ol> 8。手続き後ケア <ol><li>超音波が完了したら、麻酔ガスをオフに、プラットフォームから、マウスを削除しふきます、動物から、超音波ジェルを洗い流します</li>。
	<li>は、パディング領域の腹臥位でケージに戻ってマウスを配置します。動物は自然に目を覚まし、移動するまで監視します</li>。
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

3次元 HFUS イメージングのこの小説の使用は、正常に検出、視覚化、および非侵襲的方法で妊娠初期マウス胚着床を特徴付ける機能を示します。技術は、総組織と病理組織学的評価のために妊娠の中断に依存する現在の方法と比べて大幅に改善を提供しています。しかし、組織学的方法まだと思われるより最適なより拡大しより細胞レベルで評価が必要なときや、遺伝子・ タンパク質解析が必要な場合に注意してください。注入欠陥および早い妊娠の損失19,20,21,22を表示する新しいマウスモデルの増加に伴い、これの能力は初期を検出する超音波技術を高度な5.5 着実以降からの妊娠は、妊娠中期12,13での検出に限られていた以前の超音波方法で明確な利点を提供します。また、このメソッドは、中心が 8.5 ...

再発妊娠初期の損失は受胎後は最も一般的な合併症の 1 つと1,2を想像しようとするカップルの約 1% に影響を与えます。妊娠初期の損失のメカニズムは変わる: 本質的な胚の異常や子宮内膜の感受性1,3,4の欠陥に母体合併症から。自分の遺伝的少ないのためのマウス モデルは、初期胚移植の妊娠の調査のため広く利用されています。さらに、マウスと大規模な研究を実行する能力の短い妊娠時は、人間の生殖医学5の主要な臨床質問に対処でマウスの成長しているユーティリティを確保しています。つまり、マウスの実験的デザインの大半はまだ定量化妊娠6、中に注入サイトの場所、数、サイズ、および間隔のパターンを分析して順次妊娠日の安楽死させたことに多数のダムを必要とします。 7、8、それによって同じ動物に関する縦断的研究は除外。
クリニックで超音波は人間の胎児の生存、非侵襲的方法9,10,11の開発を監視する信頼性の高い、非常に貴重なツールです。最近では、高周波超音波 (HFUS) は、マウスの胎児の生存および妊娠12,13,14中の成長を監視する方法として限られたアプリケーションを検索し始めています。超音波画像における最近の技術の進歩は、動物の臓器の視覚的な復元と病態15,16、それ以降の監視の立体 (3 D) データのアプリケーションを許可しています。 17。この高度なイメージング技術の使用より小さいボリュームの変動、動物間の可変性を減らすために、病理学の進行または17の治療的介入の有効性を監視するための検出力は飛躍的に。この技術の主要なユーティリティは、営利的モデル15,16における悪性腫瘍の進行を監視してきましたが、3-d HFUS ばかり量的に表わすし、胚移植の積極的な成長を監視する使用されていますマウス子宮18で胎児の発育。
ここでは、初期の妊娠マウス子宮の再構成を生成する 2 D と 3 D データを生成するイメージング HFUS を実行する方法を示します。非侵襲的な方法でデータを収集するために研究者を許可する妊娠の終了を必要とせずこれらの初期胚の注入のイベントを検出するこの手法の有用性を示す.

<table><tbody><tr><td>VisualSonics Vevo 2100 超音波画像診断プラットフォーム/マシン</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station</td><td>VisualSonics, inc. (英語)</td><td>SA-11982</td><td></td></tr><tr><td>アクアソニック 100 超音波透過ジェル</td><td>パーカー</td> <td>#SKU PLI 01-08</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン (IsoThesia) 100mL ボトル</td><td>ヘンリー・シェイン</td><td>#29404</td><td></td></tr><tr><td>プラルーベン動物眼科軟膏</td><td>デクラ</td><td>#12920060</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの早い妊娠の特性の三次元の高周波超音波の新規な使用

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

高周波超音波 (HFUS) は、非侵襲的子宮内胎児のリアルタイムの開発を監視するための一般的な方法です。マウスは体内モデルとして胚移植と妊娠の進行の勉強を日常的に使用されます。残念ながら、このようなマウスの研究は、フォロー アップの表現型解析を有効にする妊娠の中断を必要とします。この問題に対処するため立体 (3 D) HFUS 画像マウス胚の注入のサイトと、個々 の発達進行で子宮の早期検出と評価のためのデータを使用しました。我々 は、正確に胚移植サイト数を定量化すると同様に 9.5 d.p.c. を通じて 5.5 日ポスト膣 (d.p.c.) から C57BL6J/129S 妊娠マウスにおける発達の進行を監視ができた HFUS 3次元再構成画像とモデルを組み合わせて、探触子を用いる。含まれている測定: 数、場所、およびサイト間注入間隔と同様、着床のボリューム胚の生存率は、心臓の活動を監視することによって評価されました。すぐ着床後期間 (5.5 〜 8.5 d.p.c.) 再構成メッシュと固体のオーバーレイの両方で妊娠の子宮の形式にはそれぞれの子宮角内にある発展途上の妊娠の視覚的表現が有効になります。遺伝子改変マウスが子宮の機能不全から派生した女性の生殖形質を特徴付けるために使用するのにつれ、このメソッドは、検出、定量化、および初期注入イベント特徴づける体内への新しいアプローチを提供しています。3次元 HFUS イメージングのこの小説の使用は、正常に検出、視覚化、および非侵襲的方法で妊娠初期マウス胚着床を特徴付ける機能を示します。技術は、総組織と病理組織学的評価のために妊娠の中断に依存する現在の方法と比べて大幅に改善を提供しています。ここでメッシュと立体画像で子宮の形の改築に伴う信頼性と再現性のあるデータを生成するのにマウス妊娠初期の超音波を正常に実行するのに方法について説明ビデオ、テキスト形式を使用します。

図 1に示されているように、高周波超音波は注入サイト開発、早くも 5.5 着実にポイントを検出できます。ライターのエコーを使用して 6.5 着実に着床のマーカーとして decidualized 子宮内膜は着床と間隔を定量化するこれらのサイトの数をことができます。妊娠として 7.5 d.p.c.、暗い低エコーの胎嚢と胎仔のポールまで進行は簡単に識別もできます。
図 2に示すように、マウス子宮の 3次元画像の後処理の完了された構成は視覚化することができます。6.5 着実にメッシュと固体オーバーレイ形式の両方で高周波超音波組成は視覚的描写を提供するために使用できます。別の例では、この時の 7.5 着実メッシュと固体オーバーレイ別子宮の最終的な合成画像を示します。
<p class="jove_content" fo:keep-tog...

マウスは、妊娠性生物を勉強する広く使用されます。ただし、妊娠の終了は、縦断的な調査を排除する、多数の動物の使用を必要とするこのような研究に必要です。したがって、早期発見のための高周波超音波の非侵襲的手法と妊娠マウスに着床後イベントの監視について述べる。

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

この超音波イメージング手順の全般的目的は、マウスの初期妊娠を検出、モニタリングおよび特性評価することです。この手法は、マウスの生殖生物学分野における重要な疑問への回答や、マウスの初期妊娠における成長、発達および生存能の確立に役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの妊娠を中断することなく、生体内で妊娠の状態を特性評価および表現型解析できるため、縦断的なデータ収集が可能であることです。一般的に、この方法に不慣れな方は、すべての画像を同一平面上に捉えることに苦労します。これは、超音波プローブを非常にわずかに incremental 移動させる必要があるためです。まずは超音波診断装置の準備から始めてください。トランスデューサーの電源を入れ、3Dモーターステージをトランスデューサーに取り付けます。次に、プローブをトランスデューサークランプに固定します。その後、マウスを仰臥位にしてモニタリングプラットフォーム上に配置します。ノーズコーンを介して麻酔を投与し、すべての肢をプラットフォーム上の心拍数モニタリングパッドに緩やかにテープで固定します。次に、超音波伝達ジェルを1〜2 mLほど腹部に塗布します。その後、手動モーターステージを用いて、超音波プローブを下腹部に配置します。超音波診断装置を用いて、膣口のすぐ頭側に、卵黄で満たされた暗色の円形として観察される膀胱を確認します。膀胱を確認後、プローブを非常にゆっくりと頭側に移動させ、妊娠子宮を可視化します。妊娠子宮は、妊娠部位に円形領域を持つ円筒形として観察されます。これは、鎖についた真珠のように見えます。次に、2次元イメージングを行います。妊娠子宮を特定したら、膀胱に最も近い妊娠部位から開始し、ゆっくりと順次頭側へ移動させて、すべての妊娠部位の位置を確認します。画像を保存してください。腎臓、脾臓、または肝臓が見える場合は、スキャン位置が頭側に寄りすぎています。プローブを膀胱に近づけて再配置し、画像を保存してください。次に、同様の方法で対側の子宮角を撮影します。超音波フレームが妊娠部位または着床部位の中心にある時に画像をフリーズさせ、解析用に保存します。保存した画像を用いて、高エコーの脱落膜反応をマーカーとして着床位置を測定します（この操作は保存時に行うか、後で行ってください）。計測ツールを手動でクリックし、着床部位の場所をクリックします。次に、カーソルを次の移植部位までドラッグして再度クリックし、線を描きます。すると、ソフトウェアに線の長さが表示されます。すべての移植部位の測定が完了したら、同様の手法を用いて、胎嚢サイズと胎児極サイズの測定に進みます。2次元イメージングの後、目的とする3次元画像のほぼ中心にあたる領域にプローブを配置します。例えば、リンゴを3次元でイメージングする場合は、芯の部分にプローブを配置します。プローブが適切に配置されたことを確認し、3次元データを取得します。3D電動ステージは、一連のステップまたはフレームで、子宮を横切ってこの距離を移動します。スキャンを取得する際は、目的の構造がスキャン内に完全に収まっていることを確認してください。スキャンの収集後、画像処理のためにデータを読み込みます。処理方法としてパラレル（parallel）および回転（rotational）メソッドを選択します。これにより、すべての3D画像フレームが1つの3Dボックスにロードされます。次に、ステップサイズとして0.08 millimetersを選択し、画像ブロックの端から開始してすべてのフレームをスクロールし、データの構成を確認します。その後、スタックの端から開始し、目的のオブジェクトの輪郭を手動でトレースします。次に、次のフレームに進み、オブジェクトの輪郭を再度手動でトレースします。すべてのフレームの手動アノテーションが完了するまで、このプロセスを繰り返します。完了後、「finish」をクリックすると、3D画像とオブジェクトの体積の算出結果が得られます。画像については、メッシュオーバーレイかソリッドオーバーレイのいずれかを選択してください。次に、明快さを期すために、周囲の画像情報を保持するか削除するかを選択します。高周波超音波を用いることで、受精後わずか5.5日という早い段階で着床部位の発達を検出することが可能です。より明るい高エコーの脱落膜化した子宮内膜を着床部位の指標として、受精後6.5日における着床部位の数と部位間の間隔を定量化します。妊娠が受精後7.5日に進むと、より暗い低エコーの胎嚢と胎児極の両方が容易に識別できるようになります。受精後6.5日のマウス子宮の3次元再構成を、メッシュ形式およびソリッドオーバーレイ形式の両方で作成しました。受精後7.5日目においても、3Dスキャンは同様に有用な結果を示しました。このビデオを視聴することで、妊娠の状態を中断することなく評価するために、2Dおよび3Dの両方で正確な超音波画像を取得する方法を十分に理解できたはずです。熟練したユーザーが行った場合、2Dおよび3Dの両方での超音波画像取得に要する合計時間は、約10〜20分です。この手順を行う際は、動作を小さく、少しずつ行うことが重要です。この手法により、マウスにおける正常および異常な妊娠表現型の研究が可能になりました。

a-novel-use-three-dimensional-high-frequency-ultrasonography-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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心血管イメージング (30/45 MHZ) の高周波超音波を用いた胎児マウス

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水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

学ぶマウスの早期妊娠を高周波超音波で三次元的にモニタリングする手法。非侵襲的に着床後の発生を追跡し、生殖生物学研究における縦断的データ収集を可能にする。

マウスの早い妊娠の特性の三次元の高周波超音波の新規な使用

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