Name: アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶアクリルアミドゲル電気泳動法によるDNAポリメラーゼ活性測定。近赤外蛍光標識DNAを用いて単一ヌクレオチドレベルでDNA合成の限界ステップを可視化し、修飾DNAの影響を解析する。

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この仕事はだった科学の進歩 (コットレル大学学者賞 #22548) の研究株式会社トライリンク バイオ (ResearchReward グラント #G139) でサポートされています。

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、DNA ポリメラーゼを介した DNA の合成を特徴付けるアッセイを説明しました。近赤外線標識 DNA プライマーを使用し変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、異なるサイズのオリゴヌクレオチドを解決する、我々 は合成の正確な測定を有効にするオリゴヌクレオチドの単一のヌクレオチドの解像度を取得できます。これらのアプローチは、酵素 (セクション 2.1) の全体の活動を計測するかまたは個々 の手順 (手順 2.1 を次に注意) のミカエリス-メンテン型のパラメーターを測定するために使用できます。私たちの研究室は最近使用したこれらの両方以前進化した酵素9の特徴し同様、合理的設計酵素10。
ここで説明した私たちの試金は非放射性 DNA ラベルの使用で従来の方法によって異なります。歴史的に、放射能は、放射性リン ラベル11,18を使用して得ることができる高い感度のた...

DNA ポリメラーゼは、正確かつ効率的な DNA 合成を行い、ゲノムの整合性の維持に不可欠な。エラーすることがなく何百もの 1 秒あたりのヌクレオチドを合成する能力も分子生物学とバイオ テクノロジーの DNA ポリメラーゼの不可欠なツールになります。ただし、これらのプロパティも M DNA 基板上へのアプリケーションを制限します。一般的に言えば、自然の DNA ポリメラーゼを合成できない多くの可能性のある貴重な DNA の M 基板可能性が高いため生体内で非標準基板の使用に対する高選択的圧力に。多くのグループが進化の M DNA 合成1,2,3,4、5のことができる突然変異の DNA ポリメラーゼを生成する方法を開発しています。これらの努力は、DNA6,7,8のバイオ テクノロジーの有用性を拡大しています。
M-DNA を合成する DNA ポリメラーゼの変異体の能力を評価する私たち9,10, その他11,12,13通常使用 DNA の生体外の測定本稿で説明するポリメラーゼ活性。これらの実験で DNA ポリメラーゼが二重標識プライマー/テンプレートとヌクレオシド三リン酸基板; 共同培養製品は、ゲルの電気泳動によって評価されます。実験の具体的な質問、突然変異の DNA ポリメラーゼ、変更されたプライマー、によって修正されたテンプレートまたは変更されたヌクレオシドの三リン酸塩使用できます、変異体酵素活動の体系的な生化学的評価を有効にします。
歴史的には、これらの試金は DNA 合成; を追跡する 5' 放射性ラベルに頼ってきた最も一般的に、 32P、 33P が使用されています。通常、ラベル付けには、T4 ポリヌクレオチド キナーゼ11を使用して実現されます。ただし、有限の存続期間、放射性ラベル及びその安全な処分のコストが比較的高いため当社グループは代わりに分類される DNA 合成 5' 近赤外蛍光を使用します。比較的低コストの近赤外ゲルの撮像素子を使用して、同様の検出限界放射性ラベル (未発表結果) を使用して事前研究を観察しています。過去の観測9、正常に再現しております、我々 はない前に測定した速度定数 (結果は未発表) で大規模な定量的な違いを観察しています。
DNA のサイズとしたがって、DNA 合成の範囲を分析するには、我々 はサンガー シーケンス14キャピラリー電気泳動15の出現の前に、のもともと開発されたポリアクリルアミドゲルの電気泳動方法に依存します。分離や移動の距離は、分子量の測定として使用できます。大判、ポリアクリルアミドゲル垂直は単一のヌクレオチド分解能、さまざまな長さのオリゴヌクレオチドを DNA の定量的観測を実現できます。
総称して、これらの実験は、ポリメラーゼ特性に対する堅牢な方法です。時間のため反応、準備とケアの敏感な性質は再現性のある結果を達成するために必要です。さらに、アクリルアミド ゲル多数 DNA 変更、他の反応単一ヌクレオチド分解能でと同様、DNA 合成を測定する非常に効果的な方法ですが、技術的に困難な場合ができます。ここのプロトコルがうまくいけば、ユーザーは最も一般的なミスを回避しながらこれらの実験を実行するを有効にします。

<table><tbody><tr><td>トリスHCl</td><td>プロメガ</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>プロメガ</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214-500</td><td></td></tr>アセ<tr><td>チル化BSA</td><td>プロメガ</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(すなわちDTT)</td><td>リサーチプロダクツインターナショナル</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(すなわちEDTA)(0.5M溶液)</td><td>シグマ</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムア</td><td>クロス</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>オレンジG</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>O3756</td><td></td></tr>ブロ<tr><td>モフェノールブルー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP(リボNTP)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>45-001-341(343、345、347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP(その他すべての修飾NTP)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>アソート</td><td></td></tr><tr><td>プライマー1</td><td>IDT DNA / TriLinkBiotechnologies</td><td>カスタムシンセシス</td><td>IR700色素を使用しており、これはカスタム合成として購入できます。通常、精製されたオリゴヌクレオチドHPLCを購入します。配列は5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAG</td></tr><tr><td>テンプレート1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>カスタム合成</td><td>です 私たちは通常、精製されたオリゴヌクレオチドHPLCを購入します。シーケンスは5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCAGTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr>アクリル<tr><td>ア</td>ミド<td>研究製品国際</td><td>A11405</td><td>38.67%アクリルアミドと1.33%ビスアクリルアミド</td></tr><tr><td>トリス/ホウ酸塩/ EDTA(TBE)固体</td><td>研究製品国際</td><td>T22020</td><td></td></tr>尿<tr><td>素超高純度</td><td>研究製品国際</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>ゲルテープ</td><td>CBS科学</td>です<td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>大型ホワイトスプリングクランプ ポリプロピレン</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm スペーサー</td><td>CBS サイエンティフィ</td>ック <td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 ノッチ付きガラスプレートセット</td><td>CBS科学的な</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>くさびの版の分離器</td>の <td>CBSの科学</td>的な<td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>のゲルの電気泳動のための櫛</td><td>CBSの科学的な</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>ゲルの電気泳動の装備</td><td>CBSの科学</td><td>的なSG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>の超純水</td><td></td><td></td><td>私達はMillipore</td></tr><tr><td>のDNAのポリメラーゼ</td><td></td><td></td><td>からのMilli-Qシステムを使用しますこれらは、公開されたプロトコルを使用して私たちの研究室で準備されています。</td></tr></tbody></table>

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 dna を用いた dna ポリメラーゼ活性測定法

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

酵素、堅牢な定量的メソッドがネイティブと組み換え酵素の特性評価のため必要です。DNA ポリメラーゼの DNA 合成は、体外DNA 合成法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動が続くと言えます。この試金の目標は、変更された DNA (DNA) と自然な DNA の合成を定量化することです。これらのアプローチは単一のヌクレオチド分解能、酵素オリゴヌクレオチド合成時の個々 のステップの観察とオリゴヌクレオチドを解決する場合に特に便利です。これらのメソッドは、DNA 合成の個々 のステップ、DNA 合成と DNA 結合親和性の誤り率の定常状態速度定数の測定などの生化学的および生物物理学的プロパティの配列の評価に適用されています。使用して、変更されたヌクレオシドの三リン酸塩に限らず、(NTP) は、M-DNA および/または突然変異 DNA のポリメラーゼ、ペアを効果的に評価できる基板 DNA ポリメラーゼの相対的なユーティリティを含むコンポーネントを変更しました。ここでは、我々 は非伝統的なプライマー DNA の分類の近赤外蛍光標識 DNA などの戦略に合わせて行う必要があります変更を含め、自身を分析を詳しく説明します。また、注ぐアクリルアミドゲルの重要な技術的なステップの詳細な実行して、することがあります技術的に挑戦的です。

全体的な活動 (セクション 2.1、図 1で説明) と定常状態速度論 (セクション 2.1、図 2の結論のノートで説明します) の質的評価の成功ポリアクリルアミド ゲルの分析が表示されます。失敗ポリアクリルアミド ゲル分析している (図 3)。
市販のはしごや分子マーカーを使用しないことに注意してください。時折、我々 は分子マーカーを作成するのに知られていたポリメラーゼ基板組み合わせを使用ただし、別の修正されたヌクレオチドの非常に異なる電気泳動移動度, オリゴヌクレオチドの長さが異なる塩基配列構造の比較を不適切なことを注意してくださいすることが重要です。
...

このプロトコルでは、電気泳動、ゲル画像を用いた近赤外蛍光に分類された DNA に変化の観察を通じて変更された DNA の DNA ポリメラーゼの合成の特性について説明します。アクリルアミドゲルはサイズに応じて異なる速度で移行短い核酸の分離の高分解能イメージングに使用されます。

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

本手順の総合的な目的は、単一ヌクレオチドレベルでDNAポリメラーゼ活性を解析することです。この手法は、DNA合成のどの具体的なステップがDNA修飾によって制限されるかなど、DNAポリメラーゼ分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、単一ヌクレオチドの変化を観察できるため、ポリメラーゼ活性を精密に観察できることです。本手順を実施する際は、事前の計画を立てることが重要です。多くのステップにおいて時間に制約があります。本手順を開始する前に、まずテキストプロトコルに記載されている通り、バッファー、DNA二重鎖ミックス、およびタンパク質希釈液を調製してください。次に、ドライバスの温度を50 °Cに設定します。2X dNTPs 25 µLを含むマイクロ遠心チューブに、アニール済み二本鎖ミックス 24 µLを加えます。その後、この混合液 9.8 µLを、クエンチバッファー・オレンジ 20 µLを含むマイクロ遠心チューブに移し、酵素なしコントロールを調製します。次に、二本鎖dNTP混合液に50X酵素を0.8 µL加えます。大容量ピペットを使用して、溶液を十分に混合してください。ドライバスでインキュベートします。各反応混合物から10 µLを分取し、20 µLのクエンチバッファーオレンジを含むマイクロ遠心チューブに加えることで反応を停止させます。テキストプロトコルに記載されている通りに、ゲル電気泳動用のアクリルアミドミックスを調製します。次に、33 cm × 42 cmのゲルプレート2枚を石鹸と水で十分に洗浄します。各プレートの表面をペーパータオルで拭き取り、残りの部分はデリケートタスクワイパーを使用して乾燥させます。乾燥させたプレートを70% ethanolでリンスし、再度タスクワイパーで拭き上げます。その後、手袋を着用した手を脱イオン水で洗い、濡れた指を使って0.75 millimeterスペーサーを軽く濡らします。ノッチ付きプレートの端にスペーサーを配置します。タスクワイパーを使用して、プレートに飛び散った水分を拭き取ります。プレートを重ね合わせ、上部を除いた底部と側面をゲルテープで覆います。テープが均等に配置され、しっかりと密閉されていることを確認します。カミソリを使用してテープの両端をカットします。その後、ゲルの底部にさらに一層のテープを貼ります。試薬を準備した後、洗浄ボトルを用意し、先の尖った漏斗を取り外します。メスシリンダーを用いて、水 125 milliliters を加えます。その後、油性マーカーを使用して、ボトルの外側に水位の印を付けます。水を捨てます。次に、テキストプロトコルに記載されている通り、シンクの横にコルクリングとプレートサンドイッチを準備します。シンクの反対側に、空のスプレーボトルと調製済みのAPSおよびTEMED溶液を置きます。必要なウェル数のウェルコームと4つのクランプを近くに準備します。次に、スクイートボトルにマークされたレベルまで20% アクリルアミドゲル溶液を加えます。同時に、ポリアクリルアミドゲル溶液に120 µLのTEMEDと600 µLのAPSを加えます。APSをさらに600 µL迅速に加えます。速やかに洗浄瓶のキャップを閉め、円を描くように混ぜ合わせます。次に、プレートサンドイッチをシンクに入れます。ボトルにゆっくりと一定の圧力をかけながら、ゲル溶液が安定して流れるように注ぎ始めます。ゲルが切り欠き部分まで達し、切り欠きの端からわずかに溢れるまで注いでください。プレートを傾けて気泡を取り除きます。次に、プレートサンドイッチにウェルコームを装着します。コームにクランプをかけ、ウェルが均等に配置されるようにしっかりと押さえます。スクイートボトルに残っているゲル溶液は、速やかに適切な廃棄容器に廃棄してください。ボトルを洗浄するため、 squirt nozzle を使用して脱イオン水で3回すすぎます。まず、プレートサンドイッチからすべてのバインダークリップを取り外します。カミソリを使用して、端からゲルテープを切断して取り除きます。ペーパータオルと水でガラス面を拭き、重合したゲルの残留物をできるだけきれいに除去します。エッジ部分に残っているゲルは、カミソリを使用してかき出します。次に、ウェルコームを両側から均等に押し、取り出します。カミソリを使用して、プレートサンドイッチの上端にある余分なゲルを切り落とします。次に、プレートの切り欠きに沿って切り込みを入れます。シリンジを用いて脱イオン水でウェルを洗浄し、破片を取り除きます。各ウェルに水が満たされ、過剰に重合したゲルによって塞がれていないことを確認してください。次に、長いプレートが外側を向き、切り欠き部分が内側を向くように、プレートサンドイッチを装置に設置します。プレートサンドイッチとアルミニウムプレートを一緒にし、装置に固定してください。プレートの外側にクリップを追加し、均一な泳動を促進させます。プレート底部の切り欠き部分と上部のウェルが十分に浸かる量までTBEバッファーを加えます。プレートを温めるため、50 Wで20分間ゲル電気泳動を行います。その後、シリンジとTBEバッファーを使用してウェルを洗浄します。ウェルから残存するバッファー塩が完全に除去されるまで、シリンジによる洗浄を数回繰り返してください。次に、テキストプロトコルに記載されている通りに、両側の最外側レーンを準備します。ブロモフェノールブルーを含む95%formamideを3 µL、ゲルの適切なウェルに加えます。すべてのサンプルをロードし、1分間静置します。装置と電源を接続した後、出力を50〜55 Wに設定します。ゲルを約3時間、またはブロモフェノールブルーの染料前線がゲルの少なくとも3分の2まで移動するまで泳動します。その後、テキストプロトコルに記載されている手順に従ってゲルのイメージングを行います。本研究では、DNAポリメラーゼを介した修飾DNA合成を特性解析するためのアッセイを開発しています。全体の活性に関する定性的な評価に成功すると、個々のバンドが明瞭で均一に現れます。活性は、生成物の長さと、標識されたプライマーのうちどれだけの割合がより長い生成物に変換されたかによって判断されます。見ての通り、E6とE5が最も活性の高い酵素であり、E4とE1が最も活性の低い酵素です。これらの手法を用いて、定常状態速度論による定量分析を行うことも可能です。NおよびN+1の産物のみが合成されるため、単一のイベントを正常に定量化できます。ここでの基本的な手法は、ポリメラーゼ以外の多くのDNAまたはRNA修飾酵素の研究にも応用可能です。

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このプロトコルは、小さなDNAおよびRNA基質上のポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)のキナーゼ活性を測定するための非放射性アッセイを記述する。...

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。...

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

ここでは、核酸代謝酵素をアッセイするためのプロトコールを、リガーゼ、ヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ酵素の例を用いて提示する。このアッセイでは、蛍光標識および非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、RNAおよび/またはDNAの損傷または経路中間体を模倣した二本鎖を形成することができ、酵素の挙動の特性評価を可能にします。...

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

この研究は、DNase 活性の検出と定量的評価のためのシンプルでユーザーフレンドリーなレシオメトリック FRET...

レシオメトリック蛍光共鳴エネルギー移動によるDNase活性の評価

このプロトコルは、CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しのライブ可視化のための単一分子アッセイの実施を示しています。(1)DNA基質の調製、(2)蛍光標識 されたDrosophila melanogaster...

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

このプロトコルは、蛍光顕微鏡法に基づく単一分子DNA複製アッセイの概要を示しており、DNAポリメラーゼとG-四重鎖構造などの障害物との間の相互作用をリアルタイムで可視化することができます。...

G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

学ぶアクリルアミドゲル電気泳動法によるDNAポリメラーゼ活性測定。近赤外蛍光標識DNAを用いて単一ヌクレオチドレベルでDNA合成の限界ステップを可視化し、修飾DNAの影響を解析する。

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

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