Name: 自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 学ぶ 微生物培養培地の最適化手法。Kriging実験計画法と自動マイクロバイオリアクター技術を組み合わせ、異種タンパク質生産の効率を向上させる反復型ワークフローを解説します。

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なると見込まれて科学センターの科学的な活動は省の革新、科学、研究によって NRW Strategieprojekt BioSC (第 313/323-400-002 13) の枠組みの中で財政的に支えられました。著者は、省イノベーション ・科学と研究のノルトライン = ヴェストファーレン州・ ラース Freier 舍大学院クラスター産業バイオ テクノロジー内への奨学金のハインリッヒ ・ ハイネ大学デュッセルドルフにありがとうございます。さらなる資金提供を有効スペース プログラム ドイツ ヘルムホルツ協会、"微生物バイオ プロセス研究室-A ヘルムホルツ ・ イノベーション ・ ラボ」をサポートするための「ヘルムホルツ革新ラボ」から受信しました。

著者が明らかに何もありません。

提案するプロトコルの一般的な性質により、さまざまな adaption、例えば、留学その他微生物式ホスト9,47,48,49,50,51、またはターゲット蛋白質の糖鎖修飾パターンまたは二硫化物結束のようなその他のプロパティを最適化します。プロトコルは利用可能な実験装置に適合させる必要もあります。MBR システムの統合により、時間の節約を可能にする実験的スループットの向上します。ただし、MBR システムによって完全に計測し制御可能なバイオリアクターを交換する際の結果スケーラビリティ見なす必要があります8,37,52,53。DOE の方法論と数学的モデリングの使用は、効率的な実験計画およびモデル ・ ベースのデータ解釈1554研究目的に関する測定データの情報量を最大化するのに役立ちます。
メソッドへの変更 多目的利用や拡張可能なロボットの液体処理本研究で使用されるのようなシステム、横に特筆すべきはいくつかの小さい液体処理システム市販このタスクを実行することができる、内部に配置することができますがあります。層流仕事のベンチ。自動分注装置が使用できない場合 DOE 計画に従って異なるメディアの組成も手動ピペッティング単一またはマルチ チャンネル ピペットの使用によって実現できます。マニュアルの準備がよりエラーが発生しやすいが、かなり長い時間の高度に集中作業が必要になりますので様々 なメディア作品の数を減らすを準備することをお勧めします。
採用の MBR システムの機能によって対応する栽培プロトコルが異なります。例えば、バイオマスの形成のオンライン測定が利用できない場合、成長実験が完了した後バイオマス濃度を測定するための十分な場合があります。オンライン監視との組み合わせでの pH と溶存酸素は、いくつかの MBR システムで実装されている安全で成長彩度を定めることができます。原則として、インキュベーター、MBR システムを使用せずに収納しただけで Mtp の成長実験を実施できます。この場合、適切な栽培条件を持って確保する: (1) 酸素限定栽培は適切な振動周波数と振動直径、例えば、96 または深い 24 の正方形との組み合わせでの適切なジオメトリを Mtp を使用して避けることができます。ウェル プレートはそれぞれ 1,000 rpm を 3 mm または 25 mm スローで 250 rpm で運営しています。重要なより低い達成可能な最大酸素転送速度、低い主要な炭素源する必要があります集中。ブドウ糖 10 g/L の使用だった採用の栽培条件の酸素制限を防ぐために適切な前述のように、本研究では、(MTP 文化バイオマスと製品の定量化のためのサンプリング 2) は必要最小限にとどめます。MTP は揺れインキュベーターから削除されるたびに酸素の移動はすぐにブレーク ダウン不利な栽培条件で可能性があります。(3) での著者の意見、これらのデバイスがこの目的のために開発されなかったと MTP 読者栽培装置としての使用は推奨されません。たとえば、振動力学試薬添加後マイクロ プレートの時折ミキシングのため造られた、したがって、日間連続揺れ続くロングランの堅牢性に欠けます。さらに、微生物の耕作のために必要十分な力の入力は、これらの読者に認識できません。光学濃度の測定値の統合短い時間間隔は酸素制限の繰り返された周期の揺れの動きの停止必要です。さらに、長い栽培期間にわたってこのようなシステムで蒸発は結果を歪曲します。文献22,23,24,25,26 Mtp を使用して微生物の耕作のための驚くほど複雑なトピックの詳細については、リーダーは呼ばれますとそこを参照します。
他の考慮事項 高速化反復最適化の手順には、製品の定量分析法を慎重に選択することをお勧めします。速くて簡単な方法は、反復実験的なデザイン戦略を許容実験誤差と精度と正確さを犠牲にして優先されるべき。しかし、最終的な結果より複雑になる可能性が十分に精密で正確な製品数量化に対して検証する必要があります。一般に、慎重な評価と意思決定研究手続きについての研究では、初めに努力を必要とするが、ルーチン メソッドを確立した後、長期的に支払います。
最適化中にすべての実験を比較する参照実験を定義するを強くお勧めします。つまり、測定出力と同様、適用中の成分濃度基準値で割ることによって正規化されます。このように、それぞれの適用し、測定値が基準値の x 倍として解釈できます。プレート間にアカウントのバリエーションを考慮するには、5 つの参照実験は各プレートで行われます。測定結果の平均値は、正規化されます。
それすることができます一般的には保証されません開発中も他の系統に最適であること。ただし、改良培地最ももする可能性が突然変異誘発の研究 (から得られる単一のアミノ酸置換による酵素バリアントを生産するとき小さい遺伝の相違、例えば、式系統の育成に適したただし、1 つの点突然変異に記載されている効果細胞の代謝と異種発現性能55,56)。この場合、提案するプロトコルは、高スループット式上映57のプロトコルに続いて、最初のステップをすることができます。対応するバイオ プロセス条件の最適化されたメディアを検証するスクリーニング、マイクロ スケールでのキャンペーンのクローン識別異なるトップ以降フェッド バッチ培養スケール アップと媒体開発のプロトコルを使用する場合異なる餌戦略と栽培メディア52,58の実行者。さらに、導入された KriKit36は一般的に改善された総合的なバイオ プロセスの最適化に貢献できます。ごく最近、ツールの能力は両方のアップ ストリームおよびダウン ストリーム プロセス59,60の最適化のために重要となる40多目的最適化をサポートする拡張されました。

現代組換え遺伝子技術は製薬業界、飼料、有機化学、食品加工1,2,3で様々 な用途に技術的な酵素の広い使用をできます。一括大量に技術的な酵素の生産は工業バイオ テクノロジーと最適化された組換え蛋白質の生産のための主要なトピックおよび両方のひずみ、バイオ プロセス工学が必要があります。効率的に設計された生産菌株の世代の異なる遺伝的ライブラリが使用可能、例えば、バランスの取れた遺伝子式4または高められた分泌効率5。
コリネ型細菌のアミノ酸工業規模6、7の主要な生産者、組換えタンパク質8 の分泌生産のための魅力的な非従来型式ホストを表します ,9。両方の一般的な分泌 (Sec) とツイン アルギニン転座 (Tat) 経路c. 型に存在しており、組換えタンパク質分泌10は正しく適用されました。アミノ酸 g/L 量11と大規模は、バイオ プロセスの不均一性に関する素晴らしい保全性のタンパク質を分泌する能力と同様、工業的規模で生産に関するバイオ プロセス工学の豊富な経験耕作1213,,は、工業規模での異種の蛋白質の分泌生産のための有望なプラットフォーム生物C. 型を確認します。
栄養媒体の最適化は微生物システム14,15,16,17したがって、培地の調整と組換えタンパク質の生産を改善するために知られています。組成物は、バイオ プロセスにやりがいのあるステップに関して最適な生産性18,19,20,21の開発。微生物培養22,23,24のマイクロタイター プレート (MTPs) のアプリケーションの集中的な研究開発と微生物培養25 用 Mtp の設計のための道を開いた、制御27,2826と MTP ベース microbioreactor (MBR) システムのオンライン監視と環境の開発。Mbr は、試験栽培スループットの大幅な向上を有効にします。その上、原子炉、バイオリアクター、例えばバブル列または攪拌槽の他の種類に起因する MBR システムで微生物バイオ プロセス最適化29,30,31、利用 32。
一般に、最適化スタディの恩恵増加の実験的スループット、DOE の方法論、設計変数間の相互作用を評価や高次元探索空間の削減などとの組み合わせでさらにもっと強力になります。その結果、MBR システム、ラボの自動化と DOE の併用はバイオ テクノロジー8,16,33,34,35で強力な方法であると証明しています。
メディアの最適化のためのプロトコルは、最新のラボの自動化、オンライン処理の監視、クリギング ベースのデータ解析・実験デザインと MBR 技術を組み合わせることが提示されます。クリギング手法で実装されている MATLAB ツールボックス (「KriKit」) をダウンロードして使用することができます充電36の無料。アプリケーションの例としては、CgXII 最小培地の組成を最適化することによってc. 型と分泌型緑色蛍光タンパク質 (GFP) 生産の最大化が表示されます。GFP 抗体は、それは簡単に定量化することができ、MBR システム37,38,39の研究のためのモデル蛋白質として広く応用されて最適化目標として選ばれました。
提示されたフレームワークは、図 1に示す 4 つの手順に分かれています。手順は、ボックス フレームで示されます、プロトコルのセクションに対応しています。プロジェクトの目標を定義し、必要な方法を決定するのには、まず (図 1 a) です。DOE の方法論、MBR 技術、およびラボの自動化の組み合わせにより、強力なデータ処理を要求する実験的スループットの増大です。(図 1 b) の 2 番目の手順は、最適化目的で高い影響力を持つ (すなわち、メディア コンポーネント) に配慮した設計変数の検出を目指しています。これは興味の設計変数の数が減少に します。(図 1) の 3 番目の手順では、残りの設計変数と興味の目的と機能の関係の詳細な調査のための反復的な最適化を装備されています。順次拡張データ セットを使用して、Kriging アプローチが未計測の位置で実験の結果を予測するために適用されます。反復的なサイクルは、クリギング モデル最適または高原を十分な精度で予測するとすぐに停止します。識別された最適の周りさらに感度分析から始まる第 4 ステップ (図 1) の結果を確認します。当初、非感受性コンポーネントがないことが判明機密も最適の領域で、これが 3 番目のステップで反復最適化処理中に真保持と仮定するが妥当です。その後、活性測定法や Sds-page などの直交法の適用による最適化の結果を確認する勧めします。
提案するプロトコルの一般的な性質により異なる実験装置、他の式のホスト、およびさらにバイオ プロセスと同様に、選択のターゲット蛋白質への簡単な適応の pH 値や栽培温度のような変数であります。さらに、タンパク生産率、特定の収量や製品の品質のような他の最適化目標を他の最適化研究の範囲に合わせて選択できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
図 1: 最適化スタディのワークフロー 。4 フレーム ボックスは、プロトコルは、「妊娠の研究と定義の方法」(セクション 1)、「感度分析」(セクション 2)、「反復最適化」(セクション 3)、「検証」(セクション 4) のセクションに対応しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>フラワープレート</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>BioLector デバイスでの栽培用</td></tr><tr><td>シーリング ホイル</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>フラワープレート用 滅菌シーリング</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml;lich</td><td>n/a</td><td>無料、MATLABのインストールが必要</td></tr><tr><td>Janusピペッティングロボット</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>「WinPrep」ソフトウェアのインストールを含む</td></tr><tr><td>12カラムディープウェルマイクロプレート</td><td>E&K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>中型ストック溶液用容器</td></tr><tr><td>96 ウェル マイクロプレート、透明、F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>ブラッドフォード プロテイン アッセイ</td></tr><tr><td>用&micro;クリア96ウェルマイクロプレート、黒体、透明Fボトム</td><td>グライナー</td><td>655087</td><td>無細胞上清の蛍光測定用</td></tr><tr><td>ピペット研究&nbsp;さらにマルチチャンネルピペット</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>マイクロプレートによる手動リキッドハンドリングを容易にします</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp;プレキャストゲル</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>無細胞スーパーナンタントのSDS-Page解析用</td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a GFP</td><td>遺伝子とB.subtilis由来のPhoDシグナルペプチドを融合させたpEKEx2プラスミドを発現インサートとして保有しています。プラスミドはカナマイシン耐性を提供します。Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3)、633&ndashによって記述および公開されました。42 (2007年)</td></tr></tbody></table>

自動 microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

工業バイオ テクノロジー微生物生産セル工場を使用してのコア ・ ビジネスは歪みの反復的なプロセスとバイオ プロセス条件の最適化です。1 つの重要な側面は、興味の製品の微生物の形成に最適な環境を提供するために培地の改善です。メディア構成も大幅にバイオ プロセスの全体的なパフォーマンスに影響を与えることができますそれをも受け入れられています。栄養媒体の最適化は組換え蛋白質を改善するために知られている微生物システム、従って、この生産バイオ プロセス開発のやりがいのあるステップであります。ただし、非常に頻繁に標準的なメディアのレシピは文学から取得されます培地のオーダーメイド設計は microbioreactor 技術サポートと同様、十分な栽培スループット、高速製品分析を要求する面倒な作業なので液体で信頼性を有効にするのに実験室ロボットによってステップの処理。さらに、高度な数学的手法が合理的計測データを分析し、最適な情報量を達成するために並列実験を効率的に設計のため必要です。
提案するプロトコルの一般的な性質は異なる実験装置、他の式のホスト、およびさらにバイオ プロセス パラメーターと同様に、興味のターゲット蛋白質に簡単な適応のためことができます。また、他の最適化研究の範囲に合うようにタンパク質生産率、特定の収量や製品の品質のような他の最適化の目標を選択できます。応用クリギング ツールボックス (KriKit) は、一般的なツールの設計の実験 (DOE) 改良された総合的なバイオ プロセスの最適化に貢献します。また、上流と下流の両方のプロセスを最適化する上で重要なことができる多目的最適化をサポートしています。

分泌された GFP の価を最大化するために導入されたプロトコルが適用されました。具体的には、GFP 抗体栽培の 17 h は最適化目的として選ばれた後。GFP のオンライン蛍光検出は、シンプルな製品数量を許可しました。ただし、GFP 参照栽培からデータ信号の正規化は、再現性と結果の比較可能性を確保するために不可欠です。メディア コンポーネントの事前選択は、セクション 1 で説明したように理性的な基礎で実行されました。第 1 節の指示に従って実験を行なった: ぬれた実験室プロシージャのパラメーターは、一貫性と再現性を確保する全体の研究用に定義されました。
セクション 2 で説明した、最初のスクリーニングはさらより詳細な研究のための最適化の目的に重大な影響を示す適切なコンポーネントを識別するために行った。MTP ベース MBR システムでは、48 実験は並列で実行することができます。11-6小数 1 MTP (48) 並列実験の最大可能な数やメディア コンポーネント (11) は 2IVの総数を考慮して適切な選択を設計します。この実験的なデザイン 32 実験と調査のメディア コンポーネントのそれぞれの主な効果の推定を可能しています。残り栽培井戸 (16) は、再現性と位置の効果を評価するために参照媒体実験の複数のレプリケートに使用されました。一度は、各実験を実施 (ないレプリケートします)、参照実験 (5 レプリケートします) を除いて。
表 1は、スクリーニング分析の結果をまとめたものです。考慮した濃度範囲でメディア コンポーネントの大半の変化は目的の顕著な効果と表示されませんでした。コンポーネント NH4+は、Ca2 +と Mg2 +が最強の肯定的な傾向を示す中の強い負の効果を示しています。Mg2 +の効果は、現在の濃度範囲の重要ではありませんが、広い濃度範囲のかもしれません。その結果、NH4+メディアから省略して Ca2 +と Mg2 +の実験での効果を検討することになった。
セクション 3 では、Ca2 +と Mg2 +の濃度を変えながら GFP 蛍光信号を最大化するために使用されている反復最適化手順について説明します。イテレーション 1、NH4+を省略することができる仮説がテストされました。Ca2 +と Mg2 +の濃度範囲は、スクリーニング分析から採用されました。NH4+の最小の濃度がゼロに設定された、最大濃度は、スクリーニング試験から採用されました。次の実験では、成分濃度が 27 実験の結果、定義濃度範囲内 3 グリッド x 3 x 3 に分散されています。参照中の 5 つの複製が含まれてすべての耕作中に役立った内部標準として、MTP にポジショニング エフェクトが発生していないことを確認します。残りの 16 の井戸の NH4+、Ca2 +Mg2 +濃度特定範囲内ランダムに分散。
図 5Aは、最初のイテレーションの結果を可視化します。軸ラベルは、元の参照の培地に使用する成分濃度を参照してください x の Ref によって示される。青い面を表すクリギング補 KriKit ソフトウェアを使用して計算されました。各表面は NH4+の相対的な濃度レベルに関連付けられている (ダークブルー: 0 Ref、格子縞 x: 1 Ref、ライトブルー x: 2 Ref x)。この視覚的な表現では、NH4+を省略に有利だと明らかにします。補間サーフェスは、濃度の増加とのすべての飛行機上昇として Mg2 + Ca2 +、肯定的な効果も表示されます。
イテレーション 1 の結果に基づき、決定された最大濃度の倍増によって濃度範囲の Ca2 +と Mg2 +を展開し、図 5を参照してください実験デザイン ウィンドウの右上隅にシフトB。 この範囲内濃度 6 x 6 のグリッドに分布していた。最適なクリギング内挿結果につながる完全な集中の範囲で均等に分布をこうなります。図 5結合されたデータに基づくクリギング補間プロットBショーは両方のイテレーション (赤い点と黄色の正方形) で測定。両方、Ca2 +と Mg2 +、その濃度の増加の肯定的な効果を続けます。したがって、プロシージャは最大濃度の倍増によって繰り返された、したがって、実験的デザイン ウィンドウの右上隅の境界を探るに移されました。
図 6Aは残りの最適化手順の概要を示します。イテレーション 3 まで収集したデータセットの解析では、Mg2 +、すなわち、最適濃度範囲の Mg2 +の肯定的な効果の制限を識別を明らかにしました。したがって Ca2 + (イテレーション 4) のみの濃度範囲をさらに拡大しました。この手順が 2 回繰り返された (イテレーション 5 および 6) GFP 信号の飽和が発見されるまで。この飽和は、セルに利用されている Ca2 +、施用濃度の Ca 塩の沈殿物によって説明されています。
実験結果は、常にノイズによる摂動、結果クリギング内挿が不規則な表示され、目視検査が誤った結論につながる可能性があります。しかし、飽和の gfp のメディア コンポーネントの最適な濃度範囲は KriKit にも実装されている統計的z -テストで確実に識別できます。Z検定は直接、クリギング法、すなわち予測値および予測の不確実性によって提供される組み込みの統計情報を使用します。図 6Bは、識別された高原として決定され視覚化された KriKit ツールボックスの使用を示しています。KriKit ツールボックスは、自由に利用できる36でその機能を使用する方法を説明する詳細なチュートリアルが付属しています。
2 つ以上の関連するコンポーネントがある場合 3 D の可視化が限界に達した。KriKit 映画や「プロット スクリーニング」などの他のいくつかの可能な視覚的表現方法を提供します。定義された濃度範囲内最適な潜在的な場合は、新しい実験自動的に予想される改善40,46を使用して設計されています。予想される改善に基づく実験的なデザインは、KriKit ツールボックスに統合されています。詳細な情報は、ソフトウェアのマニュアルで見つけることが。
前述のパーツ D で反復手順の後結果の検証が行われました。最初の仮定の妥当性は、最適な培地成分を使用して追加の感度解析を実行することによって調べた。関心のすべての初期のメディア コンポーネントが変化したが、Ca2 +と Mg2 +が最適な濃度レベルに設定されました。本研究では、最適な濃度で<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg">= 32 Ref x と<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg">= 6.8 x Ref が選ばれました。検証審査の結果を表 2に示します。スクリーニング (cf. 表 1)、NH 初期の感度と同様に4+まだ、負の影響と残りの効果はまだごくわずか。
容易なアクセスのため栽培懸濁液から GFP 蛍光信号はすべての実験中に細胞外の GFP 抗体を定量化に使用されました。検証のために、GFP 蛍光だった他の測定値に対して検証されます。GFP が Tat 経路を介した分泌されているため蛍光信号内と GFP の細胞外の間で区別できません。したがって、耕作参照媒質と最適化された媒質を使用し再現されました。ブラッドフォードの試金、(半) し, 定量化したタンパク質含有細胞培養上清から蛍光測定、ほか-GFP の質的 SDS ページ15で可視化しました。すべての結果として得られる測定信号が最適化されたメディア参照媒体と比較し、検証と耕作の約 2 倍、分泌性能最適化された媒体の約 100% 向上。その結果、栽培の懸濁液の GFP 特定の蛍光、最適化目的、すなわち、細胞外の GFP 抗体価の適当な測定基準が考えられます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
図 2: 感度解析のボリューム ピペッティング リストからスクリーン ショットします。最初の列内のエントリは、1 つの行のすべてのボリュームに固有識別子を割り当てるこの識別子は、MTP もターゲットの栽培 MTP参考: 図 4C液体ハンドラーの作業テーブルの数です。残りの列は、戻ことにさまざまなソリューション (「Sln-01」「Sln - 15」) のボリュームをエンコードします。1 つの行の累積的なボリュームは最終的な栽培も対応する量に対応します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
図 3: コントロール ソフトウェア「WinPREP」の処理液からのスクリーン ショットします。左: 行の命令コマンド、各原液に戻されるため転送コマンドを含みます。接種追加最後のコマンドの前にユーザー プロンプトが種子培養、ジャストイン タイム テーブルに配置されますように挿入されます。右: 変異株 (12 列のような井戸を用いた 2 つのディープ ウェル プレート)、試薬槽メディア準備ターゲット栽培 MTP や菌、水残りストック ソース実験器具を含む、作業の概略図。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
図 4: 在庫ソリューションのピペッティングのセットアップの詳細なスクリーン ショット集。(A) Fe 株式のピペッティングのコマンドをラップします。ソース実験器具とよくソース内によって示される作業テーブルの読み取りフレームと対応するディープ ウェル プレートの赤い列。先の実験器具や内先井戸は、青枠と MTP ターゲット栽培の青井戸によってマークされます。(B) このステップ (Fe 原液) のピペッティング ボリュームの割り当ての詳細な例ビュー。就航空港数は 48 行がピペッティングのリストから読み取られます。原液がピペッティングのリスト [4] 列にある Fe のすべての先の井戸のディスペンス ボリューム。識別子と図 2参照、転送されずにボリュームないピペッティングのリストの最初の列が含まれることに注意してください。(C) も番号宛先の詳細について。ボリュームの対応する分注リストの行 #1 で書かれては、#1 としてマークされたウェルに戻されます。井戸 #01、08 #、#41 #48 は栽培自体 MTP には印刷も英数字の符号化のための井戸 F08 F01、A08 A01 に対応しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
図 5: 最初のイテレーションからの結果を詳しく説明します。(A) クリギング内挿はイテレーション 1 の実験データに基づきます。赤い点は、データのセットを示します。比較のためすべての 3 つの補間サーフェスは 1 つのプロットの重ね合わせ (ダークブルー: 0 Ref、格子縞 x: 1 Ref、ライトブルー x: 2 Ref x)。結果を別の表現は15を他の場所で見つけることができます。(B) 実験に基づくクリギング内挿はイテレーション 1 (赤い点) と 2 (黄色い正方形) のイテレーションで実行されます。この図に示したデータの部分は、以前に発行された15をされています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
図 6: 繰り返し収集した最適化の結果の描写。(A) 最終クリギング予測モデルします。Z統計に基づいて最適な領域 (赤) (B) の統計的同定-テスト、KriKit によって提供されます。ボックスは、反復的な設計の連続する手順との実験の実行を示します。この図に示したデータの部分は、以前に発行された15をされています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>正規化係数の平均値</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ボー33-</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 感度解析の結果。最大値中央値からそれぞれのメディア コンポーネントの濃度を増加させるときの平均の効果を表す係数。最適な実験設計のためとしては標準的な文献で発見され、標準偏差を表すを使用ここでは、直接参照実験のレプリケーションによる実験の変化。係数の値は、最大値 (0.0422 コンポーネント Ca2 +) によって正規化されました。正規化と絶対係数標準偏差はそれぞれ 0.54 と 0.0226 です。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>正規化係数の平均値</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ボー33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: 最終的な感度分析の結果。最大値中央値からそれぞれのメディア コンポーネントの濃度を増加させるときの平均の効果を表す係数。最適な実験的デザインが使用された、標準偏差のみ最適化された培地成分を用いた実験的変動に依存します。実験の変化は参照媒体を用いた変動と比較して若干増加します。係数の値は、最大値 (0.0106 コンポーネント Mn2 +) によって正規化されました。正規化と絶対係数標準偏差は、それぞれ 3.63 と 0.0385、です。

本稿では、微生物培養メディアのオーダーメイド設計のための一般的なアプローチについて説明します。技術を組み合わせることクリギングを用いた実験設計および microbioreactor 十分な栽培スループット、信頼性や液体メディアをハンドリングの速度向上させる研究室ロボットによってサポートされている反復ワークフローを有効に準備。

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Kringingベースの実験デザインとマイクロバイオリアクター技術を組み合わせたこの反復ワークフローの全体的な目標は、十分な培養スループットを実現することです。この方法は、培養培地の最適化、バイオプロセス条件、菌株表現型解析など、微生物バイオプロセス開発の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを思いついたのは、低代謝物の産生に最適化された培養培地が異種タンパク質の産生にも最適かどうかを自問したときでした。この手法の主な利点は、実験とモデリングをスマートに組み合わせることで、全体的な開発時間を短縮できることです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるRoman Jansenです。この手順は、テキストプロトコルに詳述されている方法の概念と定義を研究することから始めます。ワークテーブル上でストック溶液を保管するためのディープウェルプレートを滅菌するには、プレートを70%エタノールで拭き取り、その後、層流フードで乾燥させます。1リットルあたり25ミリグラムのカナマイシンを含む50ミリリットルのBHI培地に、作業細胞バンクからの1アリコートを接種して、種子培養を開始します。必要なすべての実験器具をロボット作業台に置き、対応する実験器具にストック溶液を注ぎます。次に、培地調製のためのロボットワークフローを開始し、最後のステップである接種が種子培養の開始に間に合うように到達します。約2時間後に種子培養物をサンプリングし、600ナノメートルまたはO-D-600で光学密度を測定することにより、成長を監視します。毎時の成長を引き続き監視します。約5時間後、培養物は3〜4時間の間にO-D-600に達し、主要な培養物への接種に使用されます。種子培養物をリキッドハンドラー作業台に置き、培地調製プロトコルを続行します。接種後、培養マイクロタイタープレートを密封します。次に、密封した培養M-T-PをBiolector装置に入れます。次に、事前定義された培養プロトコルを開始します。必要に応じて、バイオセーフティ規制に従って残りのストック溶液を廃棄してください。次に、ロボット作業台から培養物を播種します。リキッドハンドラーの除染プロトコルを開始する前に、再利用可能な実験器具を清掃してください。17 時間の実行時間後にメイン カルチャを停止し、テキスト プロトコルの説明に従ってデータを処理します。G-F-P力価を定量するには、まず、すべての培養ウェルからの細胞懸濁液を事前にラベル付けされた反応チューブに移します。次に、ベンチトップ遠心分離機を使用して細胞懸濁液を最大速度で10分間遠心分離し、細胞を含まない上清を得ます。次に、各細胞を含まない上清の200マイクロリットルを、底が透明な黒色の96ウェルM-T-Pに移します。適切なマイクロプレートリーダーを使用して、励起波長が488ナノメートル、発光波長が520ナノメートルのG-F-P特異的蛍光を読み取ります。G-F-P蛍光を測定した後、マイクロプレートは、BradfordやB-C-Aアッセイなどの標準プロトコルを使用して、無細胞上清のタンパク質含有量の測定に直接使用できます。最後に、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析に進みます。実証された手順は、1ラウンドの実験を構成し、その結果は、G-F-P信号の最大期待される改善を伴うさらなるラウンドを設計するために使用されます。参照実験は、データの変動性を分析し、実験の外れ値を検出するために、各ラウンドに配置されます。この等高線プロットは、最適化手順の概要を示しています。3回目の反復で収集したデータセットを分析した結果、マグネシウムのプラスの効果には限界があることが明らかになり、最適な濃度範囲が特定されました。そこで、第4回ではカルシウムのみの濃度範囲をさらに拡大することになりました。この手順は、G-F-P信号の飽和が見つかるまで、反復5と6の2回繰り返されました。この飽和度は、細胞が利用できないカルシウムの適用濃度に対するカルシウム塩の沈殿によって説明されます。7回目のイテレーションは、境界をより詳細に探求するために使用されました。飽和G-F-Pシグナルの培地成分の最適な濃度範囲は、統計的なZ検定で確実に特定できます。これは、識別されたプラトーを決定され、Kringingキットツールボックスを使用して視覚化されたものとして示しています。Kringingキットツールボックスは無料で入手でき、その機能の使用方法を説明する詳細なチュートリアルが付属しています。提示されたプロトコールの一般的な性質により、他の微生物発現宿主の研究や、グリコシル化パターンやジスルフィド結合などの標的タンパク質の他の特性の最適化など、さまざまな適応が可能になります。エンブリオンシステムの統合により、実験のスループットが向上し、時間の大幅な節約が可能になります 完全に制御可能で影響力のあるバイオリアクターをアムニアシステムに置き換える際には、結果のスケーラビリティを考慮する必要があります。数学的モデリングと実験計画は、研究対象に対する測定データの情報量を最大化するのに役立ちます。

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出典:ヘメリッヒ、J.ら。自動マイクロバイオリアクター技術を用いた異質タンパク質生産の最適化プロトコル。J. Vis.

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学ぶ 微生物培養培地の最適化手法。Kriging実験計画法と自動マイクロバイオリアクター技術を組み合わせ、異種タンパク質生産の効率を向上させる反復型ワークフローを解説します。

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

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