自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

Kringingベースの実験デザインとマイクロバイオリアクター技術を組み合わせたこの反復ワークフローの全体的な目標は、十分な培養スループットを実現することです。この方法は、培養培地の最適化、バイオプロセス条件、菌株表現型解析など、微生物バイオプロセス開発の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを思いついたのは、低代謝物の産生に最適化された培養培地が異種タンパク質の産生にも最適かどうかを自問

この手法の主な利点は、実験とモデリングをスマートに組み合わせることで、全体的な開発時間を短縮できることです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるRoman Jansenです。この手順は、テキストプロトコルに詳述されている方法の概念と定義を研究することから始めます。

ワークテーブル上でストック溶液を保管するためのディープウェルプレートを滅菌するには、プレートを70%エタノールで拭き取り、その後、層流フードで乾燥させます。1リットルあたり25ミリグラムのカナマイシンを含む50ミリリットルのBHI培地に、作業細胞バンクからの1アリコートを接種して、種子培養を開始します。必要なすべての実験器具をロボット作業台に置き、対応する実験器具にストック溶液を注ぎます。

次に、培地調製のためのロボットワークフローを開始し、最後のステップである接種が種子培養の開始に間に合うように到達します。約2時間後に種子培養物をサンプリングし、600ナノメートルまたはO-D-600で光学密度を測定することにより、成長を監視します。毎時の成長を引き続き監視します。

約5時間後、培養物は3〜4時間の間にO-D-600に達し、主要な培養物への接種に使用されます。種子培養物をリキッドハンドラー作業台に置き、培地調製プロトコルを続行します。接種後、培養マイクロタイタープレートを密封します。

次に、密封した培養M-T-PをBiolector装置に入れます。次に、事前定義された培養プロトコルを開始します。必要に応じて、バイオセーフティ規制に従って残りのストック溶液を廃棄してください。

次に、ロボット作業台から培養物を播種します。リキッドハンドラーの除染プロトコルを開始する前に、再利用可能な実験器具を清掃してください。17 時間の実行時間後にメイン カルチャを停止し、テキスト プロトコルの説明に従ってデータを処理します。

G-F-P力価を定量するには、まず、すべての培養ウェルからの細胞懸濁液を事前にラベル付けされた反応チューブに移します。次に、ベンチトップ遠心分離機を使用して細胞懸濁液を最大速度で10分間遠心分離し、細胞を含まない上清を得ます。次に、各細胞を含まない上清の200マイクロリットルを、底が透明な黒色の96ウェルM-T-Pに移します。

適切なマイクロプレートリーダーを使用して、励起波長が488ナノメートル、発光波長が520ナノメートルのG-F-P特異的蛍光を読み取ります。G-F-P蛍光を測定した後、マイクロプレートは、BradfordやB-C-Aアッセイなどの標準プロトコルを使用して、無細胞上清のタンパク質含有量の測定に直接使用できます。最後に、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析に進みます。

実証された手順は、1ラウンドの実験を構成し、その結果は、G-F-P信号の最大期待される改善を伴うさらなるラウンドを設計するために使用されます。参照実験は、データの変動性を分析し、実験の外れ値を検出するために、各ラウンドに配置されます。この等高線プロットは、最適化手順の概要を示しています。

3回目の反復で収集したデータセットを分析した結果、マグネシウムのプラスの効果には限界があることが明らかになり、最適な濃度範囲が特定されました。そこで、第4回ではカルシウムのみの濃度範囲をさらに拡大することになりました。この手順は、G-F-P信号の飽和が見つかるまで、反復5と6の2回繰り返されました。

この飽和度は、細胞が利用できないカルシウムの適用濃度に対するカルシウム塩の沈殿によって説明されます。7回目のイテレーションは、境界をより詳細に探求するために使用されました。飽和G-F-Pシグナルの培地成分の最適な濃度範囲は、統計的なZ検定で確実に特定できます。

これは、識別されたプラトーを決定され、Kringingキットツールボックスを使用して視覚化されたものとして示しています。Kringingキットツールボックスは無料で入手でき、その機能の使用方法を説明する詳細なチュートリアルが付属しています。提示されたプロトコールの一般的な性質により、他の微生物発現宿主の研究や、グリコシル化パターンやジスルフィド結合などの標的タンパク質の他の特性の最適化など、さまざまな適応が可能になります。

エンブリオンシステムの統合により、実験のスループットが向上し、時間の大幅な節約が可能になります 完全に制御可能で影響力のあるバイオリアクターをアムニアシステムに置き換える際には、結果のスケーラビリティを考慮する必要があります。数学的モデリングと実験計画は、研究対象に対する測定データの情報量を最大化するのに役立ちます。