Name: リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶリアルタイム細胞解析装置用金電極の再生法。トリプシンとエタノールを用いた低毒性処理により、使い捨てマイクロチップを繰り返し使用可能にし、コスト削減と持続可能な研究環境を実現します。

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仕事は、国家自然科学基金、中国の (U1703118)、優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関 (ニュージャージー)、江蘇省 Shuangchuang プログラム、状態キーのオープン ・ ファンドによって資金を供給されたプロジェクトによって支えられました。化学療法・ バイオセンシングとケモメトリックス (2016015) と国立生体高分子研究室 (2017kf05) Jiangsu Specially-Appointed 教授プロジェクト、中国の研究所。

一般に、再生過程にはメモ: トリプシンの消化力とエタノールと水で洗浄のステップが含まれています。消化時間を使用すると、セルの数によると変更し、種類と使用される電池の数は実験の目的によって異なる場合があります。再生条件を最適化する光・電気化学方法を使用して再生成されたチップを確認するをお勧めします。実験では、水溶性と不溶性物質が関与することが、再生手続の典型的な 2 症例の詳細ここで。
1. 再生溶液の調製
注: 準備し、無菌条件の下ですべてのソリューションを処理します。
<ol><li>新鮮な (g/v) の 0.25% トリプシン溶液を準備します。トリプシンを購入または新鮮な次のようにすることができます。<ol>
<li>PH 7.4 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 mL のトリプシンの 0.25 g を溶解します。</li>
		<li>トリプシンは世話を任意の気泡を避けるために低速でソリューション 4 oC. 攪拌溶解完全にするまでは、ソリューションをかき混ぜます。</li>
		<li>バイオ セーフティ フード内 0.22 μ m のフィルターにソリューションをフィルター処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無水エタノールを使用して 75% エタノールを準備します。容積測定フラスコに 75 mL の無水エタノールを注ぐし、ボリューム 100 mL に達するまで、脱イオン水を追加します。必要な場合は、さらに殺菌を実行します。</li>
</ol>2. インキュベーションと電子板で A549 細胞の増殖
注: 電子プレート タイプ 16 および L8 両方成っているアレイの金電極パターニング培養ウェルの底に印刷します。電子板 L8 8 井戸があるとき、電子プレート 16 は 16 の井戸を持っています。電子板 16 の井戸があるラウンド電子板 L8 の井戸は角丸長方形。各電子版 8 のボリュームもは約 830 μ L、各電子板 16 も約 270 μ L。
<ol><li>A549 細胞培養<ol>
<li>ロズウェル パーク記念研究所-1640 年培 (RPMI 1640 年) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% で培養 A549 細胞ペニシリン-ストレプトマイシン細胞培養ディッシュします。</li>
		<li>細胞密度 〜 75% に達したときに細胞を通過し、1 × PBS と付着性細胞層を洗って trypsinize 37 oC. 遠心分離機で 1 分の 0.25% トリプシン溶液によるトリプシンを削除する 5 分間 179 × g でセル。さらに文化の 10 mL の培地で細胞やその他の実験を再懸濁します。 注: 媒体で再停止されるセルのソリューションは、細胞懸濁液バッファーとしてここに指定されています。</li>
		<li>10 μ L を取り出して診断を使用してセル数をカウントします。さらに実験のための 30,000 80,000/mL の細胞細胞懸濁液バッファーを準備するのにセルバッファー懸濁液を希釈するのに RPMI 1640 媒体を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
増殖/細胞毒性測定実験とデータ収集
	<ol>
<li>平衡のフード、バイオ セーフティにおける 30 分間それを残すと電子プレート 16 のもそれぞれのインキュベーションに 50 μ L (150 μ L 電子板 L8) 細胞用培地を追加します。37 oc 以上で CO2インキュベーターでリアルタイム細胞解析に電子板 16 を手動で挿入します。</li>
		<li>コンピューター上のリアルタイム細胞解析操作プログラムを起動します。既定実験パターン セットアップ ページ「モデル実験」を選択し実行している分析の名前。</li>
		<li>そのレイアウト ページでは、実験に含まれている、エディット ボックスでセル型、数と薬名のような情報を入力して対応する井戸を選択します。そのスケジュール ページで、実験の手順を追加し、各ステップとのリアルタイム データ取得間隔の時間 (例えば、12、24、または 48 h) を選択します。 注: ここでは、ステップ 1 と 2 の間隔は 1 分、15 分後です。</li>
		<li>ファイルを保存し、そのセルのインデックス ページ上のメディアのバック グラウンド インピー ダンスを測定する「スタート」ボタンをクリックしてください結果のデータは自動的に差し引かれます。そのグラフもページにすべてのよくカーブを訪れることができます。そのプロット ページ追加井戸および時間セル指数のグラフを示したが。</li>
		<li>細胞増殖実験プログラムを一時停止する「一時停止」ボタンをまずクリックしてください。その後電子板を取り出して、室温でウェルあたり 100 μ L A549 細胞懸濁液バッファーを追加します。細胞培養ウェルの底に解決するようにバイオ セーフティ フードに 30 分のプレートを残します。</li>
		<li>リアルタイム細胞解析駅に電子板を手動で挿入します。実験を続行するには、「スタート」をクリックします。 注: [印刷] ページで、アナライザー継続的に記録セルのインデックス値または実験全体に曲線。</li>
		<li>実験が完了したら、印刷ページを入力し、実験ファイルを開きます。すべてのテストされたインキュベーション井戸と平均または医薬品の追加やアッセイ間のばらつきを減らすために媒体を変更する前に前回の正規化できる結果のセル インデックス曲線選択します。データ分析ページ EC50 または IC50 を計算できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 電子板の再生
注: 各洗浄ステップの電子板でソリューションを混ぜた徹底的に (5-10 回) は、ピペットを使用しています。
<ol><li>
ケース 1:アンチの細胞毒性評価のための癌治療薬
	<ol>
<li>第 2 節で記述として電子板に種子 A549 細胞。</li>
		<li>最初細胞培地で抗がん剤ドキソルビシン塩酸塩 (DOX) に分解します。ゆっくりと (DOX の最終濃度は 30 μ g/mL) のセルに DOX を追加ピペットを使用しています。セクション 2 の説明に従って、CI を記録します。 注: 実験が完了した後すぐに、使用される電子板が再生成されます。このケースでは DOX は可溶性化学プロトコルに従う電子板の再生が比較的扱いやすい、追加の手順は必要ありません。</li>
		<li>
再生
		<ol>
<li>リアルタイム細胞解析駅からの細胞を含む電子板を取り出してください。常温無菌バイオ セーフティ フードで使用される電子プレートを置き、徹底的にピペットを使用して培養液をミックスします。すべての媒体をピペットします。</li>
			<li>室温で 3 回 200 μ L の脱イオン水で電子平板をすすいでください。</li>
			<li>1-2 h (200 μ L/ウェル) 37 oc 以上でインキュベーターでの作りたての 0.25% トリプシン電子板で残りのセルをダイジェストします。消化を完了すると、5-10 回常温バイオ セーフティ フード ピペット、ピペット アウトすべてのソリューションを使用して、潜伏ソリューションをミックスします。</li>
			<li>それぞれ、次のように、200 μ L エタノールと 200 μ L の水、電子板をリンス: 脱イオン水 2 回、100% エタノールの 2 倍。エタノール 75 %2 回脱イオン水 2 回。滅菌ガーゼまたは室温で残りの水をデカントするティッシュ ペーパーの電子版を反転します。</li>
			<li>紫外線は殺菌常温バイオ セーフティ フードで 1-2 時間再生電子プレートです。 注: 二重電子板 L8 の再生のためのすべてのソリューションのボリュームです。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ケース 2: ドラッグデリバリー メソポーラス材料を使用しています。
	<ol>
<li>5.6 の平均孔径ロッド状メソポーラスシリカを使用して以前に報告された20の薬剤配達行列として nm。 注: ここでは、電子のプレートは、薬物放出に及ぼす細胞を監視する採用されました。<ol>
<li>電子プレートの各ウェルの培養液に材料を追加します。シリカ材料が溶けると電子平板の沈殿物は、次のようにプレートをすすいでください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ケース 1 のとおり 3.1.3.1-3.1.3.3 の手順を実行します。</li>
		<li>一度常温バイオ セーフティ フードとマイクロ チップ 200 μ L の脱イオン水ですすいでください。</li>
		<li>室温でマイクロ チップ 200 μ L 無水エタノールと 2 回をすすいでください。</li>
		<li>室温で 200 μ L 75% エタノールとマイクロ チップを一度すすいでください。</li>
		<li>各ウェルに 75% のエタノールの 250 μ L を追加し、常温封止フィルム電子プレート シールします。</li>
		<li>2 分間 114 x g でスピン電子のプレートを空にします。滅菌ガーゼまたは室温で残りの水をデカントするティッシュ ペーパーの電子版を反転します。</li>
		<li>3.2.5-3.2.7 の手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>紫外線は殺菌常温バイオ セーフティ フードで 1-2 時間再生電子プレートです。 注: は、L8 電子版を洗うときにすべてのソリューションのボリュームを倍増します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 再生効果の評価
<ol><li>
再生電子板表面の光学特性
	<ol>
<li>使用鋼は新鮮なのも孵化の底の部分を慎重に分解するスプーンし、を含む電子板を再生成は、金電極アレイ。プラスチック手袋を着用、慎重に鋼のスプーンを使用して電子版からマイクロ チップを含む部分を拭いてください。</li>
		<li>顕微鏡スライド ガラスの中央に両方のパーツを配置し、21CCD 検出器を搭載したラマン顕微鏡による結果のラマン スペクトルを収集します。 注: 分光計 633 nm レーザーが装備されていた、30 s レーザー露光時間 500 3500 cm-1の範囲で波長の間隔でスペクトルを記録しました。光の画像は、10 倍目レンズと 50 x 目的使用してラマン顕微鏡で得られました。図 1 a 図 1もインストールされている顕微ラマン装置に得られました。</li>
		<li>新鮮で再生の抗癌性の薬剤吸収後添付の細胞の生存率を評価するには、電子プレート、共焦点を使用してレーザー DOX 分子吸収 A549 の自発蛍光をモニターする顕微鏡です。<ol>
<li>セル (新鮮で再生成された電子板 A549 細胞)、使用によって吸収される DOX の自発蛍光を記録するには、63 X オイル客観的かつ 485 nm の励起波長として。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再生電極の電気化学的挙動 注: 商業電子板の手動いただいたりは難しく、チェックとして表面の電子状態の評価には適していません、プロトコルの再生効率評価した結果, 通常のゴールド/ガラス状炭素電極 (GCE) テストとしてプラットフォーム、電気化学インピー ダンス分光法 (EIS) が行われました。Au 電極と GCE の両方の直径は 3 mm 電気化学データの 3 電極を用いた電気化学アナライザーによって得られたし、インピー ダンス測定は、10 mV の振幅の交流電流 (AC) 信号を用いて行った、0.01 hz 100 kHz の広い周波数範囲。<ol>
<li>測定前に、アルミナス ラリーの任意の粒子を除去する水で超音波処理に続いて、研磨布の上の鏡のような表面を Au 電極と GCE を磨きます。</li>
		<li>だから 0.5 M H2Au 電極をアクティブにする4。説明22として 10 mm KCl 電解質溶液 1 ミリメートル K3[Fe(CN)6] 裸の Au 電極と GCE の EIS データを取得します。</li>
		<li>2.1.2 と 2.1.3 A549 細胞の原液を準備します。Au 電極と GCE の表面に 10 μ L 細胞懸濁液をドロップします。Au 電極と GCE 3 h Au 電極の EIS の取得データのための 37 oC インキュベーター内のセルに変更、GCE 10 mm KCl 電解質溶液 1 ミリメートル K3[Fe(CN)6] セルを使用して変更を孵化させなさい。</li>
		<li>
プロトコルを使用して、EIS 測定電極を再生成します。
		<ol>
<li>Au 電極を浸し、GCE 変更セルで 0.5-2 の 0.25% トリプシンの h. Au 電極と GCE そっと水ですすぎ 4 回。無水エタノールでそっと電極 4 回をすすいでください。Au 電極を浸すし、GCE 〜 5 分 75% エタノールでリンス 75% エタノールをそっとチップ 4 回。</li>
			<li>1 ミリメートル K3[Fe(CN)6] を含む 10 mM KCl 電解質溶液中の再生の Au 電極・ GCE の EIS データを取得します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

我々 は、いくつかの方法17,23,24,25,26 表 1にマイクロ チップを再生のため要約。基本的には、これらのメソッドには、SPR チップに使用される免疫の複合体のような強力な分子分子相互作用の存在のためのチップの完全な再生を達成するために比較的厳しい実験条件が関与しています。しかし、これらの厳しい実験条件は RTCA で使用されるアレイのゴールド チップの表面特性のために非常に有害かもしれません。だから、穏やかな、効率的な方法だった提示再生戦略の開発の主要な考慮事項です。同様に重要な他の要因、環境の懸念されるこれらの使い捨てマイクロ チップは対象となるがん細胞と共によく使用されますので。
このプロトコルでは RTCA ...

無料のラベル セル ・ ベースのテクノロジーがプロテオミクス1,2 のスクリーニングと同様、分析目的などの面での過去 10 年間の急速な成長を目撃しているおかげで、効率的ななりの手間のかかる実験プロセス、薬の配達3、等4,5に比べて、細胞解析、ジェーバーと同僚が以前開発したプロトタイプ6 ラベル無料リアルタイム細胞アッセイを目指した従来の生化学的方法は定量的な方法で細胞の成長や移行の連続測定を可能にするセル接続されたマイクロ チップの表面に電気信号の変更の記録の原則に基づきます。この戦略は、次のリアルタイム細胞センシング (RT CES) を用いた電気インピー ダンスを用いた検出原理が導入された7、8最近商業リアルタイム細胞解析 (RTCA) 電子が発売研究室の研究の9を実行します。
商業リアルタイム細胞アナライザーは主に培養細胞の細胞増殖、移行、生存率、形態、および付着を含む生理学的な変更に起因する細胞の誘発電気インピー ダンスの信号を読み取り、マイクロ チップ10,11の表面。このような電気信号は細胞の状態を評価するためにセル インデックス (CI) をという名前の無次元パラメーターにアナライザーによってさらに変換されます。マイクロ チップのインピー ダンスの変化は主に電極/溶液界面で覆われた細胞のローカル イオン環境を反映します。したがって、細胞分析装置の分析性能はコア センシング ユニット、アレイの金電極から成っている使い捨て可能なマイクロ (すなわち、いわゆる電子プレート、例えば96/16/8 ウェル) に大きく依存しています。パターニング培養ウェルの底に印刷されます。金電極ライン サークル形式 (図 1) で組み立てるし、添付のセル3,12,13 のダイナミック ・高感度の検出を可能にする培養の井戸の表面の面積のほとんどをカバー ,14。CI、チップ上のセルの表面被覆率詳細場合と増減細胞がアポトーシスで生じる毒性物質にさらされる。細胞毒性11神経毒性の15を決定し古典的なエンドポイント法より多くの運動情報を提供リアルタイム細胞解析を頻繁に使用されている、使い捨て可能な電子版は、コストのかかる消耗品。
今までは、ずっとないピラニア ソリューションまたは酢酸などの過酷な再生条件が関与する16,17,という事実のためにおそらくは電子の板の再生に使用可能なメソッド18金のマイクロ チップの電気の状態を変更するかもしれない。したがって、ゴールド チップの表面から他の物質と付着性のセルを削除する軽度かつ効率的な方法は電子板再生過程のことが望まれます。再生成されたチップは光と同様、電気化学的方法19特徴づけられたし、最近非腐食性試薬を用いる使い捨て可能な電子版の再生を目的としたプロトコルを開発しました。トリプシンとエタノールを含む容易に利用され適度な実験用試薬を使用することにより、正常に 2 つの主なタイプを再生成に適用する、副作用のない商業電子板を再生成する一般的な方法を確立した電子板の RTCA 用 (16 および L8)。

<table><tbody><tr><td>ラット: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチラット CD11b モノクローナル (クローン OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>パンニング: 1:1,000;染色:1:500</td></tr>ヤ<tr><td>ギ多結腸抗Iba1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗Ki67&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>Cat# AB15580</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>染色: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (ICC染色の界面活性剤)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat#28313</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>パラン硫酸ガ</td><td>レン研究所用品Cat</td><td>#GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>乳固形物からのペプトン</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-35B</td><td></td></tr><tr><td>マウスIL-34</td><td>R&D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>ケイマンケミカルズ&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル システイン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (高グルコース)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>キャット# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>プリマリアプレート&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456<</td><td></td></tr><tr><td>strong>試薬&nbsp;</強い></td><td><強い>再構成&nbsp;</td><td> 使用濃度</td><td> 保存</ストロング></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン</td><td>10 mg/mL in PBS&nbsp;</td><td>1:100-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>5 mg/mL 含有 H2O&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>2.5 mg/mL 含有 H2O&nbsp;</td><td>1:25,000-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td>コラーゲンIV</td><td>200 &mu;PBSのg / mL&nbsp;</td><td>1:100-80</td><td>°;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td>20 &mu;PBSのg / mL&nbsp;</td><td>1:10,000-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>100 &ミュー;PBSのg / mL&nbsp;</td><td>1:1,000-80</td><td>°;C</td></tr><tr><td>ヒツジウールコレステロール</td><td>1.5 mg/mL 100% エタノール中 &nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td>ヘパラン硫酸</td><td>1 mg/mL 含有 H2O</td><td>1:1,000-20</td><td>&deg;C</td></tr><tr><td>オレイン酸/ゴンド酸</td><td>ゴンドニック:0.001 mg / mL;オレイン酸:100%エタノールに0.1 mg / mL&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>50 mg/mL in PBS&nbsp;</td><td>1:100-20</td><td>°;C</td></tr><tr><td><ストロング>ソリューション&nbsp;</td><td>レシピ&nbsp;<</td><td></td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Perfusion Buffer</td><td>50 &mu;DPBS++ (Ca++ および Mg+ +</sup/sup>)</td><td></td> <td>氷冷した</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td>200 &mu;50 mLのDPBS++</td><td></td><td>氷冷</td></tr><tr><td>パニングバッファー2</td><td>mg / mLのペプトンをDPBS++</td>100ユニット/ mLペニシリンを含むDPBSμ / sup)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM / F12の乳固形物から氷冷パニングバッファー2 mg / mLでパニングバッファー2 mg / mLを使用する場合に使用します。g/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン、5 &mu;g/mL N-アセチルシステイン、5 &mu;g/mL インスリン、100 &mu;g / mLアポトランスフェリン、および100 ng / mL亜セレン酸</td><td></td>ナトリウム氷<td>冷MGMを使用して、免疫皿からミクログリアをパンします。.</td></tr><tr><td>コラーゲンIVコーティングMGM</td><td>は2 &mu;g/mL コラーゲン IV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミエリン分離バッファー</td><td>9 mL Percoll PLUS、1 mL 10x PBS (Ca++ および Mg++, 9 &mu;L 1 M CaCl2, 5 &mu;L 1 M MgCl2</td><td></td><td>を添加した後、よく混ぜてください&nbsp;CaCl2およびMgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/コレステロール含有増殖培地％％;</td><td>MGM含有ヒト2 ng/mL TGF-b2、100 ng/mLマウスIL-34、1.5 &mu;g / mLヒツジウールコレステロール、10 &mu;g/mL ヘパラン硫酸、0.1 &mu;g/ml オレイン酸、および 0.001 &mu;g / mlゴンド酸</td><td></td><td>37°Cに温めた培地にコレステロールを必ず追加してください。C で、1.5 &mu を超えないようにします。g / mLまたは沈殿します。コレステロール含有媒体をろ過しないでください。TIC培地を10%CO2で30分間〜1時間平衡化してから、細胞に添加して最適なpHを確保します。</td></tr></tbody></table>

リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

ラベル無料セルベースのアッセイは、それのための生化学的研究は、実験動物の使用を必要としないために有利です。古典的な生化学的アッセイより細胞生理学的な条件の下でより動的な情報を提供するその能力により電気インピー ダンスの原理に基づくこのラベル無料リアルタイム細胞アッセイは過去の中にますます注目を集めてください。10 年間。しかし、その実用測定、細胞形態の高価な消耗品使い捨て金マイクロ チップを使用する比較的高価なコストのために制限があります。このプロトコルでは商用ラベル無料電池アナライザーを搭載したアレイの金電極を再生成する一般的な方法を開発しました。再生のプロセスには、トリプシンの消化力、回転ステップと水、エタノールで洗浄が含まれています。提案法テストされており、少なくとも 3 回の再生と商業の電子板の繰り返し使用に有効であることが示さ保存研究者はリアルタイムの細胞の試金の高いランニング コストを助けます。

金マイクロ チップの表面特性: このプロトコルで使用される再生手順図 1で輪郭を描かれました。 図 2を示し、顕微鏡新鮮な写真を表面光学顕微鏡による電子板を再生成します。図 2 aおよび図 2、顕微鏡で観察はあった事実上示されて示すように、マイクロ チップの光学的性質に違いが新鮮な間表面し、電子平板を扱われません。便利なセルの状態の評価のための細胞に含まれるドキソルビシン分子の自発蛍光を使用して、我々 は (図 2 bと図 2 D 再生後ゴールドのマイクロ チップの培養細胞のような均質性を観察).また、培養癌細胞は、チップの再利用性を示す電子板で明確に...

このプロトコルでは、商業配列金電極高ランニング コストの ofmicrochip ベースのアッセイの節約を目的とした無料のラベル セル アナライザーの装備を再生成する一般的な方法について説明します。再生のプロセスには、トリプシンの消化力、マイクロ チップの繰り返し使用を可能にする回転ステップと水、エタノールで洗浄が含まれています。

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

本手順の目的は、リアルタイムセルアナライザー（RTCA）用の市販電子プレートを再生させることです。この手法は、RTCAで使用される電子プレートの再生を含む、使い捨て金ベースチップの再生分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、低毒性で入手しやすく、穏やかな条件の研究室用試薬を用いて再生手順を実施できる点にあります。この手法の着想は、金ベースのチップを使用するReal-Time Cell Analyzerを導入した際に得られました。テキストプロトコルに記載されている通り、細胞培養皿でのA549細胞のインキュベーションおよび増殖からこの手順を開始します。電子プレートL8の各インキュベーションウェルに、細胞培地を150 µLずつ加えます。平衡化のため、プレートをバイオセーフティフード内に30分間放置します。30分後、37°CのCO2インキュベーター内にあるReal-Time Cell Analyzerに、電子プレートL8を手動で挿入します。次に、コンピューターでReal-Time Cell Analyzerの操作プログラムを起動します。デフォルトの実験パターン設定ページでExperiment Modelを選択し、実行するアッセイに名前を付けます。レイアウトページで、実験に含まれる対応するウェルを選択し、編集ボックスに細胞の種類、数、薬剤名などの情報を入力します。スケジュールページで実験ステップを追加し、各ステップの実行時間とリアルタイムデータ収集の間隔を選択します。[start]をクリックして、培地の背景インピーダンスを測定します。実験ファイルが保存されます。得られたデータは自動的に差し引かれます。プロットページでウェルを追加すると、時間に対するセルインデックスのグラフが表示されます。細胞増殖実験では、まず一時停止ボタンをクリックしてプログラムを一時停止させます。次に電子プレートを取り出し、室温で各ウェルにA549細胞懸濁バッファーを100 microlitersずつ添加します。細胞をインキュベーションウェルの底に沈降させるため、プレートをバイオセーフティフード内に30分間静置します。電子プレートをリアルタイム細胞解析ステーションに手動で挿入します。次に、スタートボタンをクリックして実験を続行します。プロットページでは、解析装置が実験全体を通して細胞指数値（曲線）を継続的に記録します。実験完了後、プロットページに入り、実験ファイルを開きます。次に、テストしたすべてのインキュベーションウェルと、得られた細胞指数（cell index）曲線を選択します。これにより、薬剤の添加や培地の交換を行う直前の状態で、アッセイ間のばらつきを抑えるための平均化または正規化を行うことができます。データ解析ページにて、EC50またはIC50を算出することが可能です。本文のプロトコルに従って抗がん剤の細胞毒性評価を行った後、Real-Time Cell Analyzerステーションから細胞を含む電子プレートを取り出します。使用済みの電子プレートを室温の滅菌済みバイオセーフティフード内に置き、ピペットを用いて培地を十分に混合します。その後、ピペットで培地をすべて吸引してください。電子プレートを200 µLの脱イオン水で室温にて3回洗浄します。電子プレート上の残りの細胞を、0.25%の調製直後のトリプシンを用い、37 °Cのインキュベーター内で1〜2時間消化させます。消化が完了したら、室温のバイオセーフティキャビネット内で、ピペットを用いてインキュベーション溶液を5〜10回混ぜ合わせ、その後、溶液を除去します。電子プレートを200 µLの脱イオン水で2回すすぎます。次に、200 µLの100% ethanolで2回洗浄し、続いて同量の75% ethanolで2回洗浄します。最後に、さらに200 µLの脱イオン水で2回すすぎます。電子プレートを滅菌ガーゼまたはティッシュペーパーの上に逆さにして置き、室温で残った水をデカンテーションにより除去します。次に、バイオセーフティキャビネット内にて、再生した電子プレートを室温で1〜2時間紫外線滅菌します。本文のプロトコルに従い、メソポーラス材料を用いた薬物送達にプレートを使用した後、前述と同様に、残った細胞をトリプシンで消化します。実験においてピペットは頻繁に使用されるため、チップやマイクロチップの表面を傷つけないよう注意してください。バイオセーフティーフード内にて、室温で脱イオン水 200 microliters を用いてマイクロチップを1回すすぎます。その後、室温で無水エタノール 200 microliters を用いてマイクロチップを2回すすぎます。次に、マイクロチップを200 µLの75% ethanolで室温にて1回洗浄します。各ウェルに250 µLの75% ethanolを加え、室温でシーリングフィルムを用いて電子プレートを密封します。電子プレートを114 ×gで2分間遠心分離した後、プレート内の液を捨てます。室温で、電子プレートを滅菌ガーゼまたはティッシュペーパーの上に逆さまに置き、残った液体を捨てます。75% ethanolでの洗浄と遠心分離を繰り返します。その後、バイオセーフティフード内で、再生した電子プレートを室温で1〜2時間紫外線滅菌します。テキストプロトコルに従ってインキュベーションウェルの底部を分解し、再生された電子プレート表面の光学特性を評価します。新鮮な電子プレートおよび再生された電子プレートにおける抗がん剤取り込み後の接着細胞の生存率を評価するため、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、A549細胞に吸収されたDOX分子の自発蛍光を観察します。細胞に吸収されたDOXの自発蛍光を記録するには、63倍のオイル浸漬対物レンズを使用し、励起波長として485 nanometersを使用します。次に、再生した電極の電気化学的挙動を評価します。まず、金電極とグラッシーカーボン電極を、研磨布上でイルミノスラリーを用いて鏡面状に研磨します。その後、電極を水中で超音波洗浄し、粒子を取り除きます。続いて、0.5-molar 硫酸中で金電極を活性化させます。1 mMのフェリシアン化カリウムを含む10 mMの塩化カリウム電解質溶液中で、ベア金電極およびグラッシーカーボン電極の電気化学インピーダンス分光法（EIS）データを取得します。次に、GCE内の金電極表面に細胞懸濁液を10 µL滴下します。細胞を添加した後、テキストプロトコルに記載されている通り、細胞で修飾した電極のEISデータを取得する前に、GCE内の金電極を37 °Cのインキュベーターで3時間インキュベートします。電極を再生させるには、細胞で修飾したGCEに金電極を浸し、0.25% trypsin で0.5〜2時間処理します。両方の電極を水で4回、穏やかに洗浄します。その後、電極を絶対エタノールで4回、穏やかに洗浄します。次に、GCE内の金電極を75% ethanolに約5分間浸します。5分後、チップを75% ethanolで4回静かにすすぎ、テキストプロトコルに記載されている通りに、再生された電極のEISデータを取得します。アレイ状金電極プレートの再生効率を評価するため、未使用のプレートと処理後のプレートの両方について顕微鏡観察を行いました。マイクロチップ表面の光学特性に実質的な差は見られませんでした。再生前後における金マイクロチップ上の細胞状態を評価するため、ドキソルビシン分子の蛍光を利用しました。同様の均質性と明確な細胞形態が示されたことから、チップの再利用可能性が実証されました。再生プロトコルは、細胞増殖の実際の試験に適用されます。試験した電子プレートの複数のインキュベーションウェルから得られた成長曲線は良好な一致を示しており、市販チップの再生が成功したことを示しています。ここでは、再生された電子プレートL8を用いて、メソポーラスシリカ材料による細胞毒性評価試験を行った結果を示しています。メソポーラス材料で処理したサンプルの細胞指数はコントロールと比較して低下しており、材料にわずかな細胞毒性があることが示されました。さらに、メソポーラス材料による抗がん剤ドクソルビシン（doxorubicin）の封入および放出により、A549細胞の増殖曲線は劇的に低下しました。この手法を習得し、適切に実施すれば、4時間で完了させることができます。本手順を実施する際は、タイプシンクの消化時間がチップによって異なる可能性があることに留意することが重要です。本手順に続き、共焦点レーザー走査顕微鏡、あるいは分光法や電気化学インピーダンス分光法などの他の手法を用いることで、再生効果の評価といった追加の課題に対する検証を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオは、多電極アレイ(MEA)ベースのアッセイを使用して、固有脊髄接続の機能再生を示しています。脊髄スライスはMEA上に配置され、融合することができます。融合したスライスは、病変を作成することによって機械的に分離され、固有脊髄ニューロンが病変上で成長し、スライスを結合するように誘導されます。スライスの電気的活動を評価して、機能的な接続の再生を特定します。...

多電極アレイを用いた脊髄切片間の機能的接続の再生の研究

異なる電極コーティングは、電気化学的、化学的および機械的特性の変化を介して神経記録性能に影響を与える。 in vitroでの電極の比較は、しかし、生体内反応の比較は、通常、電極/神経距離と動物間の変動によって複雑に、比較的簡単です。この記事では、神経記録電極を比較する堅牢な方法を提供する。...

神経電位電極の体系的電気化学的および電気生理学的評価方法

このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。...

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。...

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

多電極アレイ上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激後の応答の増加を示す。このプロトコルは、ニューロンを培養する方法、活動を記録する方法、および刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するプロトコルを確立する方法を示す。...

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

本研究では、炭素繊維マイクロ電極を金ナノ粒子で改変し、神経伝達物質検出の感度を高める。...

強化された神経化学的検出のための金ナノ粒子修飾炭素繊維マイクロ電極

以下に説明する、解剖学的に遠い脳領域全体に複数のポリマー電極アレイを移植し、自由に移動するラットにおける慢性電気生理学的記録を用いるための方法である。調製および外科的移植は、他の種で使用するためのこれらの方法の適応を導く設計原理に重点を置いて、詳細に記載されている。...

複数のフレキシブルポリマー電極アレイの慢性移植

慢性および急性イン ビボ 記録用炭素繊維微小電極アレイの構築と実装

ここでは、神経および脳における 生体内で...

オープンソースツールキット:神経記録用のベンチトップカーボンファイバーマイクロ電極アレイ

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。...

共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。...

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

学ぶリアルタイム細胞解析装置用金電極の再生法。トリプシンとエタノールを用いた低毒性処理により、使い捨てマイクロチップを繰り返し使用可能にし、コスト削減と持続可能な研究環境を実現します。

リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生

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