リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生
2018年3月12日
このプロトコルでは、商業配列金電極高ランニング コストの ofmicrochip ベースのアッセイの節約を目的とした無料のラベル セル アナライザーの装備を再生成する一般的な方法について説明します。再生のプロセスには、トリプシンの消化力、マイクロ チップの繰り返し使用を可能にする回転ステップと水、エタノールで洗浄が含まれています。
この手順の全体的な目標は、リアルタイムセルアナライザー(RTCA)用に装備された市販の電子プレートを再生することです。この方法は、RTCAで使用される電子計画の再生を含む、使い捨て金ベースのチップの再生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、毒性の低い温和で容易に入手できるラボ用試薬を使用して再生手順を実施できることです。
この方法のアイデアを最初に思いついたのは、金ベースのチップがコストのかかるReal-Time Cell Analyzerを使用し始めたときでした。この手順は、テキストプロトコールに記載されているように、細胞培養皿でのA549細胞のインキュベーションと増殖から開始します。電子プレートL8の各インキュベーションウェルに150マイクロリットルの細胞培地を加えます。プレートをバイオセーフティフードに30分間放置し、平衡化します。
30分後、電子プレートL8をCO2インキュベーターのReal-Time Cell Analyzerに37°Cで手動で挿入します。次に、コンピュータ上でReal-Time Cell Analyzer操作プログラムを起動します。デフォルトの実験パターン設定ページで、[実験モデル] を選択し、実行中のアッセイに名前を付けます。
レイアウトページで、実験に含まれる対応するウェルを選択し、編集ボックスに細胞の種類、数、薬剤名などの情報を入力します。スケジュールページで、実験ステップを追加し、各ステップの実行時間とリアルタイムデータ取得の間隔を選択します。[開始]をクリックして、メディアのバックグラウンドインピーダンスを測定します。
実験ファイルが保存されます。結果のデータは自動的に減算されます。プロットページでウェルを追加すると、タイムセルインデックスのグラフが表示されます。
細胞増殖実験では、まず一時停止ボタンをクリックしてプログラムを一時停止します。次に、電子プレートを取り出し、室温でウェルあたり100マイクロリットルのA549細胞懸濁液バッファーを追加します。プレートをバイオセーフティフードに30分間放置し、細胞をインキュベーションウェルの底に沈殿させます。
電子プレートをリアルタイムセルアナライザーステーションに手動で挿入します。次に、開始ボタンをクリックして実験を続行します。プロットページでは、分析装置は実験全体を通じて細胞インデックス値(曲線)を連続的に記録します。
実験が完了したら、プロットページに入り、実験ファイルを開きます。次に、試験済みのインキュベーションウェルをすべて選択し、その結果得られた細胞指数曲線を最後に平均化または正規化してから、医薬品を追加したり、アッセイ間のばらつきを減らすために培地を変更したりします。データ解析ページでは、EC50またはIC50を計算できます。
テキストプロトコールに記載されている抗がん剤の細胞毒性評価を行った後、Real-Time Cell Analyzerステーションから細胞の入った電子プレートを取り出します。使用済みの電子プレートを室温の滅菌バイオセーフティフードに入れ、ピペットを使用して培地を完全に混合します。次に、ピペットを使用して培地全体を吸引します。
電子プレートを200マイクロリットルの脱イオン水で室温で3回すすぎます。電子プレート上の残りの細胞を、0.25%調製したばかりのトリプシンで37°Cのインキュベーターで1〜2時間消化します。消化が完了したら、バイオセーフティフード内で室温で作業し、ピペットでインキュベーション液を5〜10回混合し、溶液を取り出します。
電子プレートを200マイクロリットルの脱イオン水で2回すすぎます。次に、200マイクロリットルの100%エタノールで2回洗浄し、続いて同量の75%エタノールを2回洗浄します。最後に、さらに200マイクロリットルの脱イオン水で2回すすぎます。
滅菌ガーゼまたはティッシュペーパーの上で電子プレートを反転させ、室温で残りの水をデカントします。その後、再生した電子プレートのバイオセーフティフード内で室温で1〜2時間紫外線滅菌を行います。テキストプロトコルに記載されているように、メソポーラス材料を使用して薬物送達にプレートを使用した後、前と同様に残りの細胞をトリプシンで消化します。
実験ではピペットを頻繁に使用するため、マイクロチップの先端や表面を傷つけないように注意が必要です。マイクロチップを200マイクロリットルの脱イオン水で一度、室温のバイオセーフティフードですすいでください。次に、200マイクロリットルの無水エタノールを含むマイクロチップを室温で2回上昇させます。
次に、マイクロチップを200マイクロリットルの75%エタノールで室温で一度すすぎます。各ウェルに250マイクロリットルの75%エタノールを加え、室温で電子プレートをシーリングフィルムで密封します。電子プレートをGの114倍で2分間回転させた後、プレートを空にします。
滅菌ガーゼまたはティッシュペーパーに電子プレートを反転させ、残りの液体を室温でデカントします。75%エタノールリンスを繰り返し、続いてスピンします。その後、再生した電子プレートのバイオセーフティフード内で室温で1〜2時間紫外線滅菌を行います。
テキストプロトコルで説明されているように、最初にインキュベーションウェルの底部を分解することにより、再生された電子プレート表面の光学特性を評価します。新鮮で再生された電子プレートに抗がん剤を取り込みた後の付着細胞の生存率を評価するには、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、A549細胞に吸収されたDOX分子の自発蛍光をモニターします。細胞によって吸収されたDOXの自発的な蛍光を記録するには、63倍の油対物レンズと励起波長として485ナノメートルを使用します。
次に、最初に金電極とガラス状炭素電極を研磨布に光源を付けて鏡のような表面に研磨することにより、再生電極の電気化学的挙動を評価します。次に、電極を水中で超音波処理して、粒子を除去します。次に、0.5モル硫酸の金電極を活性化します。
1ミリモルのフェラシアン化カリウムを含む10ミリモルの塩化カリウム-電解質溶液中の裸の金電極とガラス状炭素電極の電気化学インピーダンス分光法(EIS)データを取得します。次に、GCEの金電極の表面に10マイクロリットルの細胞懸濁液を落とします。細胞を添加した後、GCE内の金電極を37°Cインキュベーターで3時間インキュベートしてから、テキストプロトコルに記載されているように、細胞で修飾された電極のEISデータを取得します。
電極を再生するには、0.25%トリプシン中の細胞で修飾したGCEに金電極を0.5〜2時間浸します。両方の電極を水で4回柔らかくすすぎます。その後、電極を無水エタノールで4回柔らかくすすぎます。
次に、金電極をGCEの75%エタノールに約5分間浸漬します。5分後、テキストプロトコルに記載されているように、再生された電極のEISデータを取得する前に、チップを75%エタノールで4回柔らかくすすいでください。配列された金電子プレートの再生効率を評価するために、新鮮な電子プレートと処理された電子プレートの両方について顕微鏡観察が行われました。
マイクロチップ表面の光学特性に仮想的な違いは見られませんでした。ドキソルビシン分子のスロエッセンスは、再生前後の金マイクロチップ上の細胞状態を評価するために使用されます。同様の均質性と明確に定義された細胞形態は、チップの再利用性を実証しました。
再生プロトコルは、細胞増殖の実際のテストに適用されます。試験した電子プレートの複数のインキュベーションウェルから得られた成長曲線は、良好な一貫性を示しており、市販チップの再生が成功したことを示しています。ここに示されているのは、再生された電子プレートL8を、メソポーラスシリカ材料を使用して細胞毒性評価のためにテストしたものです。
メソポーラス材料で処理したサンプルの細胞指数は、コントロールと比較して減少し、材料のわずかな細胞毒性を示しました。さらに抗がん剤ドキソルビシンをメソポーラス材料でカプセル化して放出すると、A549細胞の増殖曲線が劇的に減少しました。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば4時間で完了します。
この手順を試行する際は、タイプシンクの消化時間がチップごとに異なる場合があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、共焦点レーザー走査型顕微鏡法、さらには分光法、電気化学インピーダンス分光法などの他の方法を実行して、再生効果の評価などの追加の質問に答えることができます。
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概要
このプロトコルは、リアルタイムセルアナライザ（RTCA）で使用される商用金マイクロ電極の再生方法を概説しています。再生プロセスは、一連の穏やかな処理を通じて繰り返し使用を可能にし、使い捨てマイクロチップに関連するコストを削減するように設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 電気生理学
背景
- 金ベースのチップは、RTCAで細胞分析に一般的に使用されています。
- 使い捨てマイクロチップは研究環境で高コストを要します。
- これらのチップの再生は、実験室の実践における持続可能性を高めることができます。
- この方法は低毒性の試薬を使用し、実験室環境にとってより安全です。
研究目的
- 金マイクロ電極の再生のための費用対効果の高い方法を開発すること。
- RTCAで電子プレートを再利用することの実現可能性を探ること。
- 実験室廃棄物を最小限に抑え、使い捨て実験材料の環境への影響を減少させること。
使用された方法
- 細胞培養皿でのA549細胞のインキュベーションと増殖。
- マイクロ電極から細胞を剥がすためのトリプシン消化の適用。
- 電極のエタノールと水による洗浄。
- 再生プロセスを促進するためのスピニングステップの実装。
主要な結果
- 再生手順により、金マイクロ電極を複数回使用することができます。
- 穏やかな試薬を使用することで、プロセス中の低毒性が確保されます。
- この方法は電極機能を維持する効果を示しています。
- 新しいマイクロチップを購入する場合と比較して、コスト削減は顕著です。
結論
- この再生プロトコルは、使い捨てマイクロ電極の実行可能な代替手段を提示しています。
- これは、細胞分析研究における持続可能な実践をサポートします。
- このアプローチは、RTCAで使用されるさまざまなタイプの電子プレートに適応させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Disposable gold microchips in real-time cell analysis impose significant recurring costs that limit assay scalability in drug discovery workflows. This regeneration protocol enables cost-effective reuse of commercial electronic plates, supporting sustainable and scalable label-free impedance-based cell assays. By reducing consumable expenses, the method improves capital efficiency and supports higher-throughput screening in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables repeated label-free monitoring of cellular responses to compounds, supporting consistent target engagement assessment.
- Operational Value: Reduces variability between assays by allowing reuse of standardized electrode surfaces under controlled conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reusable platform for real-time impedance readouts, facilitating kinetic profiling of compound effects on cell adhesion and proliferation.
- Operational Value: Supports assay standardization across multiple runs, improving data comparability in dose-response and cytotoxicity screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains electrode functionality for longitudinal studies, enabling assessment of drug-induced cellular changes over time.
- Operational Value: Allows for repeated testing of the same plate format, supporting follow-up mechanistic studies after initial screening hits.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling reusable impedance-based readouts from early compound screening through follow-up mechanistic validation, reducing the need for repeated chip procurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via real-time, label-free measurement of cellular impedance as a proxy for adhesion, viability, and morphology.
- Screening: Enhances assay readiness and reproducibility by allowing consistent electrode performance across multiple experimental cycles.
- Analytics: Generates quantitative impedance outputs (e.g., cell index) that can be normalized and compared across conditions to assess compound effects.
- Translational Research: Enables continuity from initial screening to secondary validation by preserving electrode functionality for repeated use.
- Enterprise Reuse: Positions the regeneration process as a reusable laboratory capability rather than a single-use consumable workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by enabling consistent, low-variability measurements across replicate assays.
- Operational Value: Increases throughput and reduces downtime associated with chip replacement and revalidation.
- Strategic Value: Lowers cost per assay, improving budget efficiency in high-volume screening campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making by generating reliable, reproducible data across multiple test cycles.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique and familiarity with cell culture handling to avoid electrode surface damage.
- Depends on access to standard lab equipment including incubators, pipettes, centrifuges, and UV sterilization units.
- Necessitates optimization of trypsin exposure time based on cell type and adhesion strength to prevent electrode degradation.
- Requires training to ensure consistent execution of rinsing, spinning, and sterilization steps across users.
- Performance should be validated via impedance baseline stability and optical/electrochemical characterization before reuse in critical assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
Proliferation/Cytotoxicity Experiment and Data Acquisition
3:54
Case 1: Regeneration of Electronic Plates after Cytotoxicity Evaluation of Anti-cancer Drug
5:53
Case 2: Regeneration of Electronic Plates after Drug Delivery using Mesoporous Material
7:34
Assessment of Regeneration Effect
10:22
Results: Evaluationof Regenerated Electronic Plates
12:01
Conclusion
