Name: RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶRGBとスペクトルイメージングを組み合わせた植物根系の表現型解析手法。rhizoboxを用いた土壌栽培条件下で根系構造と機能を可視化し、非生物ストレス耐性の育種研究に応用する。

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著者らは、プロジェクト数 P 25190-B16 (干ばつ抵抗性の根) 経由でオーストリア科学基金 FWF から資金を認めます。ハイパー スペクトル イメージング インフラストラクチャの確立は、連邦政府の低いオーストリア (土地 Niederösterreich) K3-F-282/001-2012 プロジェクトを介してによって財政上支えだった。AGRANA 研究から甜菜実験を受けたために追加の資金調達 &#38; イノベーション センター GmbH (ARIC)。著者は、実験と原稿の英文添削の中にテクニカル サポートのクレイグ ・ ジャクソンをありがちましょう。我々 はまた rhizobox マウントの建設のため RGB イメージング セットアップの確立に貢献したマーカス Freudhofmaier、ヨセフ Schodl を認めます。

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</ol>

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プロトコルは、ルート システムのイメージングを栽培された土壌の 2 つの相補的なアプローチを提供します。信頼性の高い実験結果を得るのための重要なステップは、観測窓でタイトなルート-土の接触を提供し、エアー ギャップを避けるためにフロント ガラスでも、均一な基板層を確保するためには rhizoboxes の充填です。比較的細かいふるわれた土を使用する主な理由は、この &#60; 2 mm: より大きな凝集体は、骨材間の空隙を持つ観測窓で高い表面形態。ルート ヒント脱水のリスクが高い、以外にもこれはまた水マッピング31のより複雑な画像処理技術を必要です。
プロトコルの変更従って rhizoboxes の向上と迅速な充填に焦点を当てます。現在充填時間ボックスあたり約 30 分です。さらにイメージングの側面より良い RGB 画像の照明の均一性を最適化するために変更からのため 2 枚のガラス窓で rhizoboxes の使用をテストします。ハードウェアをさらに拡張も33をイメージング rhizobox システム、容量と同様に、平面のバイオケミカル32の統合を検討するかもしれない。しかし、これは現在アップグレード以外は。
ソフトウェアの変更はヒューズの上部と下部の RBG 画像34にイメージの自動登録に焦点を当てます。ハイパー スペクトル イメージング高度な教師なし特徴抽出 Svm35テストより敏感なチャイルド ターゲット検出方法と同様、28をアプローチします。それによりハイパー スペクトル データは複数根と根圏土壌のプロパティの36の評価可能性のあるできます。さらにそれを目的とする (半) 建築形質 (分岐頻度、分岐の角度) および rhizobox ルートに基づく画像のルート システムの解析37形態を定量化するための修正バージョン (長さ、直径、表面) ソフトウェアを自動化します。
3 D イメージング技術と比較してプロトコルの主な制限は、表面の目に見える根および根圏プロパティに制限です。しかし21全体のルート システムの信頼性の高いプロキシに表示されているルートの特徴が実証されています。Rhizobox 技術は (洗濯) 総根系形質と表示の関係を検証するためにダイナミックな成長の終わりに伝統的な破壊的なサンプリングと簡単に結合されます。この関係は、21種の間で異なる場合があります、破壊的なサンプリングも別の作物の種を持つ、新しい表現型解析シリーズの目に見える特徴から信頼性の高い推論を確保するが推奨します。
ここで提示されたプロトコルの主な利点は、一時的解決の RGB 画像とルート機能 (例えば水通風管) ハイパースペクトル イメージング センサーからケモメトリック根と根圏データ経由での推論の潜在的なスループットが比較的高く、現実的な成長する条件 (土) の組み合わせです。それにより方法はハイスループット苗と非土根ながら部分的に以下の実験的複雑さと高度な 3 D 方法15と比べて高いスループット機能プロセス洞察深い表現、方法14をイメージングで推論の制限を克服します。
今後の実験では根系の発達と地盤構造物、窒素、炭素被覆作物種の表現型解析ルート特性に関してはマメ科植物と同様の機能に菌根菌の影響を検討するため、プロトコルが使用されますサイクリングします。

根植物のストレージなどのいくつかの重要な機能を提供する同化、土壌、および吸収における陸生植物の定着と水と栄養分の1の輸送。進化の観点から根の形成は土地の植物2の起源のための基本的な前提条件と見なされます。歴史的に、この重要な役割にもかかわらず根は生物学の研究だけ縁の位置を占めています。近年、しかしが高まって図 1からわかるように植物根系の科学的関心。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg"> 
図 1: ルート植物科学研究の関連性。 最後の十年にわたって科学雑誌にすべて公開された植物研究の割合としてルート数の関連の研究。Scopus キーワード「植物」と「植物とルート」を使用してからの結果を検索します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2 つの主な理由は、根研究の最近の進歩の根底にあると仮定できます。まず、地上の植生は、地球変動3の結果としてより頻繁に環境ストレスにさらされます。農作物生産のコンテキストでグローバルに約農業の面積の 30% が水とリン4,5によって制限されることが推定されます。収穫量の応力低減効果は、天水農業生態系6の潜在的な生産性の低い 50% で推定される世界的に大幅な収量のギャップの主な理由です。低リソース可用性に加えてこれは、不適切なリソース利用効率、利用可能なリソース7を悪用する植物のすなわち十分な能力にも関連します。その他の生態系に悪影響を硝酸などモバイル リソースの損失でこの結果します。たとえば、現在の地球規模の窒素利用効率は 478と推定されます。良いリソース使用効率改善された管理のメソッドを介して、品種は両方のための高い重要性の環境の持続性に関しては同様に農業の出力の成長を持続します。このコンテキストの植物の根は、改良された作物の作付システム9,10の主要なターゲットと見なされます。
植物の根における最近の関心の 2 番目の重要な背景は、測定方法における技術の進歩です。Root メソッドは、2 つの主要な課題で長い制限されている:11、洗濯によって大抵定量化, 分離する有した土壌で育つ植物からの根の測定のために起こし根の建築配置。発掘を使用してその場でルート観察植物説明12土壌における根の自然な場所を節約の方法が使用されています。まだ彼らは非常に時間がかかる、従って比較構造機能ルート システム分析のスループットの要件を満たしていません。一方、ルート アーキテクチャ測定用高スループット方法ほとんど行われた実生植物13人工培植物の自然な成長環境への外挿が疑わしい14。
根研究の最近のブームは、方法15のイメージングの進歩に密接に結びついた。ルート研究のアプローチをイメージングすることができます約 3 つのタイプに分類します。最初16CT や MRI などの高解像度 3 D 方法があります。これらのメソッドは、干ばつによる木部塞栓症17など、土壌と植物の根の相互作用過程の研究に最も適しています。通常、彼らは詳細な観測ができる比較的小さいサンプルに適用されます。異なるサイズの鍋および細根画像診断用 CT と MRI の比較は、18で提供されます。第二に、高スループットのイメージング方法19,20があります。これらのメソッドは主に基づいて一般的な RGB 画像人工メディア (ゲル、発芽紙) の成長の根の高コントラストがルーツと背景との間の比較的単純な郭清を可能します。彼らは標準化された人工成長条件13の下で別の作物品種の苗ルートの特徴の高スループット比較に適しています。Rhizobox メソッドは、これらの 2 つのアプローチの間に: 中スループット21,22を長い期間にわたって土壌で育つ根の 2次元イメージングを使用しています。(2 D) ルート イメージングへの最近の課題は、また構造23の説明に加えて、ルート機能の指標をキャプチャすることです。
本論文では rhizobox (i) 安くて簡単なカスタム RGB 画像設定と (ii) より複雑な近赤外イメージング セットアップを使用して根系の成長をイメージングの実験的プロトコルを提案する.これらの 2 つの設定から得られる結果の例は表示され、植物の表現型解析と植物生理学的研究のコンテキストで説明.

<table><tbody><tr><td>Rhizobox</td><td>Technisches B&uuml;ro f&uuml;r Bodenkultur</td><td>Experimental builder</td><td></td></tr><tr><td>LED ランプ ATUM HORTI 600</td><td>Klutronic</td><td>AHI10600F</td><td></td></tr><tr><td>蛍光灯 HiLite T5 Day</td><td>Juwel Aquarium</td><td>86324</td><td></td></tr><tr><td>UV ライト チューブ Eurolite 45cm スリム 15 W</td><td>コンラッド</td><td>593384 - 62</td><td></td></tr><tr><td>キヤノン EOS 6D</td><td>キヤノン オーストリア GmbH</td><td>8035B024</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 拡張バージョン 12.0 x32</td><td>アドビシステムズソフトウェアアイルランド株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinRhizo Pro v. 2013</td><td>リージェント・インスツルメンツ社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xeva-1.7-320 SWIRカメラ</td><td>Xenics</td><td>XEN-000105</td><td></td></tr><tr><td>Spectrograph Imspector N25E</td><td>Specim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイパースペクトルイメージングスキャナー</td><td>Carinthian Tech Research AG</td><td>実験ビルダー</td><td>ハイパースペクトルイメージングスキャナーとソフトウェアの設計と組み立て</td></tr><tr><td>Matlab R2106a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>画像処理、信号処理、統計、機械学習用のツールボックスを含む</td></tr><tr><td>AP4 ポロモエター</td><td>デルタ-T-デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-3100C エリアメーター</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BASF スタイラダー ポリスチレンシート</td><td>オビ・バウマルクト</td><td>9706318</td> 異なる<td>種類のポリスチレンシートや、異なる水分を含んだ土壌を分離する他の材料を使用することができます</td></tr></tbody></table>

rgb とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

植物根のダイナミクスの理解は、農業のシステム リソースの使用効率を向上させ、環境ストレスと作物品種の抵抗性に不可欠です。RGB と根系のハイパー スペクトル イメージングの実験的プロトコルが表示されます。アプローチは、植物が完全に発達した根系を観察する長い時間をかけて自然な土で育つ rhizoboxes を使用しています。水ストレス下の rhizobox 植物を評価し、根の役割を研究するため実験的設定が挙げられます。時間をかけて根の安くて簡単な定量化のため RGB イメージング セットアップを説明します。ハイパースペクトル イメージング センサーは RGB 色の閾値と比較して土壌の背景からルート セグメンテーションを向上させます。ハイパースペクトル イメージング センサーの特定の強さはケモメトリック根土壌システム機能の理解のために情報の取得です。これを高解像度水コンテンツ マッピングを示します。分光イメージングはしかし画像の取得・処理・解析の RGB のアプローチに比べて複雑です。両方のメソッドの組み合わせは、ルート システムの包括的な評価を最適化できます。植物の表現型解析と植物の生理学的研究のコンテキストの根と地上部の形質を統合するアプリケーションの例のとおりです。別の光源を使用してより良い照明と RGB 画像の品質を最適化することによって、スペクトル データからルート ゾーンのプロパティを推測する画像解析法の延長によってルート イメージングのさらなる改善が得られます。

RGB とハイパー スペクトル イメージング植物根系の生育する土壌の評価の実験的プロトコルが表示されます。ケモメトリック ハイパー スペクトル情報かシリーズ スキャン RGB 画像の時間の組み合わせは、植物根の原動力に洞察力を最適化します。

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

この手順の全体的な目的は、異なるイメージング手法を組み合わせることにより、土壌を満たしたリゾボックス内で成長する植物の根に関する包括的な情報を得ることです。この手法は、異なる根の構造が非生物的ストレス耐性の向上にどのように寄与するかなど、植物のフェノタイピングおよび育種分野における重要な課題の解決に役立ちます。このアプローチの主な利点は、根の構造を把握するためのRGBイメージングと、根の機能を解析するためのハイパースペクトルイメージングを組み合わせている点にあります。ハイパースペクトルイメージングを根の解析に利用する可能性は、スペクトル情報によって植物の根がもたらす微小規模な理化学的変化を明らかにできるため、広範な根圏パラメータにまで及びます。根圏ボックス（rhizobox）への充填手順を慎重に行う必要があるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。適切に行われない場合、根の成長や視認性に悪影響を及ぼします。テキストプロトコルに詳述されている通り、基質充填のためのリゾボックスの準備から本手順を開始してください。乾燥土壌に3,705gの乾燥土に対し400gの水を加え、重量水含量が0.108 g/gとなるようあらかじめ湿らせます。土壌と水を静かに混ぜ合わせ、水分を均一に分散させてください。大きな凝集塊を手動で分散させ、粒子径を2 mm以下に維持します。気泡の隙間をなくし、ガス観察窓の隣に均一な土壌層を形成させることが極めて重要です。植物の根端は急速に脱水するため、空気の隙間に入り込むと乾燥してしまいます。また、水マッピングのための分光画像の品質に悪影響を及ぼします。あらかじめ湿らせた土壌を開いた根圏ボックス（rhizobox）に充填し、ポリスチレンシートを用いてボックス内部の体積を覆いながらゆっくりと固め、かさ密度を1.3 grams per cubic centimeterの均一な状態にします。スプレーボトルを用いて表面に散布し、目標とする含水率0.31 cubic centimeters per cubic centimeterに達するまで残りの水を加えます。表面構造の劣化を防ぎ、均一な濡れ性を確保するために、液滴のサイズを小さくしてください。噴霧中は、基板に実際に添加された水分量を監視するため、ボックスを天秤の上に置いてください。水が再分配されるまで10分間待ち、その後、ガラスを表面に押し当ててサイドメタルレールで固定します。湿潤した基質を含むリゾボックスの平均最終重量は17,818 ± 68 gであった。植物の最適な成長のため、440 nmおよび660 nmにスペクトルピークを持ち、450 µmol/m²/sの均一な照度を提供する8個のLEDランプを環境室に設置する。植物および実験のニーズに従って環境パラメータを設定した後、根圏を暗所に保ち、ガラス面を透過する光による藻類の増殖を防ぐため、ガラス窓を木製プレートで覆う。次に、適切な金属フレームを用いて、リゾボックスを45度の傾斜で設置します。これにより、重力屈性によって根がガラス面に向かって最大限に成長します。RGB根イメージングでは、リゾボックスから80センチメートルの距離に設置した4本の24ワット蛍光灯でリゾボックスを照らします。また、根と明るい色の基質背景とのコントラストが低い場合に、根の自発蛍光を利用した代替照明として、15ワットのUV灯4本をリゾボックスから20センチメートルの位置に設置します。UVランプを点灯させ、撮影するリゾボックスをイメージングボックスのホルダーに固定します。次に、リゾボックスの上半分と下半分をカバーするように、約3センチメートルの重複を持たせて2枚の画像を撮影します。テキストプロトコルに従ってRBG画像を撮影および処理します。最後に、取得したRBG根画像の解析を実行し、不一致のある領域がないかを確認します。不一致がある場合は、除外領域を設定して解析を再開してください。分類されなかった根がある場合は、カラークラスを追加して解析を再実行してください。根として誤って分類された要素がある場合は、「debris（破片）」および「rough edges（粗いエッジ）」のフィルタリングオプションを有効にするか、設定値を上げてください。画像取得を行う際は、まずカメラソフトウェアを用いて、リゾボックスのスキャンおよびホワイトスタンダードのカメラ積分時間を決定してください。そのためには、イメージングGUIを開き、根が存在するリゾボックスの位置にカメラを移動させます。ソフトウェアに表示されるヒストグラムにおいて、カメラのフルダイナミックレンジの約85%が使用されるように、明るい対象物をターゲットにしてカメラの積分時間を調整します。異なる基質や根の組織に対して積分時間を正しく設定することは、赤外線カメラの範囲を超えて情報が失われることを防ぎ、ダイナミックレンジを最大限に活用するために不可欠です。カメラソフトウェアを閉じる前に、カメラポジショニングシステムをホワイト標準のターゲットに移動させ、同様のプロセスを繰り返します。次に、MatlabイメージングGUIを開き、現在のリゾボックススキャンのすべての設定を入力してください。1日1回、各イメージング実行前にダーク標準およびホワイト標準を取得します。ダークスタンダードはカメラノイズを表し、ホワイトスタンダードは最大反射率を示します。これらのデータは、前処理中の画像正規化に必要です。ライゾボックス全体をスキャンするか、その一部のみをスキャンするかを定義します。今回のケースでは、根圏ボックス全体を撮影します。その後、スキャンを開始してください。スペクトルベースで含水量を測定するには、校正用根圏ボックスが必要です。ポリスチレンシートを用いて、根圏ボックス（rhizobox）を5 cmごとの区画に分割し、異なる含水量の土壌を充填します。校正用の根圏ボックスを、植栽した根圏ボックスに使用したものと同じ設定でスキャンします。例として、根の形質と地上部の形質を組み合わせる場合は、気孔コンダクタンスを測定するために葉面ポロメーターを用意します。気候チャンバー内で、装置を少なくとも1時間、周囲条件に馴染ませます。1株あたり少なくとも3枚の葉から測定を行います。ここに、RGBイメージングに基づくテンサイ品種「Ferrara」の代表的な根の成長画像を示します。播種から35日後、植物の根は伸長してライゾボックスの底に到達します。ライゾボックス上部のいくつかの根軸は、RGB画像からセグメント化することができません。古い基部の根が老化すると、その色は茶色に変化します。したがって、色閾値に基づいたこれらの根と土壌背景の分離は不可能です。ハイパースペクトルイメージングを用いることで、根の前景と土壌背景の異なる分光特性に基づいたセグメンテーションが可能になります。これにより、セグメンテーションの結果が改善されます。手動で追跡した参照画像に対する測定根長の誤差はわずか1.5%です。さらに、分光イメージングにより、根周囲の水分量の詳細なマッピングが可能となり、水吸収の推論が行えます。ここでは根の骨格を黒色で示しています。明るい領域は、根の軸付近で水分の枯渇が進んでいる領域を示しています。濃い青色の領域は、根が届かない範囲で土壌水分量が高い領域を示しています。このビデオを視聴することで、十分な根の成長と可視性を確保するために、どのようにライゾボックスを適切に充填すべきかを十分に理解できるはずです。これが、後のイメージングおよび代表的な根のフェノタイピング結果を得るための基礎となります。この手順に続き、K-means法（K平均法）やサポートベクターマシンなどの他の分光分類手法を用いることで、根の老化や分解といった根および根圏の特性に関する詳細な情報を得ることができます。この手法を確立すれば、根系および非生物的ストレス応答を包括的に表現型解析することが可能です。10種類の栽培品種の特性評価を、合計3か月未満の実験期間で完了させることができます。

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RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

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