RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

この手順の全体的な目的は、異なるイメージング手法を組み合わせることにより、土壌を満たしたリゾボックス内で成長する植物の根に関する包括的な情報を得ることです。この手法は、異なる根の構造が非生物的ストレス耐性の向上にどのように寄与するかなど、植物のフェノタイピングおよび育種分野における重要な課題の解決に役立ちます。このアプローチの主な利点は、根の構造を把握するためのRGBイメージングと、根の機能を解析するためのハイパースペクトルイメージングを組み合わせている点にあります。

ハイパースペクトルイメージングを根の解析に利用する可能性は、スペクトル情報によって植物の根がもたらす微小規模な理化学的変化を明らかにできるため、広範な根圏パラメータにまで及びます。根圏ボックス（rhizobox）への充填手順を慎重に行う必要があるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。適切に行われない場合、根の成長や視認性に悪影響を及ぼします。

テキストプロトコルに詳述されている通り、基質充填のためのリゾボックスの準備から本手順を開始してください。乾燥土壌に3,705gの乾燥土に対し400gの水を加え、重量水含量が0.108 g/gとなるようあらかじめ湿らせます。土壌と水を静かに混ぜ合わせ、水分を均一に分散させてください。

大きな凝集塊を手動で分散させ、粒子径を2 mm以下に維持します。気泡の隙間をなくし、ガス観察窓の隣に均一な土壌層を形成させることが極めて重要です。植物の根端は急速に脱水するため、空気の隙間に入り込むと乾燥してしまいます。

また、水マッピングのための分光画像の品質に悪影響を及ぼします。あらかじめ湿らせた土壌を開いた根圏ボックス（rhizobox）に充填し、ポリスチレンシートを用いてボックス内部の体積を覆いながらゆっくりと固め、かさ密度を1.3 grams per cubic centimeterの均一な状態にします。スプレーボトルを用いて表面に散布し、目標とする含水率0.31 cubic centimeters per cubic centimeterに達するまで残りの水を加えます。

表面構造の劣化を防ぎ、均一な濡れ性を確保するために、液滴のサイズを小さくしてください。噴霧中は、基板に実際に添加された水分量を監視するため、ボックスを天秤の上に置いてください。水が再分配されるまで10分間待ち、その後、ガラスを表面に押し当ててサイドメタルレールで固定します。

湿潤した基質を含むリゾボックスの平均最終重量は17,818 ± 68 gであった。植物の最適な成長のため、440 nmおよび660 nmにスペクトルピークを持ち、450 µmol/m²/sの均一な照度を提供する8個のLEDランプを環境室に設置する。植物および実験のニーズに従って環境パラメータを設定した後、根圏を暗所に保ち、ガラス面を透過する光による藻類の増殖を防ぐため、ガラス窓を木製プレートで覆う。

次に、適切な金属フレームを用いて、リゾボックスを45度の傾斜で設置します。これにより、重力屈性によって根がガラス面に向かって最大限に成長します。RGB根イメージングでは、リゾボックスから80センチメートルの距離に設置した4本の24ワット蛍光灯でリゾボックスを照らします。

また、根と明るい色の基質背景とのコントラストが低い場合に、根の自発蛍光を利用した代替照明として、15ワットのUV灯4本をリゾボックスから20センチメートルの位置に設置します。UVランプを点灯させ、撮影するリゾボックスをイメージングボックスのホルダーに固定します。次に、リゾボックスの上半分と下半分をカバーするように、約3センチメートルの重複を持たせて2枚の画像を撮影します。

テキストプロトコルに従ってRBG画像を撮影および処理します。最後に、取得したRBG根画像の解析を実行し、不一致のある領域がないかを確認します。不一致がある場合は、除外領域を設定して解析を再開してください。

分類されなかった根がある場合は、カラークラスを追加して解析を再実行してください。根として誤って分類された要素がある場合は、「debris（破片）」および「rough edges（粗いエッジ）」のフィルタリングオプションを有効にするか、設定値を上げてください。画像取得を行う際は、まずカメラソフトウェアを用いて、リゾボックスのスキャンおよびホワイトスタンダードのカメラ積分時間を決定してください。

そのためには、イメージングGUIを開き、根が存在するリゾボックスの位置にカメラを移動させます。ソフトウェアに表示されるヒストグラムにおいて、カメラのフルダイナミックレンジの約85%が使用されるように、明るい対象物をターゲットにしてカメラの積分時間を調整します。異なる基質や根の組織に対して積分時間を正しく設定することは、赤外線カメラの範囲を超えて情報が失われることを防ぎ、ダイナミックレンジを最大限に活用するために不可欠です。

カメラソフトウェアを閉じる前に、カメラポジショニングシステムをホワイト標準のターゲットに移動させ、同様のプロセスを繰り返します。次に、MatlabイメージングGUIを開き、現在のリゾボックススキャンのすべての設定を入力してください。1日1回、各イメージング実行前にダーク標準およびホワイト標準を取得します。

ダークスタンダードはカメラノイズを表し、ホワイトスタンダードは最大反射率を示します。これらのデータは、前処理中の画像正規化に必要です。ライゾボックス全体をスキャンするか、その一部のみをスキャンするかを定義します。

今回のケースでは、根圏ボックス全体を撮影します。その後、スキャンを開始してください。スペクトルベースで含水量を測定するには、校正用根圏ボックスが必要です。

ポリスチレンシートを用いて、根圏ボックス（rhizobox）を5 cmごとの区画に分割し、異なる含水量の土壌を充填します。校正用の根圏ボックスを、植栽した根圏ボックスに使用したものと同じ設定でスキャンします。例として、根の形質と地上部の形質を組み合わせる場合は、気孔コンダクタンスを測定するために葉面ポロメーターを用意します。

気候チャンバー内で、装置を少なくとも1時間、周囲条件に馴染ませます。1株あたり少なくとも3枚の葉から測定を行います。ここに、RGBイメージングに基づくテンサイ品種「Ferrara」の代表的な根の成長画像を示します。

播種から35日後、植物の根は伸長してライゾボックスの底に到達します。ライゾボックス上部のいくつかの根軸は、RGB画像からセグメント化することができません。古い基部の根が老化すると、その色は茶色に変化します。

したがって、色閾値に基づいたこれらの根と土壌背景の分離は不可能です。ハイパースペクトルイメージングを用いることで、根の前景と土壌背景の異なる分光特性に基づいたセグメンテーションが可能になります。これにより、セグメンテーションの結果が改善されます。

手動で追跡した参照画像に対する測定根長の誤差はわずか1.5%です。さらに、分光イメージングにより、根周囲の水分量の詳細なマッピングが可能となり、水吸収の推論が行えます。ここでは根の骨格を黒色で示しています。明るい領域は、根の軸付近で水分の枯渇が進んでいる領域を示しています。

濃い青色の領域は、根が届かない範囲で土壌水分量が高い領域を示しています。このビデオを視聴することで、十分な根の成長と可視性を確保するために、どのようにライゾボックスを適切に充填すべきかを十分に理解できるはずです。これが、後のイメージングおよび代表的な根のフェノタイピング結果を得るための基礎となります。

この手順に続き、K-means法（K平均法）やサポートベクターマシンなどの他の分光分類手法を用いることで、根の老化や分解といった根および根圏の特性に関する詳細な情報を得ることができます。この手法を確立すれば、根系および非生物的ストレス応答を包括的に表現型解析することが可能です。10種類の栽培品種の特性評価を、合計3か月未満の実験期間で完了させることができます。