RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

この手順の全体的な目標は、さまざまなイメージング方法を組み合わせて、土壌で満たされた根圏で成長する植物の根に関する包括的な情報を取得することです。この方法は、植物の表現型および育種の分野で重要な問題、例えば、異なる根の構造の寄与など、非生物的ストレス耐性の向上に答えるのに役立ちます。このアプローチの主な利点は、ルート アーキテクチャの RGB イメージングとルート機能のハイパースペクトル イメージングが組み合わされていることです。

根にハイパースペクトルイメージングを使用する可能性は、スペクトル情報によって植物の根によってもたらされる小規模な物理化学的変化を明らかにすることができるため、幅広い根圏パラメーターにまで及びます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、rhizoboxの充填ステップを慎重に行う必要があるため、非常に重要です。そうしないと、根の成長と根の可視性に悪影響を及ぼします。

この手順は、テキストプロトコルに詳述されているように、基質充填用の根圏ボックスの準備から開始します。乾燥した土壌を3, 705グラムの乾燥土壌に400グラムの水を加えることにより、乾燥した土壌を1グラムあたり0.108グラムの重量含水量に事前に湿らせます。土と水を穏やかに混ぜて、均一な水の分布を得ます。

大きな骨材を手動で破壊して、粒子サイズを2ミリメートル以下に保ちます。ガス観測窓の隣に均質な土壌層を得ることは、エアギャップを避けることが重要です。植物の根の先端はすぐに脱水し、エアギャップに成長します。

また、水マッピングのスペクトル画像品質も悪影響を受けます。事前に濡らした土を開いた根箱に充填し、ポリスチレンシートを使用して箱の内部容積を覆うように穏やかに圧縮すると、1立方センチメートルあたり1.3グラムの均一なかさ密度が得られます。残りの水量を追加して、スプレーボトルで表面にスプレーすることにより、目標含水量0.31立方センチメートル/立方センチメートルを達成します。

表面構造の劣化や均質な濡れを避けるために、液滴サイズを小さくしてください。スプレー中はボックスのバランスを保ち、実際に基材に添加される水の量を監視します。水が10分間再分配されるようにしてから、ガラスを表面に押し付け、側面の金属レールで固定します。

接液基材を有する根圏ボックスの平均最終重量は、17,818±68グラムであった。クライメートルームに8つのLEDランプを装備し、毎秒450マイクロモル/平方メートルの均質な照明を提供し、440ナノメートルと660ナノメートルのスペクトルピークで最適な植物成長を実現します。植物と実験のニーズに応じて周囲パラメータを設定した後、ガラス窓を木製のプレートで覆って根域を暗く保ち、ガラス表面を透過する光による藻類の成長を防ぎます。

次に、適切な金属フレームワークを使用して、ライゾボックスを45度の傾斜に置きます。これにより、重力によるガラス表面への根の成長が最大化されます。RGBルートイメージングの場合は、Rhizoboxから80cmの距離に取り付けられた4つの24ワット蛍光灯管を使用してRhizoboxを照らします。

また、ルートと明るい色の基板背景との間のコントラストが低い場合には、ルート自家蛍光を利用して、rhizoboxの代替照明から20センチメートルのところに4つの15ワットUVチューブを取り付けます。UVランプをオンにしてから、イメージングするライゾボックスをイメージングボックスのホルダーに取り付けます。次に、2枚の画像を撮影して、約3センチメートルの重なりで根壬箱の上半分と下半分を覆います。

テキストプロトコルに詳述されているように、RBG画像を取得して処理します。最後に、取得したRBGルートイメージの解析を実行し、その後、一致しない領域があるかどうかを制御します。この場合は、除外領域を定義し、分析を再開します。

分類されていないルートの場合は、追加のカラー クラスを追加して解析を再開します。誤ってルートとして分類された要素の場合は、破片と粗いエッジのフィルタリングオプションをアクティブにするか、増やします。まず、カメラソフトウェアのrhizoboxスキャンとホワイトスタンダードのカメラ統合時間を決定することにより、画像取得を実行します。

これを行うには、イメージングGUIを開き、カメラを根茎ボックスの根が存在する位置に移動します。ソフトウェアによって表示されるヒストグラムで、カメラのフルダイナミックレンジの約85%が使用されるように、明るいオブジェクトをターゲットにするカメラの統合時間を調整します。さまざまな基質や根組織に対して積分時間を正しく設定することは、赤外線カメラの範囲を超えて情報が失われないようにすることで、赤外線カメラのダイナミックレンジを最大限に活用するために重要です。

カメラソフトウェアを閉じる前に、カメラポジショニングシステムを動かしてホワイトスタンダードのターゲットにすることで、ホワイトスタンダードのプロセスを繰り返します。次に、MatlabイメージングGUIを開き、現在のrhizoboxスキャンからすべての設定を入力します。各イメージングを1日1回実行する前に、ダークスタンダードとホワイトスタンダードを取得してください。

暗い標準はカメラのノイズを表し、白い標準は最大の反射率を示します。これらのデータは、前処理中の画像の正規化に必要です。ライゾボックス全体をスキャンするか、その一部のみをスキャンするかを定義します。

この場合、ライゾボックス全体が画像化されています。次に、スキャンを開始します。スペクトルベースの水分含有量の測定には、キャリブレーション用根箱が必要です。

ポリスチレンシートを使用してリゾボックスを5センチメートルのコンパートメントに細分し、さまざまな含水量の土壌で埋めます。植えられたライゾボックスと同じ設定でキャリブレーションライゾボックスをスキャンします。例として、根形質と地上形質を組み合わせるために、気孔コンダクタンスを測定するためのリーフポロメーターを取得します。

クライメートチャンバー内で少なくとも1時間、デバイスを周囲条件に平衡化します。植物ごとに少なくとも3枚の葉から測定を行います。ここでは、テンサイの品種であるフェラーラの代表的な根生長画像をRGBイメージングで示します。

播種後35日で、植物の根は根茎の底に達するまで伸びています。リゾボックスの上部にある一部のルート軸は、RGB画像からセグメント化できませんでした。古い基底根の老化は、それらの色を茶色に変えます。

したがって、これらの根と土壌の背景との間の色の閾値に基づく分離は失敗します。ハイパースペクトルイメージングを使用すると、セグメンテーションは根の前景と土壌の背景の異なるスペクトル特徴に基づいています。これにより、セグメンテーションの結果が向上します。

手動で追跡した参照画像と測定された根の長さの差はわずか1.5%ですさらに、スペクトルイメージングにより、根の周りの水分含有量を細かくマッピングして、水分摂取量を推測できます。これは、ルート スケルトンを黒で示しています。明るい領域は、根軸の近くで水の枯渇が激しい領域を示しています。

一方、濃い青色の領域は、根の手の届かないところにある土壌水分含有量が高い領域を表しています。このビデオを見た後、満足のいく根の成長と視認性を確保するために、根茎を適切に埋める方法をよく理解しているはずです。これは、後のイメージングおよび代表的なルート表現型解析結果の基礎となります。

この手順に従って、K-meansクラスタリングやサポートベクターマシンなどの他のスペクトル分類方法を実行して、ルートの老化や分解などのルートと根圏の特性に関する詳細な情報を取得できます。この手法が確立されると、根系と非生物的ストレス応答を包括的に表現型化できるようになります。10種類の栽培品種のセットは、合計実験期間が3か月未満で特徴付けることができます。