効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

本手順の全体的な目的は、フィーダーフリー条件下でヒト膵臓細胞からフットプリントのない人工多能性幹細胞（iPSCs）を誘導し、次いでCRISPR-Cas9リボ核タンパク質を用いて細胞を編集し、最終的に改変された単一細胞クローンを特性解析することです。この手法は、フットプリントのないiPSCsの作製やCRISPR-Cas9リボ核タンパク質による編集など、ヒト幹細胞ゲノム編集分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、編集されたiPSCsのクローン株を高信頼性で作製でき、モザイク現象の証拠が見られないことです。

6ウェルプレートをコールドコラーゲンでコーティングした後、導入日（0日目）に1ウェルあたり約2.5 x 10⁵個の細胞数、または少なくとも60%のコンフルエンシーに達するように、2日目にPrigrow III培地を用いて低継代のヒト原代膵細胞を播種します。導入当日、テキストプロトコルに従って細胞を回収および計数した後、Sendaiベクターチューブ1セットを氷上で融解し、各チューブから計算された容量を、あらかじめ温めておいた1 mLのPrigrow III培地に注意深く加えます。ピペッティングにより、溶液を穏やかに混合してください。

細胞からPrigrow IIIを吸引し、リプログラミングウイルス混合液をウェルにゆっくりと加えます。その後、37 °Cのインキュベーターで細胞を一晩培養します。導入から24時間後、細胞上のウイルス混合液を慎重に除去し、新鮮なPrigrow III培地と交換します。

6日目に、細胞遊離溶液を1 mL添加し、10分間インキュベートします。その後、rock阻害剤を含むPrigrow IIIを用いて、前日に調製したMEFフィーダー層のディッシュにすべての細胞を播種します。細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。

プレートを定期的に観察し、リプログラミング細胞の指標となる細胞塊やコロニーの出現を確認します。これらは、石畳状の形態に大きな核と核小体を持つクローン凝集塊を形成します。iPSCの可能性が高いコロニーに印を付け、定期的に増殖を確認してください。導入から約4週間後、24ウェルMEFプレートを準備し、分析証明書に記載された希釈係数に基づいて分注してマトリックスメンブレンを調製します。

24〜48個のコロニーをピックアップし、mTeSR1を含むマトリックスメンブレンコート済み24ウェルプレートに移します。プレートを24時間インキュベートし、培地を毎日交換します。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。

マトリックスメンブレン上に播種された強固なコロニーを剥離させるため、dispaseを500 mcL添加します。細胞を20分間インキュベートした後、マトリックスメンブレンでコーティングした12ウェルプレートに再度播種します。テキストプロトコルに従い、アルカリフォスファターゼ染色、免疫染色、およびFACS解析を用いてクローンの増殖および特性評価を行います。

テキストプロトコルに従ってsgRNAを合成した後、HIPSCをトランスフェクションするために、0.5 mcgのCas9タンパク質と0.5 mcgの各sgRNAを組み合わせ、反応総量を22 mcLとして各サンプルのニュークリアフェクション用マスターミックスを調製します。ROCK阻害剤を含む培地を吸引した後、2 mLのRTPBSを用いてhiPSCの各ウェルを洗浄します。次に、PBSを吸引し、1 mLの細胞剥離溶液を加えます。

プレートを37°Cで10分間インキュベートします。細胞を3 mLのmTeSR1培地で再懸濁し、緩やかにピペッティングして単一細胞懸濁液を作成します。解離させた細胞を、5 mLのmTeSR1培地を含む15 mL遠心チューブに移します。

ヌクレオフェクションマスターミックスに、P3 primary cell supplementを16.4 mcL、およびNucleofectorキットのsupplement oneを3.6 mcL加えます。細胞を計数し遠心分離した後、0.5 x 10⁶個の細胞1ユニットあたりを、あらかじめ調製した22 mcLのトランスフェクションマスターミックスで再懸濁します。細胞を速やかにNucleocuvetteストリップの1ウェルの中央チャンバーに転写します。

次に、ストリップをNucleofector装置にセットし、プログラムCB150を用いて細胞をヌクレオフェクションします。ヌクレオフェクション後、10 micromolarのrock inhibitorを含む、あらかじめ温めておいたmTeSR1培地 80 mcLを、ヌクレオフェクション後の細胞が入った各ウェルに速やかに加えます。ピペッティングにより、穏やかに混合してください。

ストリップから細胞を、ROCK阻害剤を含むmTeSR1培地でプレコートしたマトリックスメンブレン 12ウェルプレートの各ウェルへ慎重に移行させます。MEFプレートを調製した後の培養2日目に、単一細胞ソーティングを行う少なくとも2時間前に、HIPSCの培地をmTeSR1から1XSMC4を添加したmTeSR1に交換します。HIPSCから培地を吸引し、PBSを用いて細胞を慎重に洗浄します。

次に、各ウェルに細胞剥離液を500 mcL加え、37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。各ウェルにmTeSR1を1 mL加え、ピペッティングで穏やかに数回混ぜることで、単一細胞懸濁液を作成します。単一細胞を、あらかじめ準備した96ウェルプレートの各ウェルに分注し、ソートします。

ソーティングから4日後には、コロニー形成が認められるはずです。この時点で、培養液を1X SMC4を添加したHESC培地に交換します。テキストのプロトコルに従って標的DNAを抽出・増幅させた後、フラグメントアナライザキットを使用し、メーカーの指示に従って、すべてのクローンのPCR増幅された標的ゲノム領域をゲル染料ミックスで解析します。

テキストプロトコルに従って、多能性iPSCクローンを確認します。Sendai virus導入前、膵細胞は典型的な紡錘形形態を示します。12日目までに、ヒト多能性細胞コロニーに似た小さく密集したコロニーがMEF上に現れます。

通常、完全にリプログラミングされたヒトiPSCコロニーは非常に明確な境界線を持っており、23日から30日目までにピックアップすることが可能です。ここでは、23日目の解離したコロニーを示しています。また、膵細胞をセンダイウイルスでリプログラミングした後、コロニーをピックアップし、フィーダーフリー条件下で培養した際の典型的な位相差顕微鏡画像を示します。

右側に赤色に染色されたアルカリフォスファターゼ陽性のiPSCコロニーが見えます。これらのパネルに示されているように、多能性マーカーであるOCT4およびNANOGの免疫染色によりiPSCであることが確認されました。本実験では、iPSCを細胞表面マーカーで染色し、単一細胞懸濁液を用いてFACS解析を行いました。

緑色のピークは膵臓iPSCsを表し、紫色のピークはiPSC陰性細胞を含んでいます。この手順を実施する際は、セルソーティングおよび細胞培養において無菌状態または滅菌状態を維持することが重要です。本手順の後は、iPSCsやESCsにおける遺伝子ターゲティングなどの他の手法を実施することができ、精密な遺伝子改変を行うことでさらなる疑問を明らかにすることが可能です。

このビデオを視聴することで、フットプリントフリーかつフィーダーフリーのiPS細胞を確実に樹立し、ゲノム編集をバイアレリック（両アレル）に行う方法について十分に理解することができます。