Name: 効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ フィーダーフリー条件下で人間膵細胞からフットプリントフリーiPSCを効率的に樹立し、CRISPR/Cas9リボ核タンパク質を用いてゲノム編集を行い、修飾単一細胞クローンを特性評価する方法。高い再現性とモザイシズムの欠如を実現します。

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ラボで作業員グラント博士アンジャリ Nandal して探索的助成金によって支持されたメリーランド州の幹細胞研究基金に BT (テッドコー) から。

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT は改修サイエンス株式会社の創立メンバーです。

Ips にひと体細胞のリプログラミングは基礎生物学研究、個別化医療、疾患モデル作製、医薬品開発、再生医療16の分野に大きな後押しを提供しています。人間 iPSC 世代の多くの現在、広く使用されている方法、ウイルスが宿主ゲノムに統合のリスクを使用するまたは episomal ベクトルの低効率をプログラムし直します。センダイ ウイルス、'無料フット プリント' や効率的なリプログラミングにつながるヒト膵細胞から Ips のフィーダー フリーを生成するための効率的な方法を紹介します。結果人間 Ips、ウイルス遺伝子の自由、多能性を維持し、不明な外因性の要因の使用を避けます。フィーダー無料条件で Ips の世代は、フィーダー細胞の主な膵細胞を再プログラムし、フィーダー無料膜拡大、文化そして性格描写のために植民地を移動にリプログラミング効率が低い。これらの技術の融合では、安定した、信頼性の高いより効率的な iPSC のプログラミングを提供しています。
線維芽細胞および他の主細胞から Ips を生成されますもこの方法で、さまざまな細胞を再プログラ...

初期化因子の過剰発現による多能性の状態に人間の体細胞のリプログラミング病モデル ・再生医療・新薬開発のアプリケーションで幹細胞研究をもたらしました。いくつかの非ウイルス性リプログラミング手法は初期化因子の Ips を生成配信に利用できるが、プロセスは労働集約的な非常に効率的ではありません1。ウイルスの方法が効率的なウイルスの統合および腫瘍2,3,4の問題に関連付けられます。本稿では、初期化因子の彼らのゲノムの5に、ウイルスのベクトル シーケンスの統合が欠如してフット プリント無料 iPSC ラインの確立を提供する細胞質のセンダイ ウイルスの使用を報告します。センダイ ウイルスは RNA ウイルス感染後細胞細胞質 〜 10 通路を希薄化は、迅速かつ効率的な6、7のリプログラミングにつながる豊富に初期化因子を生成です。確立された Ips は、8フィーダー細胞としてマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) の使用を避けるために送り装置自由な媒体に容易に移行することができます。
リプログラミング、センダイ ウイルス媒介のアウトラインだけでなく、文書内 Ips 研究に必要な遺伝的変更と無制限のひと細胞を供給する可能性を秘めているを編集するための改良されたプロトコルについて述べる。Ips は、プールされたライブラリの遺伝子工学、遺伝子発見のスクリーニング、大規模なゲノム削除、ノックアウト ノック アドインを含むアプリケーションの広い範囲が使用されている現在の変更の CRISPR/Cas9 技術を使用しています。多数のモデル生物と遺伝子療法9,10,11。この技法が化膿連鎖球菌の複合体の形成-派生 Cas9 ヌクレアーゼと 20 mer ガイド Rna 3' 隣接塩基配列 protospacer に隣接するゲノムのターゲット シーケンスと基本ペアリングを介してターゲット認識を達成します。モチーフ (PAM) のシーケンス。Cas9 ヌクレアーゼを二重鎖休憩 〜 3 ヌクレオチド非相同末端結合 (NHEJ) 経路を挿入または開いたリーディング ・ フレームの削除につながるによって主にその後修理されそれにより機能は、PAM のサイトから誘導します。12遺伝子のノックアウト。
私たちの改善されたプロトコルはヒト膵細胞の文化の詳細、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) リプログラミング、フィーダー フリー培養へのそれに続く適応の高効率化を達成するために、有糸分裂でリプログラミング不活化マトリゲル、確立された Ips の特性に CRISPR ガイド RNA の設計、準備、RNP 複合体、編集した Ips のクローンのラインを生成する単一のセルの並べ替え、簡単審査、編集の同定と解析として Ips に配信単一細胞のクローンを作成します。ゲノム削除は Cas9 蛋白質と二重鎖切断 (Dsb) を誘発する 2 つ CRISPR sgRNA RNP 複合体の導入によって、本研究では効率的に生成され、セグメントの介在の削除。このメソッドは開いたリーディング ・ フレームの削除を生成するための 2 つのガイドの使用を活用、高効率の低い数字につながる NHEJ の自動キャピラリーによって特徴付けられる必要、クローンの簡単な事前審査のクローンを作成電気泳動装置、フラグメント アナライザー。これらの効果的なゲノムのひと幹細胞を用いた疾患モデルを生成するメソッドの編集は、幹細胞の研究室で標準的なルーチンのアプローチにすぐになります。最後に、正確なゲノム編集幹細胞病モデルを超えて移動することが可能になるし、潜在的触媒作用で細胞ベースの治療を助けることができます。

<table><tbody><tr><td>仙台ウイルスベクター - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>氷上で解凍;S No:1</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0.05%、100 ml;S No:2</td></tr><tr><td>岩石阻害剤(Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>10 &mu;M;S No: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S No: 4</td></tr><tr><td>Serum replacement (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S No: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X;S No: 6</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Aliquot;S No:7</td></tr><tr><td>L-グルタミン(Glutamax、100X)、液体</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100;S No: 8</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100;S No: 9</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1,000;S No: 10</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S No: 11</td></tr><tr><td>0.1% ゼラチン溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>37&ordm;Cを1時間。S No: 12</td></tr><tr><td>SSEA-4 抗体</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100;S No: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4745S</td><td>1/200;S No: 14</td></tr><tr><td>OCT4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1,000;S No:15</td></tr><tr><td>コラーゲンI、ラットテール</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA10483-01</td><td>冷やしてください。S No: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluorescent 488/568 (secondary antibodies)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2,000;S番号:17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ハイクロン</td><td>SH30028LS</td><td>1X;S No:18</td></tr><tr><td>100mm組織培養皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S No:20</td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S No:21</td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S No:22</td></tr><tr><td>解剖スコープ&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>SMZ745</td><td>S No:23</td></tr><tr><td>ピッキングフード</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S No:24</td></tr><tr><td>15&nbsp;ml遠心分離チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S No:25</td></tr><tr><td>50&nbsp;ml遠心分離管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S No: 26</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S No: 28</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Σ</td><td>M7522</td><td>S No: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No: 31</td></tr><tr><td>Countess&trade;Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No: 32</td></tr><tr><td>Faxitron X-ray system</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>S No: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S No: 34</td></tr><tr><td>Collagenase Life</td><td>Technologies</td><td>17104019</td><td>1mg/ml ストック;S No: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No: 36</td></tr><tr><td>hESC qualified matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>希釈するには、冷たいDMEM/F-12を使用してください。S番号:37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R &D</td><td>233-FB</td><td>ストック 10 ug/ml;S No: 38</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>PBS の 4% 在庫;S番号:39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-21705</td><td>1/100;S No: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100;S No: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No: 42</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼキット</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S No: 43</td></tr><tr><td>Cas9 protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>解凍と分注;S No: 44</td></tr><tr><td>ヤギまたはロバ血清</td><td>Σ</td><td>D9663/G9023</td><td>S No: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Σ</td><td>X100-100ML</td><td>S No: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S No: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Σ</td><td>9285-100ML</td><td>S No: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Σ</td><td>S7653-250G</td><td>S No: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Σ</td><td>BP2482-500</td><td>S No.: 50</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S No: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S No: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S No: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S No: 54</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S No: 55</td></tr><tr><td>CloneJET クローニングキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No: 56</td></tr><tr><td>Fragment analyzerTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>S No: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>温まる温度;S No: 58</td></tr><tr><td>凍結中型 mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No: 59</td></tr><tr><td>凍結培地 CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No: 61</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No: 62</td></tr><tr><td>ヒト膵臓細胞</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S No: 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade;神経誘導媒体</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5835</td><td>S No: 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>S No: 65</td></tr><tr><td>2% B27-インスリン</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>S No: 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>S No: 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>S No: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td>S No: 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>S No: 70</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>S No: 71</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>S No: 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>S No: 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>S No: 74</td></tr><tr><td>TUJ1抗体</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S No: 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No: 76</td></tr><tr><td>SOX17 antibody</td><td>R &Dシステム</td><td>AF1924</td><td>S No:77</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No:78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade;</td><td>ロンザ</td><td>AAF-1002</td><td>S No: 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (cell sorter)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S No: 80</td></tr></tbody></table>

効率的な生成および crispr cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から ips をフィーダー フリーの編集

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

胚性人工多能性幹細胞は自己更新でき、体の種類の細胞に分化します。多能性細胞は再生医療の研究のためこのように切望され、眼疾患、糖尿病、心臓病や他の疾患の臨床試験は、現在。ゲノム編集 CRISPR/Cas システムを含む技術の最近の進歩と相まって種類の専門にされた細胞に区別するために潜在的な様々 なアプリケーションの iPSC のゲノムを仕立ての追加の機会を提供しています。疾患モデル、遺伝子治療を含む、いくつかの名前への分化の経路をバイアスします。利用可能な編集技術の中で化膿連鎖球菌から CRISPR/Cas9 は、真核生物のゲノムのサイト固有の編集に最適なツールとして浮上しています。CRISPRs は、簡単にアクセスでき、安価で、ターゲットを絞った編集工学で非常に効率的です。Cas9 ヌクレアーゼとガイド シーケンス (20 mer) の 3 塩基"NGG"protospacer-隣接する-モチーフ (PAM) 普遍的な Cas9 バインド トレーサー RNA (と一緒に目的の genomic 位置に Cas9 をターゲットに隣接しているゲノムのターゲットに特定システムが必要です。一緒に呼ばれる 1 つのガイド RNA または sgRNA)。ここで提案するステップバイ ステップのフィーダーに依存しない、フット プリント無料 iPSC の効率的な生成のためのプロトコルし、iPSC Cas9 リボ核タンパク質 (RNP) 錯体を用いたゲノム編集の方法論を記述します。ゲノムのプロトコルを編集、効果的な Cas9 蛋白質と細胞に同時に提供する 1 つ以上のターゲットの前錯化 sgRNAs で簡単に多重化できます。最後に、必要な編集と Ips の同定と解析のためのシンプルなアプローチについて述べる。一緒に取られて、輪郭を描かれた戦略は、世代とマニホールド用 iPSC の編集を効率化する予定です。

この文書の統合またはフット プリント無料仙台のウイルスのベクトルを使用して人間の膵臓の細胞から iPSC の世代のシンプルで効率的なプロトコルを続いている我々。図 1 aは、この初期化プロトコルの概略を示しています。人間の膵臓の細胞は、Prigrow III 培地中で培養し、上述のセンダイ ウイルスで導入した商業的に、購入しました。導入された紡錘形膵細胞 〜 5 日日 0、センダイウイルスベクター伝達後の任意の形態学的変化を示さなかったが、大きな核小体と切り上げになります。週後伝達後見られたいくつかの初期のコロニーがいない、我々 の経験のように選ばれ、これらの植民地はすぐに切り離して、'初期部分的にプログラムし直されたセル' は、通常それは堅牢なコロニーを確立しないでください。約 10 〜 15 日後伝達、小さい明るいコロニーが観察され、成長 (右上図 1 b, ) の後で選ばれました。人間 iPSC のコロニーはコンパ...

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代を詳細単一細胞のクローンを作成します。

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

本手順の全体的な目的は、フィーダーフリー条件下でヒト膵臓細胞からフットプリントのない人工多能性幹細胞（iPSCs）を誘導し、次いでCRISPR-Cas9リボ核タンパク質を用いて細胞を編集し、最終的に改変された単一細胞クローンを特性解析することです。この手法は、フットプリントのないiPSCsの作製やCRISPR-Cas9リボ核タンパク質による編集など、ヒト幹細胞ゲノム編集分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、編集されたiPSCsのクローン株を高信頼性で作製でき、モザイク現象の証拠が見られないことです。6ウェルプレートをコールドコラーゲンでコーティングした後、導入日（0日目）に1ウェルあたり約2.5 x 10⁵個の細胞数、または少なくとも60%のコンフルエンシーに達するように、2日目にPrigrow III培地を用いて低継代のヒト原代膵細胞を播種します。導入当日、テキストプロトコルに従って細胞を回収および計数した後、Sendaiベクターチューブ1セットを氷上で融解し、各チューブから計算された容量を、あらかじめ温めておいた1 mLのPrigrow III培地に注意深く加えます。ピペッティングにより、溶液を穏やかに混合してください。細胞からPrigrow IIIを吸引し、リプログラミングウイルス混合液をウェルにゆっくりと加えます。その後、37 °Cのインキュベーターで細胞を一晩培養します。導入から24時間後、細胞上のウイルス混合液を慎重に除去し、新鮮なPrigrow III培地と交換します。6日目に、細胞遊離溶液を1 mL添加し、10分間インキュベートします。その後、rock阻害剤を含むPrigrow IIIを用いて、前日に調製したMEFフィーダー層のディッシュにすべての細胞を播種します。細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。プレートを定期的に観察し、リプログラミング細胞の指標となる細胞塊やコロニーの出現を確認します。これらは、石畳状の形態に大きな核と核小体を持つクローン凝集塊を形成します。iPSCの可能性が高いコロニーに印を付け、定期的に増殖を確認してください。導入から約4週間後、24ウェルMEFプレートを準備し、分析証明書に記載された希釈係数に基づいて分注してマトリックスメンブレンを調製します。24〜48個のコロニーをピックアップし、mTeSR1を含むマトリックスメンブレンコート済み24ウェルプレートに移します。プレートを24時間インキュベートし、培地を毎日交換します。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。マトリックスメンブレン上に播種された強固なコロニーを剥離させるため、dispaseを500 mcL添加します。細胞を20分間インキュベートした後、マトリックスメンブレンでコーティングした12ウェルプレートに再度播種します。テキストプロトコルに従い、アルカリフォスファターゼ染色、免疫染色、およびFACS解析を用いてクローンの増殖および特性評価を行います。テキストプロトコルに従ってsgRNAを合成した後、HIPSCをトランスフェクションするために、0.5 mcgのCas9タンパク質と0.5 mcgの各sgRNAを組み合わせ、反応総量を22 mcLとして各サンプルのニュークリアフェクション用マスターミックスを調製します。ROCK阻害剤を含む培地を吸引した後、2 mLのRTPBSを用いてhiPSCの各ウェルを洗浄します。次に、PBSを吸引し、1 mLの細胞剥離溶液を加えます。プレートを37°Cで10分間インキュベートします。細胞を3 mLのmTeSR1培地で再懸濁し、緩やかにピペッティングして単一細胞懸濁液を作成します。解離させた細胞を、5 mLのmTeSR1培地を含む15 mL遠心チューブに移します。ヌクレオフェクションマスターミックスに、P3 primary cell supplementを16.4 mcL、およびNucleofectorキットのsupplement oneを3.6 mcL加えます。細胞を計数し遠心分離した後、0.5 x 10⁶個の細胞1ユニットあたりを、あらかじめ調製した22 mcLのトランスフェクションマスターミックスで再懸濁します。細胞を速やかにNucleocuvetteストリップの1ウェルの中央チャンバーに転写します。次に、ストリップをNucleofector装置にセットし、プログラムCB150を用いて細胞をヌクレオフェクションします。ヌクレオフェクション後、10 micromolarのrock inhibitorを含む、あらかじめ温めておいたmTeSR1培地 80 mcLを、ヌクレオフェクション後の細胞が入った各ウェルに速やかに加えます。ピペッティングにより、穏やかに混合してください。ストリップから細胞を、ROCK阻害剤を含むmTeSR1培地でプレコートしたマトリックスメンブレン 12ウェルプレートの各ウェルへ慎重に移行させます。MEFプレートを調製した後の培養2日目に、単一細胞ソーティングを行う少なくとも2時間前に、HIPSCの培地をmTeSR1から1XSMC4を添加したmTeSR1に交換します。HIPSCから培地を吸引し、PBSを用いて細胞を慎重に洗浄します。次に、各ウェルに細胞剥離液を500 mcL加え、37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。各ウェルにmTeSR1を1 mL加え、ピペッティングで穏やかに数回混ぜることで、単一細胞懸濁液を作成します。単一細胞を、あらかじめ準備した96ウェルプレートの各ウェルに分注し、ソートします。ソーティングから4日後には、コロニー形成が認められるはずです。この時点で、培養液を1X SMC4を添加したHESC培地に交換します。テキストのプロトコルに従って標的DNAを抽出・増幅させた後、フラグメントアナライザキットを使用し、メーカーの指示に従って、すべてのクローンのPCR増幅された標的ゲノム領域をゲル染料ミックスで解析します。テキストプロトコルに従って、多能性iPSCクローンを確認します。Sendai virus導入前、膵細胞は典型的な紡錘形形態を示します。12日目までに、ヒト多能性細胞コロニーに似た小さく密集したコロニーがMEF上に現れます。通常、完全にリプログラミングされたヒトiPSCコロニーは非常に明確な境界線を持っており、23日から30日目までにピックアップすることが可能です。ここでは、23日目の解離したコロニーを示しています。また、膵細胞をセンダイウイルスでリプログラミングした後、コロニーをピックアップし、フィーダーフリー条件下で培養した際の典型的な位相差顕微鏡画像を示します。右側に赤色に染色されたアルカリフォスファターゼ陽性のiPSCコロニーが見えます。これらのパネルに示されているように、多能性マーカーであるOCT4およびNANOGの免疫染色によりiPSCであることが確認されました。本実験では、iPSCを細胞表面マーカーで染色し、単一細胞懸濁液を用いてFACS解析を行いました。緑色のピークは膵臓iPSCsを表し、紫色のピークはiPSC陰性細胞を含んでいます。この手順を実施する際は、セルソーティングおよび細胞培養において無菌状態または滅菌状態を維持することが重要です。本手順の後は、iPSCsやESCsにおける遺伝子ターゲティングなどの他の手法を実施することができ、精密な遺伝子改変を行うことでさらなる疑問を明らかにすることが可能です。このビデオを視聴することで、フットプリントフリーかつフィーダーフリーのiPS細胞を確実に樹立し、ゲノム編集をバイアレリック（両アレル）に行う方法について十分に理解することができます。

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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学ぶ フィーダーフリー条件下で人間膵細胞からフットプリントフリーiPSCを効率的に樹立し、CRISPR/Cas9リボ核タンパク質を用いてゲノム編集を行い、修飾単一細胞クローンを特性評価する方法。高い再現性とモザイシズムの欠如を実現します。

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