効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代を詳細単一細胞のクローンを作成します。

この手順の全体的な目標は、フィーダーフリーの条件下でヒト膵臓細胞からフットプリントフリーの人工多能性幹細胞またはIPSCを作製し、次にCRISPR-Cas9リボ核タンパク質を使用して細胞を編集し、最後に改変された単一細胞クローンを特徴付けることです。この方法は、フットプリントフリーのIPSCの生成やCRISPR-Cas9リボ核タンパク質による編集など、ヒト幹細胞ゲノム編集分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、編集されたIPSCのクローン線を高い信頼性で生成でき、モザイク現象の証拠がないことです。

6ウェルプレートを冷たいコラーゲンでコーティングした後、2日目にPrigrow III培地でヒト初代膵臓細胞を早期継代して、形質導入の日またはゼロ日目に5細胞に対して約2.5×10またはウェルあたり少なくとも60%のコンフルエンシーを達成する。形質導入の日は、テキストプロトコールに従って細胞を回収し、カウントした後、仙台ベクターチューブ1セットを氷上で解凍し、各チューブの計算量を予熱したPrigrow III培地1mLに慎重に加えます。静かにピペットで溶液を混合します。

細胞からPrigrow IIIを吸引し、リプログラミングウイルス混合物をウェルにゆっくりと加えます。次に、細胞を摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートします。形質導入の24時間後、細胞上のウイルス混合物を慎重に廃棄し、新鮮なPrigrow III培地と交換します。

6日目に、細胞剥離液1 mLを細胞に加え、10分間インキュベートします。次に、Prigrow IIIと岩石阻害剤を使用して、前日に準備したMEFの皿にすべての細胞をプレートします。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。

形態と大きな核と核小体を持つクローン凝集体を形成する再プログラムされた細胞を示す細胞塊またはコロニーの出現について、プレートを定期的に観察します。IPSCのコロニーの可能性が高いものをマークし、定期的に成長をチェックします。形質導入後約4週間後、24ウェルMEFプレートを調製した後、分析証明書の希釈係数に基づいてマトリックスメンブレムを分注してマトリックスメンブレムを調製します。

24-48コロニーをピックし、mTeSR1でマトリックスメンブレンコーティングされた24ウェルプレートに移します。プレートを24時間インキュベートし、毎日培地を交換します。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。

500 mcLのディスパーゼを添加して、マトリックスメンブレンにメッキされた堅牢なコロニーを剥離します。細胞を20分間インキュベートした後、マトリックスメンブレンでコーティングした12ウェルプレートに再度プレートします。テキストプロトコルに従って、アルカリホスファターゼ染色、免疫染色、およびFACS分析を使用してクローンを拡大および特性評価します。

テキストプロトコールに従ってSGRNAを合成した後、HIPSCをトランスフェクションするには、0.5 mcgのCas9タンパク質と0.5 mcgの各SGRNAを22 mcLの反応容量で組み合わせて、各サンプルのヌクレオアクションマスターミックスを調製します。岩石阻害剤を含む培地を吸引した後、2 mLのRTPBSを使用してISPCの各ウェルを洗浄します。次に、PBSを吸引し、1 mLの細胞剥離溶液を加えます。

プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。細胞を3 mLのmTeSR1培地に再懸濁し、ピペットで静かに上下させて単一細胞懸濁液を生成します。解離した細胞を、5 mLのmTeSR1培地が入った15 mLの遠心チューブに移します。

ヌクレオフェクションマスターミックスに、ヌクレオフェクターキットから16.4 mcLのP3初代細胞サプリメントと3.6 mcLのサプリメント1を加えます。細胞をカウントして回転させた後、0.5 x 10の各ユニットを、以前に調製したトランスフェクションマスターミックスの22 mcLで6番目の細胞に再懸濁します。細胞をNucleocuvetteストリップの1つのウェルの中央チャンバーに素早く移します。

次に、ストリップをNucleofectorデバイスに入れ、プログラムCB150を使用して細胞を核吸収します。ヌクレオフェクション後、10マイクロモルの岩石阻害剤を含む80 mcLの予熱済みmTeSR1培地を、ヌクレオフェクトした細胞の各ウェルに迅速に加えます。ピペッティングで上下させて優しく混ぜます。

細胞をストリップからウェルに穏やかに移します マトリックス膜プレコートされた12ウェルプレート mTeSR1培地と岩石阻害剤を含むプレート。MEFプレートを調製した後のインキュベーション2日目に、1XSMC4を添加したmTeSR1からmTeSR1へのHIPSC上の培地を少なくとも2時間交換してから、シングルセルソーティングを行います。HIPSCから培地を吸引し、PBSを使用して細胞をやさしく洗浄します。

次に、500 mcLの細胞剥離溶液を各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。各ウェルに1 mLのmTeSR1を添加し、数回ピペットで静かに上下させることにより、シングルセル懸濁液を作製します。単一細胞を、あらかじめ調製した96ウェルプレートの個々のウェルにソーティングします。

選別から4日後、コロニー形成が明らかになるはずです。この時点で、培地を1X SMC4を添加したHESC培地と交換します。テキストプロトコルに従って標的DNAを抽出および増殖した後、フラグメントアナライザーキットを使用して、製造元の指示に従って、ゲル色素ミックスを介してすべてのクローンのPCR増幅標的ゲノム領域を実行します。

テキストプロトコルに従って多能性IPSCクローンを確認します。センダイウイルス形質導入以前は、膵臓細胞は典型的な紡錘体様の形態を示していました。12日目までにMEF上には、ヒト多能性細胞コロニーに似た小さなタイトなコロニーが現れます。

通常、完全に再プログラムされたヒトIPSCコロニーは非常に明確な境界を持ち、23日目から30日目までにピックアップできます。23日目の解離したコロニーがここに示されている。ここに示されているのは、ピッキング後のIPSCコロニーと、膵臓細胞のセンダイウイルスリプログラミング後のフィーダーフリー条件での培養の典型的な位相コントラスト画像です。

右側にはアルカリホスファターゼ染色された赤色IPSCコロニーがあります。IPSCは、これらのパネルに見られるように、多能性マーカーOCT4およびNANOGの免疫染色によって確認されました。この実験では、IPSCを細胞表面マーカーで染色し、単一細胞懸濁液でFACS分析を行いました。

緑色のピークは膵臓のIPSCを表し、紫色のピークにはIPSC陰性細胞が含まれています。この手順を試行する際には、細胞選別および細胞培養のための無菌または無菌状態を維持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、IPSCやESCでの遺伝子ターゲティングなどの他の方法を実行でき、正確な遺伝子改変を行うことで追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、フットプリントフリーおよびフィーダーフリーのIPSCを確実に生成し、ゲノム編集をバイアレル的に行う方法について十分に理解できるはずです。