アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

アミロイドの沈着は、さまざまな病気の最大の特徴し、多くの異なった器官を苦しめます。本稿では、発光性共役オリゴチオフェン蛍光蛍光顕微鏡技術との組み合わせで染色の応用について説明します。この染色法は、検出と臨床的および科学的設定でタンパク質凝集体の探査のための強力なツールを表します。

この方法の全体的な目標は、臨床および科学的なセットアップの両方でタンパク質凝集体沈着物を検出することです。プリオン病およびアルツハイマー病の動物モデルからの組織におけるヘプタホルミルチオフェン酢酸染色および分析について記載しています。この方法は、少量のタンパク質凝集体の存在やそれらの固有の構造変化など、アミロイドフィールドの重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の利点は、他の従来の手法よりも選択的で感度が高いことです。この技術の意味は、プローブを目的の視覚化技術に合わせて調整する可能性があるため、さまざまなタンパク質ミスフォールディング疾患の治療または診断にまで及びます。一般に、この分析法に不慣れな人は、hFTAAが非常に低い染色濃度を必要とするため、苦労します。

また、HFTAAは、従来の色素と比較して、励起波長と発光波長が長くなります。凍結乾燥hFTAAを2ミリモルの水酸化ナトリウムに再懸濁して、1ミリグラム/ミリリットルのストック溶液を調製することにより、発光性標識オリゴチオフェン溶液を調製します。ストック溶液をガラスバイアルに移し、摂氏4度で保存します。

ホルマリン固定パラフィン包埋切片を使用する場合は、キシレンで一晩脱パラフィンします。染色当日は、切片を99%エタノール、70%エタノール、dH2O、およびPBSの連続浴に毎回10分間浸漬します。次に、組織切片を周囲条件下で乾燥させます。

ティッシュが乾燥している間に、PBSでストックを10, 000に希釈することにより、hFTAAの作業溶液を調製します。組織が乾いたら、hFTAAワーキングソリューションの液滴を各組織切片に追加して覆います。室温で30分間インキュベートします。

染色液を500マイクロリットルのPBSで洗い流し、スライドをPBS浴に10分間浸します。常温条件下で切片を乾燥させた後、蛍光封入剤を使用して封入します。封入剤が一晩沈殿するのを待ちます。

アミロイド検出は、実装後すぐに行うことも、実装せずに行うこともできます。ただし、実験の目的が高品質のスペクトル情報を収集することである場合は、一晩のインキュベーションが望ましいです。顕微鏡ソフトウェアを開き、プロジェクトに名前を付け、スペクトル画像を選択して、取得を開始します。

436ナノメートルの励起フィルターを使用して接眼レンズを通して目的の物体を選択し、光路をカメラにシフトします。ケースデータマネージャーで、サンプルタイプスペクトルを選択し、サンプルにラベルを付けて、取得を押します。取得ウィンドウが開きます。

[スペクトルイメージング]で、設定メニューを開き、取得プロパティを選択し、スペクトル範囲を460〜700に、最大速度での速度品質を、測定タイプをガスレーザーナローフィルターに設定します。ダイアログボックスを閉じます。画像メニューで、「ライブフル」を選択します。

アイコンのバーで、フリンジをオフにします。イメージ化する領域を選択し、ピーク メモリ値が 800 MB 未満であることを確認します。露光時間を、画像の合計輝度が 1, 000 から 3, 000 の間の値に設定します。

アイコンのバーで、色付きのカメラを押します。買収が開始されます。画像取得が完了したら、スペクトル画像取得ダイアログボックスで保存を、ケースデータマネージャーダイアログボックスで新規セルを押します。

ケースデータマネージャーから、分析開始ボタンを使用して収集した画像を開きます。データ分析ウィンドウが開きます。スペクトル情報は、スペクトル表示ダイアログボックスを使用してROIを選択することにより、画像の各ピクセルから収集できます。

[定義] を選択し、画像の関連領域から ROI を選択します。Libボタンを使用して、スペクトルデータをテキストファイルとして保存します。保存したtxtファイルは、任意の解析ソフトウェアにインポートできます。

顕微鏡ソフトウェアを開き、共焦点顕微鏡のセットアップから始めます。レーザー強度を 0.2% にピンホールを 1 エアリーユニット、フレームサイズを 1 、 024 x 1 、 024 ピクセルに設定し、スキャン速度を 7 として 16 スキャンで平均し、ビット深度を 8 ビットに設定します。発光スペクトルを収集するには、ラムダモードを選択し、アルゴンレーザーを488ナノメートルに設定します。

32チャンネルのガスプ検出器で22チャンネルを使用して、499〜691ナノメートルの発光を収集します。ゲインを 755 に設定します。ライブボタンをクリックし、パレットを範囲インジケーターに変更し、赤のピクセルが過負荷にならないようにゲインを調整します。

停止ボタンをクリックし、スナップボタンで画像をキャプチャします。シングルチャンネル画像を実現するには、スマートセットアップオプションを選択します。FITC と Alexa 532 を選択します。

線形アンミキシングを選択し、適用します。ピクセルが過負荷にならないようにゲインを調整します。FITCの場合はゲインを693に設定し、Alexa 532の場合はライブモード中にゲインを433に設定します。

停止ボタンをクリックし、スナップボタンで画像をキャプチャします。顕微鏡をFLIMモードに切り替えます。ピンホールを20、励起波長を490ナノメートル、レーザー強度を0.5%に設定し、40メガヘルツのパルスレーザーを使用します。

FLIMソフトウェアで、550ナノメートルを超えるフォトンカウンティングを設定します。表示パラメータウィンドウで、最大カウントが約4, 000フォトンカウントになるまでフォトンカウントを追跡します。ファイルを保存し、SPCイメージとしてエクスポートします。

この画像は、DAPIで対比染色された肝臓肝細胞のケラチン凝集体からなるMallory-Denk体を示しています。ここでは、P62陽性封入体筋炎骨格筋組織にP62陽性封入体が示されています。この画像は、ヒトの膵臓における膵島アミロイドポリペプチドのアミロイド封入体を示しています。

ここには、ヒト腸内の免疫グロブリン軽鎖のアミロイド沈着物が示されています。この画像は、マウスの脳内にヒツジスクレイピーのプリオンタンパク質凝集体が沈着している様子を示しています。慢性消耗病に感染したマウス脳内のプリオンタンパク質凝集体を示します。

この画像は、APP23マウスの脳内のA-β-アミロイド斑を示しています。そして、この画像はAPP-PS1マウスの脳のA-β病理を示しています。ヒト患者のトランスサイレチンアミロイドの診断サンプルからのこれらの脂肪生検塗抹標本は、標準的なコンゴレッドスコアに従って1から4に等級付けされました。

黄色の領域はhFTAAで染色されたトランスサイレチンアミロイド沈着物を示し、青色は脂肪組織からの自家蛍光です。この手順を試みるときは、適切な低濃度で染色することを忘れないようにすることが重要です。また、ロングパスフィルターを使用して最大のコントラストを得るため、また自家蛍光やバックグラウンド染色蛍光を避けることを忘れないでください。

この手順に続いて、凝集タンパク質を同定し、共凝集タンパク質を同定するために、免疫蛍光法などの他の方法を実施することができる。その開発後、この技術は、アミロイドーシスの分野の研究者がタンパク質凝集構造を探索し、有機化学がこれらの標的に対する新しいプローブを設計する道を開きました。このビデオを見れば、LCO染色からイメージングまでの方法をそれぞれ異なる技術で理解できるはずです。