Name: 角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ角膜組織工学における神経間質相互作用の3次元in vitroモデル構築法。角膜疾患のメカニズム解明と標的薬剤開発への応用が可能です。

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心から感謝博士ベン ファウラー TEM 実験で彼の技術的な助けを拡張したいと思います。

このプロトコル オクラホマ州健康科学センター大学/機関審査委員会 (IRB #4509) のガイドラインに従います。プロトコルのすべての部分は、ヘルシンキ宣言の原則を会った。国立開発研究所 (NDRI) とオクラホマ州のライオンズ ・ アイバンクから角膜のサンプルを得た。
1. 初代培養細胞の分離
<ol><li>人間の角膜組織サンプルの受領、21.5 cm2シャーレ ダルベッコ滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 2 mL を含む組織に転送 (1 x)。</li>
	<li>こすり、角膜ドームの顔アップを配置することで角膜の上皮を取り外します。完全な除去を確実に、45 ° の角度でかみそりの刃を使用して徹底的に上皮層をこすり落とします。次に、角膜ドーム下向きに反転し、徹底的に完全な除去を確実に 45 ° の角度でかみそりの刃と間質から血管内皮細胞をこすり落とします。DPBS と間質組織を洗浄します。</li>
	<li>間質組織を DPBS を使用してすべての時間で濡れている間質の部分を維持 10 番外科ブレードを使用して小さな断片にカットします。メディア (フラスコあたり 2 × 2 mm の組織の 4 または 5 の部分) を使用しないコート t25 フラスコ培養用フラスコに滅菌鉗子と場所を間質部分をピックアップします。</li>
	<li>約 30-40 分の 37 ° C でフラスコの底に付着する外植体を許可します。イーグル最小必須培地 (実装された EMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) および 1% を含む追加ゆっくりと付着、一度抗生物質/Antimycotic 外植片を妨げないでフラスコに。</li>
	<li>37 ° c、5% CO2インキュベーターでフラスコをそっと置きます。セルを分離する開始されるまで外植片を行わないでとフラスコ内で移行します。約 2-4 週間後電池が 100% の合流点に達する必要があります。100% 合流時に培養メディアを削除することによって、セルを通過し、DPBS とセルを洗ってください。</li>
	<li>セルにトリプシンを追加し、37 ° C でそれらを孵化させなさい約 5 分後に彼らが切り離されることを確認を光学顕微鏡下で細胞を表示し、新鮮なメディアを追加することによって、タンパク質の分解を停止します。</li>
	<li>1,000 x g. での遠心分離は、ペレットを乱すことがなく上澄みを慎重に削除の 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送し、中断の新鮮な実装された EMEM のセル 10% FBS 1% 抗生物質。セルをカウントし、種子の新鮮な実装された EMEM のさらなる拡大のためコート t75 フラスコ培養用フラスコに約 1 × 106セル 1% FBS 1% 抗生物質。</li>
</ol>2. プライマリ HCFs 文化と 3 D 構造アセンブリ
<ol><li>3 D をアセンブルするから構造外植片の栽培実装された EMEM 10% FBS 1% 抗生物質/Antimycotic、通過カウント HCFs。</li>
	<li>種子の約 1 × 106細胞/ウェルと共に新鮮な EMEM の 1.5 mL の 3 D 構造から 0.4 μ m の細孔を有するポリカーボネート膜挿入の主な HCFs の 10% FBS 1% 抗生物質/Antimycotic コンス トラクターの先頭に。同じメディア別 1.5 mL を各構成要素の下に追加します。</li>
	<li>細胞播種の 24 h 後に実装された EMEM 細胞の培養 10% FBS 1% 上追加 1.5 mL と 1.5 mL の各構成要素の下に 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 酸 (ビタミン C) で刺激した抗生物質/Antimycotic。</li>
	<li>37 ° c、3 週間 5% CO2インキュベーターの文化を維持し、全体の研究期間中に毎日新鮮なメディアを供給します。さらに通路は不要です。</li>
</ol>3. 細胞分化と共培養
<ol><li>8 x 103細胞/ウェル以前組み立てられた 3 D の上に SH SY5Y ひと神経芽腫細胞の 10% を含む実装された EMEM の含む 1.5 mL をコンス トラクターに追加 3 週間後 FBS、1% 抗生物質/Antimycotic、および 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic酸 (ビタミン C) です。<ol>
<li>SH SY5Y 神経芽細胞腫細胞分化を開始する前に、少なくとも 24 時間、角膜細胞の上に成長するを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 %fbs と 10 μ M の 1.5 mL を含む実装された EMEM の細胞を刺激することによって SH SY5Y 細胞分化の開始構造上にレチノイン酸。構成要素の下に実装された EMEM 10% FBS 1% 抗生物質/Antimycotic 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 酸 (ビタミン C) の 1.5 mL を追加します。暗闇の中でレチノイン酸のステップが実行されることに注意してください。<ol>
<li>5 日間この分化メディアで細胞の培養を続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞が分化段階に達したら、1.5 mL の 2 を含む無血清培にセルを切り替える脳由来神経栄養因子 (BDNF) と 1% の nM 抗生物質/Antimycotic は、コンス トラクターの先頭に追加することによって、実装された EMEM に追加。構成要素の下に実装された EMEM 10% FBS 1% 抗生物質/Antimycotic 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 酸 (ビタミン C) の 1.5 mL を追加します。暗闇の中で BDNF ステップが実行されることに注意してください。</li>
	<li>表 1に示されるようにそれ以上の分析の処理の前に追加 2 日間培養します。</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
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<li>Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+tear+production+in+patients+with+neurotrophic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis.</a> Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).</li>
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<li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Stromal+Cell+Plasticity%3A+In+Vitro+Regulation+of+Cell+Phenotype+Through+Cell-Cell+Interactions+in+a+Three-Dimensional+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).</li>
<li>Proulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+a+human+cornea+by+the+self-assembly+approach+of+tissue+engineering+using+the+three+native+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types.</a> Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Andrades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+in+vitro+model+of+stratified+epithelial+wound+healing+with+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function.</a> Sci Rep. 6, 19395(2016).</li>
<li>Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li>
<li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis%3A+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li>
<li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li>
<li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li>
<li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li>
<li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

いくつかの研究ができる角膜疾患のよりよい理解の開発を助けると同様の治療法を発見する様々 な動物モデルの開発で注目されています。しかし、これらの研究から人間に重要な価値は確認されていません。日には、様々 な生体外モデルを開発し、広くその顕著な臨床的意義のため調査が。私たち以前に確立された 3 Dの in vitroモデルです新規のシステムで大幅ビジョン研究の医学の進歩に貢献するの体内イベント体外28の概説の真っ白な能力を示しています,29,30しますこのプロトコルの目的は、この培養角膜モデル糖尿病角膜症、円錐角膜などの角膜の疾患による合併症の細胞および分子メカニズムを研究するために使用することができますの次の世代を開発するには。、とフックス。このような進歩は、臨床的に必要な多くの新しい治療法の発見に向けた強固な基盤を提供すること。
<p class="jov...

人間の体内では、角膜は、難解な神経組織です。神経は接触、苦痛、温度のような様々 な感覚を担当し、また創傷治癒、反射を点滅、涙の生産と分泌5,6,7で重要な役割を持っています。角膜間質の神経幹は輪部の神経叢から発生し、放射状周辺の角膜実質を入力します。間質の神経組織はコラーゲン ラメラに平行、彼らはさらに小さい線維束彼らは実質5,8に向かって進むように分岐します。神経線維はさらに上皮層に浸透し、したがって、神経支配は広く広がって角膜上皮と実質の間で。したがって、神経支配は、角膜の健康と病気の状態の重要な役割を持ちます。このプロトコルでは、体内の神経間質の相互作用を模倣する、その種の最初である新しい 3 Dの in vitroモデルの進歩を明らかにします。SH SY5Y 細胞株は、神経の成長を観察するために使用も特徴と、最も確立されたラインの 1 つであるこの研究に使われました。SH SY5Y 細胞ラインは両方の基板の付着 (S 型) を生成する記載されているし、neuroblastic (N 型) 細胞を分化転換9を受けることができます。結果として、この細胞ラインは N 型セルのトリプルの連続 subclone 選択から派生するにもかかわらずそれも含まれていますレチノイン酸と脳由来を使用してニューロンへの分化過程を受けることができる S 型セルの数が少ない神経栄養因子の9。これは角膜合併症糖尿病網膜症 (DM) やその他の眼の疾患に関連付けられているのより良い理解につながる可能性がありますツールを提供します。ために取得し、眼疾患の患者から神経細胞の培養に伴う困難、この 3 Dの in vitroモデルはニューロン間相互作用の勉強と角膜実質とシグナル伝達における実質的な意味を提供します。
病的状況しばしば妥協の生活の質につながる、非常に大規模で体のさまざまな組織に影響を与えます。眼ジストロフィーは、全身疾患と視力の損失や永久的な視力低下につながる多くの場合関連付けられている一般的な合併症です。包括的な研究は、基底の細胞レベルでの効果と同様に、病気の状態の理解を深めるために不可欠。このような病気の影響を研究するには、様々 な生体内と体外のモデルはティッシュ エンジニア リング アプリケーションの助けを借りて開発されています。Corneal ティッシュ エンジニア リング アプリケーションは、科学10、11,12,13,14では、様々 な分野で大きな関心を集めているが、時に重大な制限があります。実際のアプリケーションは、拒絶反応、感染症、瘢痕10,11,12,13,14を移植角膜を含みます。正常に開発され、様々 な生体外モデル3,15,16,17,18,を設置するいくつかの研究がある19,,2021,22,23,24,25,26。3 Dの in vitroモデルは、最も有望な偉大な科学的な興味の。3 D モデルより体内の細胞および生理学的イベント線維化に重要であり、創傷治癒15,27,28,29をミラーする知られています。これらの in vitroモデルは、角膜合併症を含む異なる病状を治療するための新しい治療上のアプローチを見つけることに不可欠な役割を果たします。角膜の機能に神経支配の重要な役割にもかかわらず角膜組織設計構造2,3で末梢神経の増殖を促進するために少しの努力をしました。ただし、目的の組織機能を達成するために標的組織を模倣する提案 3 D培養細胞構造。
糖尿病角膜症神経欠陥のためここで説明するモデルのための明白なアプリケーションですが、円錐角膜、Fuchs のジストロフィーを含む人間の in vitroモデルの恩恵を受けることができますいくつかの他の角膜疾患があります。当社の 3 D モデルは、この見通しから出現し、ドラッグデリバリー システムを評価するために角膜組織の体外表現と新しい眼薬の安全性の開発を提案します。

<table><tbody><tr><td>眼の外傷や全身性疾患がないドナーからの</td><td>健康な角膜組織</td><td>NDRI</td><td></td>サンプル</tr><tr><td>Dulbecco'S リン酸緩衝液 (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>滅菌鉗子</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td></tr><tr><td>Single Edge Razor Blades</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical shales blades No.10</td><td>Feather Surgical Blade</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's 最小必須培地</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタ生物製剤</td><td>S11550</td><td>10% FBS は培地調製に必要</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15240-062</td> 1<td>% 抗生物質-抗真菌剤は培地調製に必要</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン EDTA(1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート膜インサート0.4-&mu;m孔</td><td>Corning Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>2-O-&alpha;-Dglucopyranosyl-L-アスコルビン酸 (ビタミンC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SMB00390-14</td><td>0.5 mM の濃度を研究に使用する必要があります</td></tr><tr><td>ワックスブロック</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y 神経芽細胞腫細胞</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3014-10UG</td><td>最終濃度10uMを使用</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td> 最終<td>濃度2nMを使用</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO を使用</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

角膜組織工学: in vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

ティッシュ ・ エンジニア リングは、世界角膜視力損失1に苦しんで推定 1000 万人ひと角膜交換のための需要が高いため実質的な認識を得ています。実行可能な人間の角膜、三次元 (3 D) 組織で重要な進歩のための要求に対処するため工学2,3、4を行われています。これら角膜モデル範囲簡単な単分子膜システムから多層モデルでは、3 D の完全厚さ角膜同等2に 。
ただし、3 D ティッシュ エンジニア リングの角膜疾患モデルの in vitroのコンテキストでの使用を検討多層 3 D 角膜組織構造、機能、および異なる種類の細胞 (すなわち、神経ネットワークに欠けている類似している日付上皮、実質、内皮細胞) の2,3。さらに、医薬品のための動物テストを削減する試みで角膜の in vitro組織モデルの需要が増加しています。したがってより洗練されたモデルは人間の生理的要求するシステムに合わせて必要なより患者の人口に関連するモデルの開発が絶対に必要です。主な角膜線維芽細胞 (HCFs) 健康なドナーからから神経細胞の三次元共培養モデルを搭載、角膜内の複数セル型ジストロフィー、フックス、糖尿病角膜症、円錐角膜などの病気やを受けますことを考えるSH SY5Y セルの行。これにより、初めて人間の角膜組織内の 2 つのセル型間の相互作用を調査します。このモデルが神経損傷を示す角膜疾患の神経間質相互作用に関連付けられている基になるメカニズムを解剖して可能性があると考えています。この 3 D モデルは生体内で角膜組織の基本的な解剖学的および生理学的な性質を反映し、角膜欠損を調査だけでなく、様々 なエージェントの有効性を動物実験の前にスクリーニング ツールとして将来的に使用できます。

図 1は、モデル 3 D培養作業の順を追って代表イメージです。最初のステップでは、細胞は人間の角膜から分離されます。その後、ポリカーボネート膜上に成長した、自己分泌の 3 D マトリックスを組み立てるためビタミン C と刺激します。この 3 D 構築システム、多層細胞の生体内での合成を誘導する-間質マトリックスのような。その後、神経芽細胞腫細胞が間質細胞の神経細胞の分化を開始することによって続いて上にシードされます。これは角膜の間質細胞とモデル 3 D生体外で分化した神経細胞の共培養に します。図 2は、ポリカーボネート膜を示す 3次元自己組織化構造 (図 2 a) の高倍率の透過電子顕微鏡 (TEM) 像と角膜の間質細胞が自己組織化マトリックスを分泌上シード(図 2 b) に続いて...

このプロトコルでは、新規三次元の in vitroモデル、角膜間質細胞と分化した神経細胞が一緒に培養試験と 2 つの細胞のタイプの相互作用の理解を支援するについて説明します。

角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

このプロトコルの全体的な目標は、ヒトの角膜間質細胞とそれらの天然の細胞外マトリックス中のニューロン細胞との間の細胞相互作用を調査することです。このプロトコルは、円錐角膜、糖尿病性角膜症、フックスジストロフィーなどの角膜疾患やジストロフィーの研究に拡張することができます。この方法は、特定の角膜疾患またはジストロフィー中の間質神経相互作用の根本的なメカニズムと欠陥を特定することにより、ヒト角膜生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞がin vitroで自身の細胞外マトリックスを分泌できることであり、これにより、in vivoでの実際のヒト角膜組織のより優れた、より正確なモデルが得られます。この技術の意味は、細胞間および細胞外マトリックス相互作用の評価により、角膜組織の正確な表現が保証され、より標的を絞った医薬品開発が可能になるため、角膜疾患の治療にまで及びます。現在、この方法は角膜神経の損傷と再生についての洞察を提供することができます。また、薬物のスクリーニングや開発など、他のシステムにも適用できます。ヒト角膜組織サンプルを受け取ったら、組織を2ミリリットルの滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を含む21.5平方センチメートルの皿に移します。角膜ドームを上向きに置き、カミソリの刃を45度の角度で使用して上皮層をこすり落とします。次に、角膜ドームを下にして裏返し、間質から内皮を完全にこすり落とします。間質組織をDPBSで洗浄します。間質片をDPBSで濡らしたままにし、10番の外科用ブレードを使用して間質組織を細かく切断します。滅菌鉗子を使用して、間質片を培地なしのT25培養フラスコに移します。外植片を摂氏37度でフラスコの底に約30〜40分間接着させます。間質組織を正確に切断した後、フラスコをインキュベーターに慎重に移します。30〜40分待ってから、ゆっくりとメディアを追加することが重要です。このステップは、外植片の完全な付着を可能にし、それらの剥離を防ぐために重要です。付着したら、10%のウシ胎児血清と1%の抗生物質-抗真菌薬を含むイーグルの最小エッセンシャルメディウムを、外植片を乱さずにフラスコにゆっくりと加えます。フラスコをインキュベーターに摂氏37度と二酸化炭素5%で静かに置きます。細胞がフラスコ内で分離および移動し始めるまで、外植片を邪魔しないでください。約2〜4週間後、細胞は100%のコンフルエンスに達するはずです。100%コンフルエントしたら、組織培養培地を取り出し、細胞をDPBSで洗浄して細胞を継代します。細胞にトリプシンを添加し、摂氏37度でインキュベートします。約5分後、細胞を光学顕微鏡で観察し、細胞が剥離したことを確認します。新鮮な培地を加えてタンパク質分解を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。チューブを1000 x gで遠心分離し、細胞をペレット化します。ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除き、細胞を新鮮な培地に懸濁します。細胞数を行った後、T75培養フラスコの6つの細胞に約1×10を新鮮な培地で播種し、さらに増殖させます。3Dコンストラクトを組み立てるには、まずヒト角膜線維芽細胞を継代してカウントし、次に6つのHCFの約1倍を0.4ミクロンの細孔を持つポリカーボネート膜インサートに播種します。コンストラクトの上部に1.5ミリリットルの新鮮な培地を追加します。次に、同じメディアの別の1.5ミリリットルを各コンストラクトの底にピペットで移します。24時間後、各コンストラクトの上部と下部に0.5ミリモルのビタミンCを補充した1.5ミリリットルの培地を追加します。摂氏37度、二酸化炭素5%で3週間インキュベートし、ビタミンCを含む新鮮な培地を1日おきに加えます。これにより、細胞が分泌され、細胞外マトリックスが組み立てられるようになります。3週間後、以前に組み立てた3Dコンストラクトの上に、3番目のSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞に8回10を添加します。このステップでは、正確な細胞数を計算し、細胞分化を開始する前に24時間待つことが重要です。24時間のインキュベーション後、10%FBSと10マイクロモルのレチノイン酸を含む1.5ミリリットルのEMEMで細胞を刺激し、SH-SY5Y細胞の分化を開始します。次に、ビタミンCを含む培地1.5ミリリットルをコンストラクトの底に加えます。レチノイン酸は光に敏感であるため、この手順は暗闇で実行する必要があります。5日後、細胞が分化段階に達したら、2ナノモルBDNFと1%の抗生物質-抗真菌薬を含む1.5ミリリットルの無血清培地をコンストラクトの上部に加えます。新しいビタミンCを補給した培地をコンストラクトの底に加えます。細胞をさらに2日間培養してから、さらなる分析のために処理します。これは、ポリカーボネート膜と角膜間質細胞が上部に座っていることを示す3D自己組織化構造の高倍率透過型電子顕微鏡画像です。この画像は、分化した神経細胞が上に座っているところを示しており、間質神経細胞の配置を示しています。画像の矢印は神経細胞を示しています。この手順を試みるときは、外植片を切断するときは、角膜組織を常に濡らしたままにし、手術器具とブレードを滅菌状態に保つことを忘れないでください。このビデオを見れば、このin vitroモデルを設定して使用する方法を理解し、ヒト角膜間質細胞と天然の細胞外マトリックス中のニューロン細胞との間の細胞相互作用を調査する方法について理解できるはずです。BDNF、レチノイン酸、および外科用ブレードの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切な防護服を着用するなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、初代ヒト角膜線維芽細胞と分化した神経細胞の三次元共培養モデルシステムを生成する技術を示しています。この共培養システムは、間質神経相互作用の研究に使用できます。...

ヒト角膜線維芽細胞およびニューロンの3D共培養モデルの生成

私たちは、細胞の挙動を研究する中でエレクトロスピニング膜内micropocketsを製造するための技術を報告している。具体的には、マイクロ光の組み合わせを記述し、微小特徴を備えたPLGA（ポリ（ラクチド - コ - グリコリド））角膜の生体材料デバイスの製造のためのエレクトロスピニング。...

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。...

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。...

分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル

ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。...

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

このプロトコルは、ヒトまたは羊組織の外植植物から角膜内皮細胞培養を確立し、成長させるために必要な重要なステップを記述する。膜状生体材料上の角膜内皮細胞を下塗りする方法も提示されている。...

生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

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デスメのストリッピングのみは、フックス内皮角膜ジストロフィーに起因する中枢角膜ガッタを有する患者が、末梢細胞が内皮層を再生するためにデスメの膜を剥離する実験手順である。我々は、eFGF1(NM141)によって刺激された治癒の促進を伴うジストロフィー性ヒト角膜 エクスビボ におけるDSOをシミュレートする新規方法論を提示する。...

操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を...

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

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マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

学ぶ角膜組織工学における神経間質相互作用の3次元in vitroモデル構築法。角膜疾患のメカニズム解明と標的薬剤開発への応用が可能です。

角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

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