角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

このプロトコルの全体的な目標は、ヒトの角膜間質細胞とそれらの天然の細胞外マトリックス中のニューロン細胞との間の細胞相互作用を調査することです。このプロトコルは、円錐角膜、糖尿病性角膜症、フックスジストロフィーなどの角膜疾患やジストロフィーの研究に拡張することができます。この方法は、特定の角膜疾患またはジストロフィー中の間質神経相互作用の根本的なメカニズムと欠陥を特定することにより、ヒト角膜生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、細胞がin vitroで自身の細胞外マトリックスを分泌できることであり、これにより、in vivoでの実際のヒト角膜組織のより優れた、より正確なモデルが得られます。この技術の意味は、細胞間および細胞外マトリックス相互作用の評価により、角膜組織の正確な表現が保証され、より標的を絞った医薬品開発が可能になるため、角膜疾患の治療にまで及びます。現在、この方法は角膜神経の損傷と再生についての洞察を提供することができます。

また、薬物のスクリーニングや開発など、他のシステムにも適用できます。ヒト角膜組織サンプルを受け取ったら、組織を2ミリリットルの滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を含む21.5平方センチメートルの皿に移します。角膜ドームを上向きに置き、カミソリの刃を45度の角度で使用して上皮層をこすり落とします。

次に、角膜ドームを下にして裏返し、間質から内皮を完全にこすり落とします。間質組織をDPBSで洗浄します。間質片をDPBSで濡らしたままにし、10番の外科用ブレードを使用して間質組織を細かく切断します。

滅菌鉗子を使用して、間質片を培地なしのT25培養フラスコに移します。外植片を摂氏37度でフラスコの底に約30〜40分間接着させます。間質組織を正確に切断した後、フラスコをインキュベーターに慎重に移します。

30〜40分待ってから、ゆっくりとメディアを追加することが重要です。このステップは、外植片の完全な付着を可能にし、それらの剥離を防ぐために重要です。付着したら、10%のウシ胎児血清と1%の抗生物質-抗真菌薬を含むイーグルの最小エッセンシャルメディウムを、外植片を乱さずにフラスコにゆっくりと加えます。

フラスコをインキュベーターに摂氏37度と二酸化炭素5%で静かに置きます。細胞がフラスコ内で分離および移動し始めるまで、外植片を邪魔しないでください。約2〜4週間後、細胞は100%のコンフルエンスに達するはずです。

100%コンフルエントしたら、組織培養培地を取り出し、細胞をDPBSで洗浄して細胞を継代します。細胞にトリプシンを添加し、摂氏37度でインキュベートします。約5分後、細胞を光学顕微鏡で観察し、細胞が剥離したことを確認します。

新鮮な培地を加えてタンパク質分解を停止し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。チューブを1000 x gで遠心分離し、細胞をペレット化します。ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除き、細胞を新鮮な培地に懸濁します。

細胞数を行った後、T75培養フラスコの6つの細胞に約1×10を新鮮な培地で播種し、さらに増殖させます。3Dコンストラクトを組み立てるには、まずヒト角膜線維芽細胞を継代してカウントし、次に6つのHCFの約1倍を0.4ミクロンの細孔を持つポリカーボネート膜インサートに播種します。コンストラクトの上部に1.5ミリリットルの新鮮な培地を追加します。

次に、同じメディアの別の1.5ミリリットルを各コンストラクトの底にピペットで移します。24時間後、各コンストラクトの上部と下部に0.5ミリモルのビタミンCを補充した1.5ミリリットルの培地を追加します。摂氏37度、二酸化炭素5%で3週間インキュベートし、ビタミンCを含む新鮮な培地を1日おきに加えます。

これにより、細胞が分泌され、細胞外マトリックスが組み立てられるようになります。3週間後、以前に組み立てた3Dコンストラクトの上に、3番目のSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞に8回10を添加します。このステップでは、正確な細胞数を計算し、細胞分化を開始する前に24時間待つことが重要です。

24時間のインキュベーション後、10%FBSと10マイクロモルのレチノイン酸を含む1.5ミリリットルのEMEMで細胞を刺激し、SH-SY5Y細胞の分化を開始します。次に、ビタミンCを含む培地1.5ミリリットルをコンストラクトの底に加えます。レチノイン酸は光に敏感であるため、この手順は暗闇で実行する必要があります。

5日後、細胞が分化段階に達したら、2ナノモルBDNFと1%の抗生物質-抗真菌薬を含む1.5ミリリットルの無血清培地をコンストラクトの上部に加えます。新しいビタミンCを補給した培地をコンストラクトの底に加えます。細胞をさらに2日間培養してから、さらなる分析のために処理します。

これは、ポリカーボネート膜と角膜間質細胞が上部に座っていることを示す3D自己組織化構造の高倍率透過型電子顕微鏡画像です。この画像は、分化した神経細胞が上に座っているところを示しており、間質神経細胞の配置を示しています。画像の矢印は神経細胞を示しています。

この手順を試みるときは、外植片を切断するときは、角膜組織を常に濡らしたままにし、手術器具とブレードを滅菌状態に保つことを忘れないでください。このビデオを見れば、このin vitroモデルを設定して使用する方法を理解し、ヒト角膜間質細胞と天然の細胞外マトリックス中のニューロン細胞との間の細胞相互作用を調査する方法について理解できるはずです。BDNF、レチノイン酸、および外科用ブレードの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切な防護服を着用するなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。