Name: 磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ磁気ピンセットを用いたG-quadruplexesの単一分子マニピュレーション法。G4構造の折りたたみ・展開動態と結合タンパク質による制御を測定し、分子生物学・バイオ物理学研究における治療応用の可能性を探る。

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著者が原稿を校正孟パンをありがちましょう。この作品はサポートによってシンガポール省の教育学術研究基金第 3 層 (MOE2012-T3-1-001) J.Y.; にJ.Y.; ことシンガポール メカノバイオロジー研究所を通じて国立研究財団国立研究財団、その NRF Investigatorship プログラム (NRF Investigatorship 賞号の下で総理大臣のオフィス、シンガポール、J.Y.; に NRF-NRFI2016-03H. Y に中央大学 (2017KFYXJJ153) の基礎的研究基金。

1 です単一分子の伸張のための準備の G4 DNA <ol><li>準備 5 &#39;-チオール ラベル及び 5 &#39;-5 を使用してラムダ ファージ DNA テンプレートの DDNA ポリメラーゼを用いた PCR によるビオチン dsDNA ハンドル &#39;-チオールと 5 &#39;-ビオチン。プライマー 14 ( 図 1)。両方 dsDNA のハンドルがある高い GC の内容 (&#62; 60%) DNA を防ぐために溶融高力または overstretching DNA 中に DNA を開催移行 15</li>。
	<li>浄化の PCR の製品のメーカーによると BstXI の制限の酵素と商業浄化キットとダイジェストを使用して &#39; s プロトコル</li>。
	<li>縛る G4 成形 ssDNA、および製造元によると T4 DNA リガーゼを使ってフランク ssDNA と dsDNA ハンドル &#39; s プロトコル。メーカーによると商業精製キットを使用してゲルの抽出による結紮製品を浄化 &#39; s プロトコル</li>。
</ol> 2。流路の準備 <ol><li>Coverslip のクリーニングと表面機能化 <ol><li>場所下の染色 (各 jar coverslips の 7 個セット出来る瓶カバー ガラスのトップ coverslips (#1.5、20 × 20 mm) に coverslips (#1.5、22 × 32 mm)ボリュームが ~ 20 mL)。リンス、coverslips 蒸留水の瓶で 2-5 倍です</li>。
		<li>追加 ~ 5 ~ 40% に各 jar ファイル、および 30 分の超音波洗浄で洗剤溶液の 20 mL 用蒸留水ですすぎ &#62; 洗剤を削除する 10 倍</li>。
		<li>乾燥オーブンで瓶に coverslips (~ 150 ° C;注意、ホット)、または N 2 ガス。ドライ キャビネットの乾燥トップ coverslips を格納します</li>。
		<li>使用プラズマ (O 2 ガス) coverslips 10 分の瓶の中をきれいにします。10 分間の 1% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) 液をメタノール 20 mL を準備 (注意 毒性・可燃性)。APTES をメタノールに溶解する化学発煙のフードを使用します 。
		注: は、APTES ソリューションを格納するときに湿気を避けるため。古い APTES しばしば coverslips の表面機能性の問題が発生します</li>。
		<li>プラズマ洗浄後すぐに瓶に 1 %aptes 溶液のすべてを追加し、1 h. 注ぐ 1 %aptes メタノールの特定廃棄物のボトルに廃棄物のためのインキュベートします。可燃性の化学薬品の発煙のフードでメタノールに関連の手順を実行します</li>。
		<li>メタノールと一度瓶を洗うと &#62; 10 倍蒸留水と (~ 150 ° C のオーブンで、ドライ注意、熱い)。2 週間使用中はともかく乾燥キャビネット APTES コーティング下 coverslips を格納します 。
		注: 2.1.4 を 2.1.1 から各サブ手順の後洗浄プロセスを一時停止できる次のステップにします</li>。
	</ol></li> <li>アセンブル流路 <ol><li>2 つの準備 &#34; スペーサー &#34;、すなわち、パラフィルムまたは両面テープ (〜 4 × 20 mm) 各チャネルの。長い端に沿って下部 coverslip のスペーサーの 2 つの作品を配置します。間にフローセルを形成、スペーサーのトップ coverslip の場所 (~ 10 mm × 20 mm 領域、 図 2 a B).</li>
		<li>は、パラフィルム、スペーサーとして使用する場合はヒーター (60-120 ° C; に流路を配置します。注意、ホット) 2 つ coverslips をパラフィルムで一緒に固執するトップ coverslip の両側を軽く押して中に 5-10 秒のため。結果の流路の高さがあり ~ 100 μ m、それによりチャネルのボリュームが ~ 20 μ L</li>。
		<li>漏れを避けるためにシリコーン接着剤でチャネルの長い端を密封します。シリコーン接着剤を使用して、エントリとソリューションの出口として機能する流路の開放端の小さなシンクのような構造を作る 。
		注: エントリと終了も可能 など、他の方法でワックスを使用して付着した小さなプラスチック製のリングで</li>。
		<li>4 週間乾燥キャビネットにチャンネルを保存します</li>。
	</ol></li> <li>流路の底面にテザー DNA <ol><li>アミノ酸コーティングのポリスチレン ビーズを希釈 (直径: 3 μ m) 蒸留水 1 X 200 X によるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファー。渦ビーズ ソリューションとチャンネルの流れ。孵化のためのチャネルでビーズ ソリューション 〜 30 分 1 × PBS バッファーの 200 μ L で洗浄することにより任意のバラバラのビーズを削除します</li>。
		<li>調整 (増加/減少) 50 mm × 50 mm の面積あたり 1-5 ビーズの表面密度を達成するために培養時間。3 日間参照ビーズ堆積チャンネルを格納します</li>。
		<li>Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC) パウダー 1 × PBS ソリューション (〜 0.5 mg/mL)。渦ソリューションとチャネルに、フローします 。
		注: 使用する前に新鮮なスルホ SMCC ソリューションを準備し、SMCC の加水分解を避けるためにチャンネルにすぐにそれを追加します</li>。
		<li>加温 30 分のためのチャネルの SMCC ソリューション大量洗浄 SMCC ・ ソリューションを取り外します (1 mL 〜 チャンネル ボリューム X 50) 1 × PBS 溶液 。
		注: 余分な SMCC を丁寧に洗います。この手順は、上の DNA の結合のために非常に重要です</li>。
		<li><ol><li>DNA テザリング の希釈、チオール-ビオチンは DNA の結果 DNA 濃度の 1 X PBS に 〜 0.3 nM。ソリューションをミックス、SMCC 被覆したチャネルに DNA の解決の流れ、室温で 30 分間インキュベートして優しくピペット (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>1x PBS 10 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) と 0.01 %2-メルカプトエタノールを含むソリューションをブロックの 200 μ L で自由な DNA を優しく洗い流す</li>。
		<li>のためのソリューション (10 mg/mL 0.01 %2-メルカプトエタノール BSA) ブロック内のチャネルの孵化によってチャネル表面ブロック &#62; 2 h; これはステップ後チャネルは実験のため準備ができています。4 ° C で準備されたチャネルを保つことができる 〜 1 日 。
		注: ブロックのステップは DNA と、coverslips に磁気ビーズの非特異的結合を減らすために重要です</li>。
	</ol></li></ol> 3。磁気ピンセット セットアップおよび単一の識別 dsDNA テザー <ol><li>磁気ピンセット セットアップ <ol><li>スタート磁気ピンセット制御プログラム。ここで、磁気ピンセットは社内記述の LabVIEW プログラムによって制御されたします</li>。
		<li>は、チャネルをマウントする前に磁石の中心を合わせます。4 X 対物レンズを使用して顕微鏡の光軸に磁石の x 軸と y 軸を調整します</li>。
		<li>はコンピューター制御の電動マニピュレーターを使用して z 方向 ( 図 2 a) 磁石を移動し、d との距離を設定 = 0 (d: coverslip の磁石との間の距離) 磁石を付けるとき顕微鏡を観察</li>。
		<li>プログラム (つまり、定数 d) 一定の力を含む力の制御を達成するためにマニピュレーターを磁石の動きと時間変動力 F (t) (すなわち、時間変化 d(t)).</li>
		<li>は明るい目的をビーズの後方散乱照明用光源は発光ダイオード (LED) を使用します。電荷結合素子 (CCD) カメラで 100 Hz のサンプリング レートでビーズ画像を収集 </l

<ol><li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA%2C+melting+bubbles%2C+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li>
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</ol>

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上記、G4 DNA の力学的安定性と G4 を使用して蛋白質の相互作用を研究するためのプラットフォームとして、単一分子磁気ピンセットが報告されます。プラットフォームを伴い、G4 DNA テザーと折り畳み展開ダイナミクス計測とナノメートル特別決議と G4 の構造安定性を見つけることの非常に効率的なプロトコルが開発されています。フォーカル プレーン ロックにより非常に安定したのドリフト防止制御を G4 など小さな構造変化を検出するために重要である (サイズのステップ 〜 7 nm) とバッファー交換実験でタンパク質との相互作用。このプラットフォームは、G4 結合タンパク質 RHAU ヘリカーゼ13の研究と同様、C-myc のプロモーター G412、テロメアの G414の折畳み・展開の原動力の研究に採用されている最近。
典型的な実験エラーは DNA と、coverslip のビーズの非特異的結合または複数の Dna が磁気ビーズにバインドします。...

4 本鎖 DNA や RNA の G4 の構造は、多くの重要な生物学的プロセス1に重要な役割を果たします。多くの蛋白質は、G4 のバインディングとテロメア結合タンパク (テロメラーゼ、POT1、RPA、TEBPs、TRF2) などの規制に関与している1,2, 転写因子 (ヌクレオリン化における PARP1)3、RNA プロセシング蛋白質 (hnRNP A1hnRNP A2)4ヘリカーゼ (BLM、FANCJ、RHAU、警告、Dna2、Pif1)5、DNA 複製関連蛋白質 (Rif1、REV1, PrimPolymerase)6に。蛋白質の結合を安定化したり G4 構造を不安定にします。したがって後続の生体機能を調節します。G4 の安定性は、熱溶融性 uv (紫外線) や円偏光二色性 (CD) の方法7を使用して測定しました。ただし、そのような条件は、生理学的な関連、タンパク質7のバインドの効果の研究に適用することは困難。
1 分子操作技術の急速な発展は、折りたたみとリアルタイム8ナノメートルの分解能での単一分子レベルでのタンパク質や DNA など、生体分子のアンフォールディングの研究を可能にしました。原子間力顕微鏡 (AFM)、光ピンセットや磁気ピンセットは、最も一般的に使用される単一分子操作方法です。原子間力顕微鏡、光ピンセット9と比較して、磁気ピンセットはドリフト防止法10,11を使用して、日間折り畳み展開単分子動態の安定した測定を許可します。
ここでは、結合蛋白質による G4 安定性の規制を検討する磁気ピンセットを用いた単一分子操作プラットフォームは報告された12,13です。この作品では、サンプルと流れチャネルの準備、磁気ピンセットのセットアップ力校正など、基本的な方法について説明します。コンスタント ・ フォース (力クランプ) など、さまざまな力のコントロールの下で長い時間測定を可能にする力の制御とドリフト防止プロトコルに記載されている手順 3 として、読み込み定数 (力ランプ)、速度し力ジャンプ測定。手順 4 で説明した力校正プロトコルによりの力校正 &#60; 広い力短い綱を 1 μ m の範囲まで 100 pN は、10% 以内の相対誤差と。RNA ヘリカーゼの安定性の規則の例は、RNA G4 はこのプラットフォームの13のアプリケーションをデモンストレーションするために使用の解決に重要な役割を果たしている AU 豊富な要素 (RHAU) ヘリカーゼ (別名 DHX36、G4R1) に関連付けられています。

<table><tbody><tr><td>DNA PCRプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA調製物</td></tr><tr><td>DNA PCR化学薬</td>品 <td>NEB</td><td></td><td>DNA調製</td></tr><tr><td>物 制限酵素 BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA調製物</td></tr><tr><td>カバースリップ(#1.5、22 * 32 mm、および20 * 20 mm)</td><td>BMH。BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>流路調製</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>流路調製</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>流路調製</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>流路調製</td></tr><tr><td>M-280、パラムガンビーズ、ストレプトアビジン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>流路の準備</td></tr><tr><td>ポリビーズアミノミクロスフェア 3.00 &mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>流路調製</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>流路調製</td></tr><tr><td>オリンパス顕微鏡 IX71</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td>磁気ピンセットのセットアップ</td></tr><tr><td>ピエゾZステージ P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>磁気ピンセットセットアップ</td></tr><tr><td>オリンパス 対物レンズ MPLAPON-Oil 100X</td><td>オリンパス</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>磁気ピンセットセットアップ</td></tr><tr><td>CCD/CMOSカメラ</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>磁気ピンセットセットアップ</td></tr><tr><td>トランスレーションリニアステージ</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>磁気ピンセットセットアップ</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>磁気ピンセットセットアップ</td></tr><tr><td>キュービックマグネット</td><td>スーパーマグネティー</td><td></td><td>磁気ピンセットセットアップ</td></tr><tr><td>Labview</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td></td><td>磁気ピンセットのセットアップ</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>データ解析</td></tr></tbody></table>

磁気ピンセットで g quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

非正規の核酸の二次構造 G quadruplexes (G4) は、DNA 複製、転写、RNA プロセシング、テロメア伸長などの多様な細胞プロセスに関与しています。これらのプロセスの中に様々 な蛋白質はバインドし、職務の遂行に G4 構造を解決します。G4 の関数は、多くの場合その折り畳まれた構造の安定性に依存、G4 結合蛋白質が G4 の安定性を調節する方法を調査することが重要です。この作業は、リアルタイムで G4 分子に G4 結合タンパク質の制御の研究を可能にする磁気ピンセットを使用して単一の G4 分子を操作するためのメソッドを示します。一般的には、このメソッドは、タンパク質・ リガンド相互作用の様々 な DNA または RNA 二次構造に規制研究アプリケーションの広い範囲に適しています。

この図の拡大版を表示するのにはここ。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56328/56328fig5.jpg"> 
G4 の展開図 5: ジャンプ力測定。 力中にビード高さ変化 (A) 代表的な時間トレース 1 pN と 54 pN 10 DmRHAU、なしで測定のサイクルをジャンプ nM DmRHAU が、ATP、なしと両方が 10 nM DmRHAU と 1 mM ATP、図パネルに記載されています。(B) (A) のデータからいくつかのジャンプ力サイクルで 54 pN にジャンプした後 G4 分子 (灰色データ) の拡張子の変更の代表的な時間トレース。(F) に対応する拡張機能と展開 (U) G4 は示されている;G4 展開イベントは、矢印で示されます。この図は、13 日<...

G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセット プラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々 なタンパク質。

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

この実験の全体的な目標は、G-四重鎖(G4と略される)のフォールディングとアンフォールディング、および磁気ピンセットを使用してタンパク質を1分子レベルで結合することによる制御を直接測定することです。このメッセージは、G4の浮遊ダイナミクスやタンパク質の結合による制御など、G4分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、磁気ピンセットが、アンチドリフト技術を使用して、単一分子のナノメートルサイズの浮遊ダイナミクスを数日間にわたって安定して測定できることです。このメッセージでこれを始めましょう、G4の安定性の分子メカニズムの内部、G4のヘリカーゼ活性を提供することができ、それはまた、潜在的な治療用途を持つ可能性のあるG4結合タンパク質、またはライガンに関連するal-a-do-geesを調査するために使用することができます。さらに、外側のタンパク質DNA相互作用、またはタンパク質タンパク質相互作用のプローブにも使用できます。この手順は、テキストプロトコールに記載されているように、流路でのG4 DNAの調製から開始します。G4 DNAは、T4 DNAライゲートを用いて、一本鎖DNA、二面一本鎖DNA、および二本鎖DNAハンドルを形成するライゲートG4によって調製されました。磁気ピンセットのセットアップでは、磁気ピンセットプログラムを開始します。ここでは、磁気ピンセットは社内の書面によるラボビュープログラムによって制御されます。次に、チャネルを取り付ける前に、磁石の中心を合わせます。顕微鏡の光学アクセスで、10倍の対物レンズを使用して、磁気のX軸とY軸を調整します。コンピュータ制御の電動マニピュレータを使用して磁石をZ方向に移動させ、磁気が顕微鏡のカバースリップに付着するときに、磁石とカバースリップの間の距離をDがゼロになるように設定します。マニピュレータを介して磁気の動きをプログラムし、一定の力や時間変化する力などの力の制御を実現します。対物レンズを通るビーズの後方散乱照明には、明るい発光ダイオード光源を使用します。ビーズ画像と100ヘルツのサンプリングレートを、変更結合デバイスカメラで収集します。テザー形成には、200 X 希釈した M280 パラマグネティックビーズをそのままの溶液でチャネルに静かに流します。混合物を10分間インキュベートして、チオール標識entを介してSMCCコード表面に固定化されたビオチン標識DNA分子にビーズが結合します。200マイクロリットルの標準反応溶液を使用して、つながれていないビーズをやさしく洗い流します。次に、チャンネルを顕微鏡ステージに取り付けます。100倍油浸対物レンズを使用して、底面のビーズを検索します。サーフェス上の参照ビードと、移動するテザー ビードを選択します。参照ビーズとテザー ビーズの両方、および

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。...

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

磁気ピンセット、強力な単一分子操作技術は、生体高分子で（磁気トルクピンセットと呼ばれる構成を使用して）およびトルク（磁気ピンセットを自由に旋回と呼ばれる構成を使用して）ツイストを直接測定するように適合させることができる。このような測定を行うためのガイドラインは、DNAおよび関連する核 - タンパク質フィラメントの研究への応用を含めて、与えられる。...

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

光ピンセットは、個々の分子を5'末端と3'末端から引き伸ばすことにより、RNAの折り畳みを研究するために使用されてきました。ここでは、ピンセット用のRNA分子を合成するための一般的な手順、装置のキャリブレーション、および単一分子を操作する方法について説明します。...

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。...

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。...

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

Bis-3-クロロピペリジン(B-CeP)は、 in...

イン・ビトロBis-3-クロロピペリジンによるG-四重鎖DNA構造のケミカルマッピング

このプロトコルは、テロメアDNA結合タンパク質(テロメア反復結合因子1...

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

このプロトコルは、蛍光顕微鏡法に基づく単一分子DNA複製アッセイの概要を示しており、DNAポリメラーゼとG-四重鎖構造などの障害物との間の相互作用をリアルタイムで可視化することができます。...

G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。...

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

学ぶ磁気ピンセットを用いたG-quadruplexesの単一分子マニピュレーション法。G4構造の折りたたみ・展開動態と結合タンパク質による制御を測定し、分子生物学・バイオ物理学研究における治療応用の可能性を探る。

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

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