ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

このイメージングデバイス製造の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの幼生の創傷治癒を顕微鏡で分析するための変更可能なプラットフォームを作成することです。この方法は、コラーゲン線維の再編成や損傷後のその後の組織再成長に対する細胞応答の寄与など、創傷治癒分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、創傷とイメージングが単一のデバイス内で行われるのに対し、尾の再成長がデバイスによって妨げられないことです。

さらに、zWEDGIの複数の機能コンパートメントは、さまざまな幼虫のステージと一連の実験プロトコルに対応するために、個別に変更することができます。まず、デバイスのPDMSコンポーネントを、テキストプロトコルに従って目的の形状と属性でモデル化します。フォトポリマー3Dプリンターで金型をプリントした後、細いブラシ、スプレーボトル内の変性アルコール、圧縮空気で金型を清掃します。

未硬化のレジン、特にマイクロチャネル領域の材料をやさしくこすり洗いして取り除きます。その後、未硬化の樹脂はゼブラフィッシュの幼生に有毒であるため、金型をUVポストキュア装置で両側に60分間ポストキュアします。200グリットのサンドペーパーを使用して、すべての天井面がサンドペーパーに接触するまで、金型のキャビティ側を平らな面に研磨します。

400 グリットと 600 グリットのサンドペーパーを使用して、軽く研磨し、金型のすべての形状面で滑らかで平坦な表面を生成します。次に、ダイヤルインジケータを使用して、サンディング後のキャビティの深さを測定し、設計の深さに近いことを確認します。型とガラスカバーディスクを水で満たされた超音波洗浄機に30分間入れるか、流水で洗い流して清掃します。

イソプロピルアルコールとろ過された圧縮空気を使用して、型とカバーを洗浄し、ブロードライします。空気中の破片による汚染を最小限に抑えるために、デバイスを製造する場所としてクリーンベンチを準備します。プラスチックカップにベースとアクチベーターを5:1の比率で注いでPDMSを作ります。

木製のクラフトスティックで2分間よく混ぜ、パンをこねるようにジェルをかき混ぜます。すべての気泡がなくなるまで、真空デシケーターで混合物を25〜45分間脱気します。次に、10ミリリットルのシリンジを使用して、各3Dプリントされた金型のキャビティに約0.75ミリリットルのPDMSを充填し、金型が半月板でわずかにオーバーフローするまで

充填された金型を45分間脱気して、充填時に形成された可能性のある追加の気泡を取り除きます。PDMS充填された金型の上にガラスカバーディスクを貼り付け、ディスクを斜めに押し下げて、気泡が閉じ込められないようにします。ガラスディスクカバーを適用するときに、余分なPDMSが排出されるのを待ちます。

次に、小さなラチェットクランプを使用して、カバーディスクを型にしっかりと保持します。効率を上げるために、マルチクランプデバイスを使用できます。PDMS装置とクランプした金型を100°Cのオーブンで90分以上硬化させます。

次に、型をオーブンから取り出し、取り扱いが容易になるまで冷まします。硬化したPDMSデバイスを含む金型をベンチバイスでクランプし、金型の形状が作業ステーションベンチと平行に上を向くようにします。先端が平らなピンセットを使用してPDMSプルタップを金型から外すことにより、PDMSデバイスの取り外しを開始します。

次に、ピンセットで金型の周囲を回ります。PDMSは摂氏100度で少なくとも90分間硬化させる必要があり、そうしないと粘着性が残り、型に付着します。デバイスを十分に長く硬化させたことを示す良い兆候は、金型とPDMSデバイスの間の界面に実際に気泡が見え、簡単に除去できることを示しています。

ろ過された圧縮空気とピンセットを使用して、プルタブをつかみ、デバイスの下に空気を吹き込むことにより、デバイスを金型からそっと持ち上げます。次に、PDMSデバイスを逆さまにしてガラス底皿のカバーの内側に置き、拘束トンネルウェッジがプラスチックに接触するようにします。次に、zWEDGIを逆さまにしたディッシュカバーと対応するガラス底のディッシュを、内側のガラスを上に向けてプラズマクリーナーに入れます。

圧力が500ミリトーに達するまで、プラズマ洗浄チャンバーを排気します。無線周波数またはRF電力を高く設定し、デバイスとアンテナをRF周波数に約2分間さらします。次に、チャンバーをゆっくりと減圧し、デバイスとディッシュをクリーンルームのフードに戻します。

PDMSデバイスをディッシュカバーから取り外します。次に、PDMS zWEDGIをガラス底皿の中央ウェルに慎重に配置して、ガラスの正しい向きに裏返します。PDMSがガラスに密着するように、ピンセットの後端を使用してマイクロチャネルの微細な形状の周りに圧力を加え、PDMSを端に向かって滑らかにします。

PDMSデバイスを軽く押し下げて、気泡がデバイスの下に閉じ込められていないことを確認します。皿に70%エタノールを加え、マイクロピペットを使用して、拘束トンネルを通るものを含めてチャネルをすすぎます。次に、エタノールを取り出し、二重蒸留水を使用してデバイスを2〜3回すすぎてから、自然乾燥させます。

チャネルにスキムミルクを入れ、装置を室温で10分間インキュベートして、皿のガラスカバースリップへの幼虫の付着を最小限に抑えます。次に、デバイスを二重蒸留水に数回静かに沈めてすすぎ、逆さまにして風乾させます。テキストプロトコルに従って幼虫に麻酔をかけた後、数マイクロリットルのトリカインE3を使用して、デバイスのチャネルを事前に濡らします。

幅広のオリフィスピペットチップを使用して、1匹の幼虫を拾い上げ、ローディングチャネルに堆積させます。次に、ピペットチップまたは同様のツールを使用して、背側がローディングチャンバーのまっすぐな端を向き、尾が拘束トンネルを向くように、幼虫をローディングチャンバーに向けます。巻線室から液体を慎重に引き出し、幼虫が拘束トンネルに流れ込むようにします。

幼虫の周りの水分を維持しながら、ほとんどの液体を取り除きます。幼虫は、ほとんどの液体が除去されるため、拘束トンネルに適切に向ける必要があります。しかし、幼虫の周りには十分な液体が残っていなければなりません。

配向はアガロース添加後に調整できますが、アガロースが固化する前に行う必要があります。1%LMPアガロースをトリカインE3で幼虫の頭上にピペットで固定し、ローディングチャンバーを満たし、アガロースが幼虫を適切な位置で固化させます。必要に応じてトリカインE3を負傷チャンバーに追加して、水分補給を維持します。.

次に、残りの 2 つのチャネルに対してこのロード プロセスを繰り返します。シリンジ針を使用して、拘束トンネルを通って負傷室に浸透したアガロースを慎重に取り除きます。創傷、短期イメージング、または創傷治療の分離には、アガロースの上にトリカインE3を追加します。.

巻線室で幼虫を巻き込むには、滅菌メスの刃を使用して尾びれを脊索の後方に横断します。必要に応じてトリカインE3を追加し、培養皿の蓋を元に戻します。麻酔をかけた幼虫を入れたzWEDGIデバイスを、60mmのガラス底皿に対応するステージインサートの倒立顕微鏡に取り付けます。

幼虫の尾を最上部のチャネルに配置し、必要に応じて皿を回転させて、尾を目的の位置にします。特定の実験に必要な幼虫を画像化します。実験の最後に、zWEDGIディッシュを顕微鏡から取り外します。

テキストプロトコルに従って幼虫と寒天を取り除いた後、エタノールと蒸留水を使用して、前に示したようにzWEDGIを洗浄し、逆さまにして風乾させます。カバー付きのデバイスは、涼しく乾燥した場所に保管してください。ここに示されているのは、第2高調波のための多光子顕微鏡を使用した画像、または尾鰭のコラーゲン繊維のSHGイメージングを使用して、zWEDGIのイメージング能力を示しています。

創傷する前に、SHGは脊索からフィン先端まで外側に放射状に広がるコラーゲン線維を検出しました。傷を負った直後、収縮したヒレの先端とヒレの中心との間の距離は、創傷の弛緩とともに増加します。zWEDGIは、経時的な3次元データの収集を可能にし、細胞外マトリックスの構造で発生する動的な変化をより完全に把握することができます。

データ収集の3D特性により、レンダリングソフトウェアを使用した空間再構成が可能になります。これらの再構成とその後の回転オプションは、フィンの収縮と緩和が画像コレクションのXY平面だけでなく、収縮状態の上向きのカールから尾が平らになるときにZ軸でも発生することを示しています。再利用可能な金型が印刷されると、製造技術は3〜4時間で完了します。

この手順を試行する際は、硬化する前にPDMSに気泡が閉じ込められていないことを確認し、デバイスを金型から取り外す前に十分に長く硬化させることを忘れないでください。この手順に続いて、局所的な薬物適用、抗体標識、RNAおよびタンパク質精製などの他の方法を実行して、薬物や阻害剤の存在が創傷治癒にどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、創傷治癒の分野の研究者がゼブラフィッシュの幼生のコラーゲン動態、免疫細胞応答、および組織再成長を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、zWEDGIの作製方法と、ゼブラフィッシュの幼生の負傷やライブイメージングに使用する方法についてよく理解できるはずです。フォトポリマー3Dプリンティング樹脂は、人体に有害であり、ゼブラフィッシュにも有毒であることを忘れないでください。未硬化の3Dプリント部品を取り扱う際には手袋を着用し、フェイスマスクを使用するなどの予防措置を講じ、プリントに残っているすべての樹脂が硬化していることを確認してから、金型にPDMSを充填しようとする必要があります。