Name: ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 学ぶ zWEDGIデバイスを用いたゼブラフィッシュ幼虫の創傷治癒ライブイメージング法。PDMS製デバイスで尾切断と長期観察を可能にし、組織再生メカニズムのリアルタイム解析に貢献します。

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著者は、プライマリ プロジェクトの光の計算の計測研究所の Morgridge 研究所から資金調達を認めたいと思います。我々 はまた、NIH # R01GM102924 から資金を認める (AH と近鉄)。KH、JMS、RS、AH、KWE 構想し、研究に設計されています。KH と JMS DL、KP、RS からのサポートとすべての実験を実行します。KH、JS、RS、AH、KWE は原稿の執筆に貢献。

注: ゼブラフィッシュ幼虫 2 〜 4 日後受精 (dpf)、ウィスコンシン大学マディソン校の研究動物リソース センターのガイドラインに従ってください用基本 zWEDGI デザインに処方されました。
 1 です。 設計と金型の 3 d 印刷 目的形状と 3 d モデリング ソフトウェア 5 で属性を持つデバイスの <ol><li>モデル、PDMS コンポーネント。空白の金型と PDMS 部分のアセンブリを作成し、PDSM 部品に対応する金型のキャビティを作成することによって PDMS 一部の否定的な型を生成します。金型を 3 D プリント ( 図 2 は、手順 1.1) の .stl ファイルとして保存します 。
	注: ここで示した金型設計 ( 図 1) の光造形 (.stl) 形式ファイル https://morgridge.org/designs/ でダウンロード可能です</li>。
	感光性樹脂 3 D プリンター ( 図 2、ステップ 1.2) を使用して <li>印刷金型。複数の金型を作る単一の印刷で可能であれば、ので複数デバイス成形できる PDMS の単一のバッチで 。
	注: の例は、0.075 mm ビーム直径と 0.05 mm 層の厚さと、感光性樹脂樹脂 5 を使用して高解像度モードでプリントしました。
	<ol><li>優しくスクラブ、未硬化の樹脂を除去するため細かいブラシ、変性アルコール スプレー ボトルで圧縮空気を使用して金型クリーン。マイクロ地域から任意の材料を削除します</li>。
		<li>後未硬化の辞任はゼブラフィッシュ幼虫 10 に有毒であると 60 分それぞれの側に UV ポスト治療装置にはカビを治すです</li>。
	</ol></li> <li>砂の平らな面に 200 の屑の紙やすりと金型のキャビティ側まですべてのシール面はサンドペーパー (チャネル形状、金型周囲の読み込み) と接触しています。軽く砂 400 と 600 粒の砂紙で徐々 に、すべてのジオメトリ フェーシング ( 図 2、手順 1.3) でフラッシュの滑らかな表面を生成します。ダイヤル ゲージ設計深度に近いことを確認するとサンディングの後、キャビティの深さを測定します。
	<ol><li>型をきれいにし、超音波クリーナー 30 分のための水でいっぱいに配置することによって流水の下でフラッシュ ディスク (1 3/4 インチの直径 1/4 インチ厚いホウケイ酸ガラスまたはアクリル ×; 金型ごとカバー 1 つのガラス) をカバーします</li>。
		<li>爆破する圧縮空気で乾燥と清潔両方金型をイソプロピル アルコールとフィルター選択された圧縮空気をカバーします。浮遊残骸からの汚染を最小限に抑えるためにデバイスを作製するのに場所としてクリーン ベンチを使用します。洗浄金型とガラスをクリーン ベンチまたは必要になるまで覆われてペトリ皿でカバーを残す</li>。
	</ol></li></ol> 2。ZWEDGI デバイスの PDMS 作製 <ol><li>注ぐ 184 による確認、PDMS シリコーン エラストマー ポリジメチルシロキサン (PDMS) で、ベースの比率 5:1 (活性化する) プラスチックのカップに。木製クラフト棒で、パンを混練のような自体にゲルをかき混ぜながら 2 分のためによく混ぜます。5 金型を使用するには、ベースと活性剤 2 g 10 g を使用します。
	<ol><li>解消ガス真空デシケータ 25 時間 45 分のための混合物すべての泡がなくなるまでです</li>。
		<li>約 0.75 ml の 10 mL の注射器を使用して金型はわずか半月板 ( 図 2、ステップ 2.1) あふれるまで PDMS の各 3 D 印刷金型の空洞を入力します</li>。
		<li>解消ガス充填充填時を形成している可能性があります追加の泡を削除する 45 分用金</li>。
	</ol></li> <li>( 図 2、手順 2.2) をトラップから泡を防ぐために斜めにディスクを押し、PDMS 充填型の上にガラスのカバー ディスクを適用します。ガラス ディスク カバーが適用される追放される余分な PDMS を許可します</li>。
	金型のカバー ディスクをしっかりとホールドする <li>使用小型ラチェット クランプします 。
	注: これは、平らな面を作成します、PDMS、硬化させるし、3 D プリント ジオメトリのガラス製カバー スリップと同じ高さに穴を生成します。また、一度に治すことができるデバイスの数を増やす、構築マルチ クランプ デバイス (例えば。 図 2、ステップ 2.3).</li>
	<li>は、90 分 ( 図 2、ステップ 2.4) 100 o C のオーブンで固定された金型の PDMS 装置を治します。オーブンから金型を除去、簡単に処理できるまでを冷却すること。クランプ装置が金属の場合は金属が残留熱による PDMS を治すため継続するを防ぐためにクランプからカビやカバー ディスク アセンブリを削除します 。
	注: デバイスがまだ少し暖かい完全治癒ではないが、金型から削除する最も簡単です。ただし、一度オーブンから、金型を削除カバー ディスクが削除されると、デバイスは離型に進む前に日のカップルのため座ることができます。場合はデバイスは、硬化オーブンから削除した後まもなく demolded は、完全に治すためにそれを可能にしながら汚染物質を最小限に抑えるため覆われてペトリ皿に置きます</li>。
</ol> 3。ガラスの皿にプラズマ接合 zWEDGI <ol><li>クランプ ベンチ逆に PDMS デバイスを含む金型、金型 &#39; s 形状、平行で作業駅のベンチに直面して。
	<ol><li>スタート PDMS プル タブをフラット先端ピンセットを使用して、金型から解放することによって PDMS デバイスを削除します。(( 図 2 は、ステップ 3.1) の鍋からケーキを除去する) のようにピンセットで金型の周囲に作業</li>。
		<li>使用は、圧縮空気と優しくプル タブにデバイスの下の空気を吹きを金型からデバイスをプルするピンセットにフィルター処理されます。別金型から PDMS を助けるために空気を許可、薄いトンネル セクション周辺特別な注意をピンセットの先端を取ってゆっくり仕事します</li>。
	</ol></li> <li>トンネル拘束ウェッジ プラスチック ( 図 2 は、ステップ 3.2) に触れているので、ガラス底皿のカバーの内側に逆さま PDMS デバイスを配置します</li>。
	<li>に逆さまに zWEDGI と対応するガラス底皿皿カバー プラズマ クリーナー ガラス内側上向き ( 図 2、ステップ 3.3)。
	<ol><li>プラズマ圧力に達する 500 mTorr まで清掃を避難</li>。
		<li>セット無線周波数 (RF) 電源高。デバイスを公開し、RF 周波数約 2 分のために料理ゆっくりと逆加圧チャンバー、クリーン ルーム フード デバイスと皿を返します</li>。
	</ol></li> <li>PDMS デバイス皿カバーから取り外します。<ol><li>ガラス底皿 ( 図 2、ステップ 3.4) の中央に慎重にピンセットのバックエンドを使用してそれを配置することでガラスを正しい向きに PDMS zWEDGI を裏返して、軽く押し下げて、PDMS空気の泡が下に挟まれていないことを確認するデバイスです。マイクロ チャンネルの分のジオメトリの周囲の圧力を適用し、( 図 5) のエッジを滑らかに、PDMS 。
		メモ: PDMS とガラスとの完全な接触はプラズマ接合からのよりよい付着を確認します。ZWEDGI デバイスは、プラズマ グラスボート 6 ウェル plat など、他の形式の底のガラス皿に結合をすることができます。e ( 図 2).</li>
		<li>はクリーン ルーム フードから取り外す前にデバイスの料理をカバーを配置します 。
		注: デバイスがガラスに固定されている一度プロトコルを一時停止できる使用の準備ができているまで</li>。
	</ol></li></ol> 4。チャネルの準備と読み込み幼虫 注: 一般的なゼブラフィッシュ飼育、ゼブラフィッシュ本、利用可能なあたりオンライン http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html で実施されました。アダルト ゼブラフィッシュと胚は、 1 を前述のように維持されました。AB 型野生菌株を使用しました。機関に従う &#8217; 生きている幼虫をイメージングの要件について具体的に s 動物ケア プロトコル。
<ol><li>リンス チャンネル、マイクロ ピペットを使用して処分をリンスするあたり 70% のエタノールを 100 μ L の最小限に抑えてチャンネル トンネルします。エタノールと 2 または 3 回二重蒸留水ですすぎを削除します。乾いた空気で乾燥させて</li>。
	<li>は、幼虫の皿のガラス基板への付着を最小限に抑えるために室温で 10 分間 (1% の水で希釈濃度) でスキムミルクでチャンネルを入力します。その後、優しく数回洗浄する二重蒸留水中のデバイスが水没します。乾いた空気乾燥させて逆さま 。
	注: プロトコルはここで一時停止することができます。ZWEDGI デバイスのこの準備には、使用する日前にいくつかを行うことができます。室温で覆われる保存します</li>。
	<li>100 μ L 2% 溶けて LMP アガロースを 100 μ L 2 と組み合わせることで (LMP) agarose E3 バッファー 11 x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine - 3-アミノ安息香酸エチル) で加温 38 o c. 準備 1% 低溶解点が 1% を維持します。38 o C ゲル化を防ぐためにホット ブロック内でアガロース/tricaine ソリューションです 。
	注: 多光子顕微鏡 11、(キャスパー 12) などのいずれかの非色素ゼブラフィッシュ バリアントを使用または 0.2 mM 色素形成を防ぐために N フェニールチオウレアを含む E3 で幼虫を維持 11 色素による近赤外域波長の吸収を最小限に抑えることです 。
	注意: N フェニールチオウレアは有毒です。機関に従う &#39; 処分規則</li>。
	E3 <li>麻酔幼虫を含む 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11 を バッファーします。幼虫が動かずとタッチの刺激に応答するまで待機します</li>。
	<li>には、Tricaine/E3 の数マイクロリットルとチャンネル事前濡れています。
	<ol><li>ピック ワイド オリフィスのピペット チップを使用して単一の幼虫を。( 図 3 a) チャンネルの読み込み中に幼虫を入金します。背側の面は、チャンバーと差し止めトンネル ( 図 3 b) に向かって尾面の直線エッジがよう、チャンバーの幼虫に回転ピペット チップまたは同様のツールを使用します</li>。
		<li>は、慎重に差し止めトンネル ( 図 3) に流入する幼虫をできるように、負傷商工会議所から羊水を抜き取る。幼虫 ( 図 3 D) の周りの水分を維持しながら、液体のほとんどを削除します。このプロセスは、負傷の商工会議所の方にわずかに皿を傾けることによって支援することができます</li>。
	</ol></li> <li>Tricaine/E3 で 1 %lmp アガロースを配置 (38 ~ o C) 幼虫に &#39; s ヘッド、チャンバー ( 図 3E) を充填します。適切な位置で幼虫を固めるための agarose を許可します。水和を維持するために必要に応じて負傷の商工会議所に Tricaine/E3 を追加します。残りの 2 チャネルのプロセスを読み込み、これを繰り返します</li>。
	<li>負傷の商工会議所 ( 図 3 f) に差し止めのトンネルを通って浸透する agarose を丁寧に注射針を使用しています。追加 tricaine/E3 (負傷、短期的イメージング、または傷治療の分離) のための agarose だけでいずれかを追加したり、培養皿 (長期用) を記入します。蒸発を防ぐために培養皿のふたを交換します。幼虫をこの時点で (無傷) イメージまたは負傷できます</li>。
</ol> 5。負傷とイメージングの幼虫 <ol><li>脊索 11 人が負傷した商工会議所 ( 図 3 G, H) の後方の垂直尾翼をトランセクト滅菌メス刃を使用しています。必要な場合追加 tricaine/E3 を追加し、培養皿のふたを置き換えます 。
	注: また、関心の発達期間によって、幼虫負傷、E3 で回復を許可して保守できるインキュベーター (28.5 o C) で彼らとしてチャンネルに読み込まれるその時点で目的のイメージングの時間まで上記で説明した</li>。
	<li>は、60 mm ガラスの下皿を収容する舞台挿入で倒立顕微鏡上に麻酔の幼虫と zWEDGI デバイスをインストールします。目的の位置にしっぽを取得する必要に応じて料理を回転最上位チャネルで幼虫の尾を探します。特定の実験に必要なイメージします 。
	注: zWEDGI 高解像度光学顕微鏡検査、蛍光広視野レーザ顕微鏡など広く適用されます。ゼブラフィッシュ幼虫を撮像パラメーターに関する考慮事項の数がありますが、特定パラメーターをイメージングは、楽器、サンプルおよび実験依存。ここでは、幼生の尾を次のパラメーターを利用したカスタム ビルド多光子顕微鏡 5 , 11 にイメージしました: 長い作業距離水浸対物レンズ、890 nm レーザー励起 X 40445/20 nm 発光フィルターと 512 x 512 解像度</li>。
</ol> 6。実験の終わり <ol><li>削除顕微鏡から zWEDGI 料理。氷水浴または 4 o C、少なくとも 20 分のために、zWEDGI を配置することによって幼虫を安楽死させるし、ハートビートや循環の有無を評価します 。
	注: 幼虫が別々 のコンパートメントに保管されるため、幼虫個別に回復できます鉗子やピペットで寒天を注意深く引いて。寒天は、頭部領域と幼虫用抗体の汚損のための固定など、その他の手順または RNA または蛋白質の抽出のための処理から削除できます</li>。
	<li>幼虫と寒天培地を除去した後エタノール zWEDGI と蒸留水、手順 4.1 で説明した清潔で乾燥空気を逆さまにセットします。ストアは、涼しい、乾燥した場所で説明します。スキムミルク (ステップ 4.2) 次の使用前に必要に応じて再コートします 。
	注: zWEDGIs 再利用できる複数回、PDMS がガラスから来るだすまで</li>。
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ZWEDGI デバイスの目的は、安定化と高分解能対物レンズの小さな作業距離内にある魚の定位によるイメージング 3 D タイムラプスをキャプチャすることです。これらの仕様を満たしながらそれはまた、以上改善ライブ イメージングのための伝統的な寒天製剤です。正しく行われていない場合によって、欠陥のあるデバイスを zWEDGI の作製 (下記参照) の 3 つの重要な手順があります。
PDMS 準備 (図 5 a)
気泡を防ぐためには、金型をドガ PDMS が追加された後。すべての泡が脱ガス後解消されているし、ガラス ディスクのアプリケーションに注意を払うことを確認してください。ガラス ディスクは、斜め下と、PDMS 内に空気がトラップされていないことを確保するために適用する必要があります。ほこりは、プロセスの手順のほとんどの間に問題をすることができます。ほこりを防ぐためには、徹底的に各クリーニングの手順を完了し、ステップ間のクリーン フード パーツを格納します。UV 硬化前...

ゼブラフィッシュ仔動脈分布の再生能力ように理想的なモデル有機体傷害応答として、癒しと再生1,2,3、4を調べること。アクセス トランスジェニックゼブラフィッシュ ラインおよびゼブラフィッシュの解剖学的なさらなる透明性の配列には、傷応答イベントとして長期的な再生プロセス4の研究生体内でそのユーティリティを強化します。したがって高画質タイムラプス蛍光顕微鏡を使用してこれらの生物学的過程の研究は、生存率を維持しながら高い安定性とゼブラフィッシュ幼虫の最小限の動きは、ライブ イメージング ゼブラフィッシュ デバイスを要求します。それはキー デバイスにより、ヒーリングしながら効果的な負傷のため、再生発生装置によって影響を受けないです。
Agarose のライブ イメージング中に幼虫を埋め込みの標準的なライブ画像安定化方法の成長を制限する傷の再生5と幼虫が 4 の後心臓ストレスと組織壊死の徴候を示し始めるので、死亡率を高める可能性があります。時間4。したがって、関心領域から agarose の除去は正常な開発を許可する必要があります、再生6、agarose として潜在的な損傷に幼虫を公開を切り取る。さらに、技術を埋め込みアガロースとユーザーを方向づけなければならない短い時間で幼虫 agarose5,6,7を固化する前に。急速に幼虫を操作するだけでなくユーザーのスキルが必要です、それはまた幼虫への損傷のリスクします。シリコン真空使用グリース、塩ビ配管その他イメージング室を作成する畝寒天井戸3または divets8など、これらの欠点を回避するためにライブ イメージングのための幼虫を安定させるための方法が記載されているが材料6と回転チューブ9、これらのメソッドの多くの集中的な厄介な多くの場合非再利用可能、労働環境操作を許可しない (薬物治療、負傷など。) 魚がマウントされた後。
したがって、zWEDGI デバイス (図 1) は、寒天試料の操作中ゼブラフィッシュ幼虫の長期のライブ イメージングを使用する実装の欠点のいくつかを克服するために設計されました。ZWEDGI は、荷重、拘束、負傷、2 〜 4 日後受精ゼブラフィッシュ幼虫のイメージングの 3 セミオープン区分室を許可する (図 1 a) で構成されます。デバイスはポリジメチルシロキサン (PDMS) からを作製し、60 mm ガラス下部イメージング皿のカバー スリップの上に配置されます。モジュラー デザインと標準的な製造技術の使用変更に対応しやすく、プロシージャの特に実験プロシージャの様々 な zWEDGI デザインただしここで示した設計は創傷治癒研究、意図されていたこと実験操作と長期的なイメージングの最小限の拘束が必要です。

<table><tbody><tr><td>Fabricate molds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solidworks Professional Accedemic Research 3Dモデリングソフトウェア</td><td>Dassault Systemes</td><td>SPX0117-01</td><td>Fisher Unitech</td></tr><tr><td>Viper Si2 SLA 3Dプリンタ</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23200-902</td><td>3Dシステム株式会社</td></tr><tr><td>Accura 60 フォトポリマー樹脂</td><td>3D Systems Inc.</td><td>24075-902</td><td>株式会社3Dシステムズ</td></tr><tr><td>変性アルコール</td><td>サニーサイド</td><td>5613735</td><td>Menards</td></tr><tr><td>UV後硬化装置</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23363-101-00</td><td>3Dシステム株式会社</td></tr><tr><td>TouchNTuff ニトリル手袋</td><td>Ansell</td><td>92-600</td><td>McMaster Carr</td></tr><tr><td>220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak サンドペーパー&nbsp;</td><td>ノートン</td><td>66261139359、54、52</td><td>MSC</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスディスク、直径2インチ</td><td>McMaster-Carr</td><td>MIL-G-47033</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>超音波洗浄剤</td><td>ブランソン</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル消毒アルコール70%</td><td>ヒドロックス</td><td>54845T43</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>10オンス透明プラスチックカップ</td><td>WNAマスターピース</td><td>557405</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>6 "クラフトスティック</td><td>パーフェクトスティックス</td><td>クラフトWTD-500</td><td></td></tr>アマゾン<tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>zWEDGI PDMSデバイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184シリコンエラストマーキット&nbsp;</td><td>ダウ・コーニング</td><td>4019862</td><td>エルワース・接着剤&nbsp;</td></tr><tr><td>10mLシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>305219</td><td>Vitality Medical Inc</td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>F42027-0000</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>4 ラチェットバークランプ</td><td>ピッツバーグ</td><td>68974</td><td>ハーバーフレイト</td></tr><tr><td>ラボオーブン</td><td>クインシーラボインク</td><td>20GC</td><td>グローバル産業用</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Aven</td><td>549825</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>圧縮空気フィルターノズル</td><td>Innotech</td><td>TA-N2-2000FT</td><td>クリーンルーム供給</td></tr><tr><td>真空ベンチ万力</td><td>ウィルトンツールグループ</td><td>63500</td><td>MSC工業用</td></tr><tr><td>55mmガラス底皿; 30mmマイクロウェル#1.5カバーガラス</td><td>Cellvis</td><td>D60-30-1.5-N</td><td>Cellvis</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Harrick Plasma</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Loading Larvae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetteman, P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール (使用前に水で 70% に希釈)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>トランスファー ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-711-5A</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td></tr><tr><td>ック 粉末スキムミルク</td><td></td><td>2902887</td><td>MP バイオメディカルズ</td></tr><tr><td>二重蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-フェニルチオル尿素</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7629</td><td>シグマ-アルドリッチ</td></tr><tr><td>トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸)</td><td></td><td>C-FINQ-UE</td><td>Western Chemical</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>ヒートブロック(ドライバスインキュベーター)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-2</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>E3バッファー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大型オリフィスピペットチップ、200 uL</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-134</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>汎用ピペットチップ、200 uL</td><td>フィッシャーブランド</td><td>21-197-8E</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td></tr>ック<tr><td>#15メスブレード&nbsp;</td><td>フェ</td><td>ザー2976</td><td>アマゾン</td></tr><tr><td>25Gシリンジ針</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD305122</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imarisイメージングソフトウェア</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

ゼブラフィッシュの幼虫は、発生生物学と創傷治癒過程の両方の重要なモデル生物です。さらに、ゼブラフィッシュの幼虫は細胞の分解能で時間と空間の動的な生命現象のライブ高解像度顕微鏡イメージングの貴重なシステムです。しかし、幼虫の発育と組織再生、ライブ イメージングの agarose のカプセル化の伝統的な方法が低下します。したがって、本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害) を設計・製作を確保しながら高分解能顕微鏡の幼虫を方向づけるための機能的区画化装置としてデバイスとその後の気ままな尾開発と再成長内尾鰭断裂。このデバイスは、負傷と生存率を維持しながら長期的なイメージングできます。ZWEDGI 型は、3 D プリントは、そのジオメトリのカスタマイズ性は多様なゼブラフィッシュ イメージング アプリケーションを簡単に変更、です。さらに、zWEDGI は、負傷や試薬の応用実験中に幼虫へのアクセスなど、数多くの利点は並列合理化されたイメージングのための複数の幼虫の方向とデバイスの再利用性を提供しています。

ZWEDGI PDMS マイクロ流体デバイス癒しとゼブラフィッシュ幼生の再生が負傷した尾鰭のライブ イメージングに関連付けられている (下記参照) 4 つの主要な機能に対応するために設計された機能的区分装置です。PDMS は、それだけ容易に利用可能ではないため、生体適合性、しかしまた金型でうまく動作するための業界標準 zWEDGI 作製に選ばれました。また、PDMS なりますデバイス再利用可能なとハード鋭利な先端のボイド デバイスが形成されます。ZWEDGI は、特にイメージング、3) 尾鰭と 4) 顕微鏡イメージングの負傷の適切な向きで 1) デバイスに幼虫、2) 拘束の読み込みを許可、以下で詳しく説明します。
読み込み
ZWEDGI デザインは、3 つのチャネルで構成されています、それぞれ 1 匹の幼虫 (<strong cla...

本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害)、オリエント、ゼブラフィッシュ幼虫を抑制するように設計の区画化装置であります。デザインは、離断尾と創傷治癒と再生の高解像度蛍光顕微鏡画像の長期的なコレクションを許可します。

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

このイメージングデバイス製造の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの幼生の創傷治癒を顕微鏡で分析するための変更可能なプラットフォームを作成することです。この方法は、コラーゲン線維の再編成や損傷後のその後の組織再成長に対する細胞応答の寄与など、創傷治癒分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、創傷とイメージングが単一のデバイス内で行われるのに対し、尾の再成長がデバイスによって妨げられないことです。さらに、zWEDGIの複数の機能コンパートメントは、さまざまな幼虫のステージと一連の実験プロトコルに対応するために、個別に変更することができます。まず、デバイスのPDMSコンポーネントを、テキストプロトコルに従って目的の形状と属性でモデル化します。フォトポリマー3Dプリンターで金型をプリントした後、細いブラシ、スプレーボトル内の変性アルコール、圧縮空気で金型を清掃します。未硬化のレジン、特にマイクロチャネル領域の材料をやさしくこすり洗いして取り除きます。その後、未硬化の樹脂はゼブラフィッシュの幼生に有毒であるため、金型をUVポストキュア装置で両側に60分間ポストキュアします。200グリットのサンドペーパーを使用して、すべての天井面がサンドペーパーに接触するまで、金型のキャビティ側を平らな面に研磨します。400 グリットと 600 グリットのサンドペーパーを使用して、軽く研磨し、金型のすべての形状面で滑らかで平坦な表面を生成します。次に、ダイヤルインジケータを使用して、サンディング後のキャビティの深さを測定し、設計の深さに近いことを確認します。型とガラスカバーディスクを水で満たされた超音波洗浄機に30分間入れるか、流水で洗い流して清掃します。イソプロピルアルコールとろ過された圧縮空気を使用して、型とカバーを洗浄し、ブロードライします。空気中の破片による汚染を最小限に抑えるために、デバイスを製造する場所としてクリーンベンチを準備します。プラスチックカップにベースとアクチベーターを5:1の比率で注いでPDMSを作ります。木製のクラフトスティックで2分間よく混ぜ、パンをこねるようにジェルをかき混ぜます。すべての気泡がなくなるまで、真空デシケーターで混合物を25〜45分間脱気します。次に、10ミリリットルのシリンジを使用して、各3Dプリントされた金型のキャビティに約0.75ミリリットルのPDMSを充填し、金型が半月板でわずかにオーバーフローするまで充填します。充填された金型を45分間脱気して、充填時に形成された可能性のある追加の気泡を取り除きます。PDMS充填された金型の上にガラスカバーディスクを貼り付け、ディスクを斜めに押し下げて、気泡が閉じ込められないようにします。ガラスディスクカバーを適用するときに、余分なPDMSが排出されるのを待ちます。次に、小さなラチェットクランプを使用して、カバーディスクを型にしっかりと保持します。効率を上げるために、マルチクランプデバイスを使用できます。PDMS装置とクランプした金型を100°Cのオーブンで90分以上硬化させます。次に、型をオーブンから取り出し、取り扱いが容易になるまで冷まします。硬化したPDMSデバイスを含む金型をベンチバイスでクランプし、金型の形状が作業ステーションベンチと平行に上を向くようにします。先端が平らなピンセットを使用してPDMSプルタップを金型から外すことにより、PDMSデバイスの取り外しを開始します。次に、ピンセットで金型の周囲を回ります。PDMSは摂氏100度で少なくとも90分間硬化させる必要があり、そうしないと粘着性が残り、型に付着します。デバイスを十分に長く硬化させたことを示す良い兆候は、金型とPDMSデバイスの間の界面に実際に気泡が見え、簡単に除去できることを示しています。ろ過された圧縮空気とピンセットを使用して、プルタブをつかみ、デバイスの下に空気を吹き込むことにより、デバイスを金型からそっと持ち上げます。次に、PDMSデバイスを逆さまにしてガラス底皿のカバーの内側に置き、拘束トンネルウェッジがプラスチックに接触するようにします。次に、zWEDGIを逆さまにしたディッシュカバーと対応するガラス底のディッシュを、内側のガラスを上に向けてプラズマクリーナーに入れます。圧力が500ミリトーに達するまで、プラズマ洗浄チャンバーを排気します。無線周波数またはRF電力を高く設定し、デバイスとアンテナをRF周波数に約2分間さらします。次に、チャンバーをゆっくりと減圧し、デバイスとディッシュをクリーンルームのフードに戻します。PDMSデバイスをディッシュカバーから取り外します。次に、PDMS zWEDGIをガラス底皿の中央ウェルに慎重に配置して、ガラスの正しい向きに裏返します。PDMSがガラスに密着するように、ピンセットの後端を使用してマイクロチャネルの微細な形状の周りに圧力を加え、PDMSを端に向かって滑らかにします。PDMSデバイスを軽く押し下げて、気泡がデバイスの下に閉じ込められていないことを確認します。皿に70%エタノールを加え、マイクロピペットを使用して、拘束トンネルを通るものを含めてチャネルをすすぎます。次に、エタノールを取り出し、二重蒸留水を使用してデバイスを2〜3回すすぎてから、自然乾燥させます。チャネルにスキムミルクを入れ、装置を室温で10分間インキュベートして、皿のガラスカバースリップへの幼虫の付着を最小限に抑えます。次に、デバイスを二重蒸留水に数回静かに沈めてすすぎ、逆さまにして風乾させます。テキストプロトコルに従って幼虫に麻酔をかけた後、数マイクロリットルのトリカインE3を使用して、デバイスのチャネルを事前に濡らします。幅広のオリフィスピペットチップを使用して、1匹の幼虫を拾い上げ、ローディングチャネルに堆積させます。次に、ピペットチップまたは同様のツールを使用して、背側がローディングチャンバーのまっすぐな端を向き、尾が拘束トンネルを向くように、幼虫をローディングチャンバーに向けます。巻線室から液体を慎重に引き出し、幼虫が拘束トンネルに流れ込むようにします。幼虫の周りの水分を維持しながら、ほとんどの液体を取り除きます。幼虫は、ほとんどの液体が除去されるため、拘束トンネルに適切に向ける必要があります。しかし、幼虫の周りには十分な液体が残っていなければなりません。配向はアガロース添加後に調整できますが、アガロースが固化する前に行う必要があります。1%LMPアガロースをトリカインE3で幼虫の頭上にピペットで固定し、ローディングチャンバーを満たし、アガロースが幼虫を適切な位置で固化させます。必要に応じてトリカインE3を負傷チャンバーに追加して、水分補給を維持します。.次に、残りの 2 つのチャネルに対してこのロード プロセスを繰り返します。シリンジ針を使用して、拘束トンネルを通って負傷室に浸透したアガロースを慎重に取り除きます。創傷、短期イメージング、または創傷治療の分離には、アガロースの上にトリカインE3を追加します。.巻線室で幼虫を巻き込むには、滅菌メスの刃を使用して尾びれを脊索の後方に横断します。必要に応じてトリカインE3を追加し、培養皿の蓋を元に戻します。麻酔をかけた幼虫を入れたzWEDGIデバイスを、60mmのガラス底皿に対応するステージインサートの倒立顕微鏡に取り付けます。幼虫の尾を最上部のチャネルに配置し、必要に応じて皿を回転させて、尾を目的の位置にします。特定の実験に必要な幼虫を画像化します。実験の最後に、zWEDGIディッシュを顕微鏡から取り外します。テキストプロトコルに従って幼虫と寒天を取り除いた後、エタノールと蒸留水を使用して、前に示したようにzWEDGIを洗浄し、逆さまにして風乾させます。カバー付きのデバイスは、涼しく乾燥した場所に保管してください。ここに示されているのは、第2高調波のための多光子顕微鏡を使用した画像、または尾鰭のコラーゲン繊維のSHGイメージングを使用して、zWEDGIのイメージング能力を示しています。創傷する前に、SHGは脊索からフィン先端まで外側に放射状に広がるコラーゲン線維を検出しました。傷を負った直後、収縮したヒレの先端とヒレの中心との間の距離は、創傷の弛緩とともに増加します。zWEDGIは、経時的な3次元データの収集を可能にし、細胞外マトリックスの構造で発生する動的な変化をより完全に把握することができます。データ収集の3D特性により、レンダリングソフトウェアを使用した空間再構成が可能になります。これらの再構成とその後の回転オプションは、フィンの収縮と緩和が画像コレクションのXY平面だけでなく、収縮状態の上向きのカールから尾が平らになるときにZ軸でも発生することを示しています。再利用可能な金型が印刷されると、製造技術は3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、硬化する前にPDMSに気泡が閉じ込められていないことを確認し、デバイスを金型から取り外す前に十分に長く硬化させることを忘れないでください。この手順に続いて、局所的な薬物適用、抗体標識、RNAおよびタンパク質精製などの他の方法を実行して、薬物や阻害剤の存在が創傷治癒にどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、創傷治癒の分野の研究者がゼブラフィッシュの幼生のコラーゲン動態、免疫細胞応答、および組織再成長を調査する道を開きました。このビデオを見れば、zWEDGIの作製方法と、ゼブラフィッシュの幼生の負傷やライブイメージングに使用する方法についてよく理解できるはずです。フォトポリマー3Dプリンティング樹脂は、人体に有害であり、ゼブラフィッシュにも有毒であることを忘れないでください。未硬化の3Dプリント部品を取り扱う際には手袋を着用し、フェイスマスクを使用するなどの予防措置を講じ、プリントに残っているすべての樹脂が硬化していることを確認してから、金型にPDMSを充填しようとする必要があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

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インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

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ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

学ぶ zWEDGIデバイスを用いたゼブラフィッシュ幼虫の創傷治癒ライブイメージング法。PDMS製デバイスで尾切断と長期観察を可能にし、組織再生メカニズムのリアルタイム解析に貢献します。

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブイメージングデバイス

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