Name: リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ RT-QuIC法による鹿科動物糞便中のCWDプリオン高感度検出プロトコル。特定・感度が高く、複数サンプルの同時処理が可能なこの手法は、野生動物のプリオン病伝播動態の理解に貢献します。

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トレーニングとシカの PrP 細菌発現プラスミドを提供する博士バイロン コーイー (NIH ロッキー山研究所) に感謝しております。SG は、カナダの研究の椅子プログラムによってサポートされます。我々 はアルバータ州プリオン研究所ゲノム カナダとアルバータ州農業・林業ゲノム アルバータ州、カルガリー大学この作業を支援するから SG にこの研究のための資金を認めます。我々 は、動物研究のマーガレット ・ ガン財団から研究助成を認めます。

1 です RT QuIC 糞便材料を用いた 糞便 10 mL に 1 g の糞便材料を追加することによって <ol><li><ol><li>作る エキス シカの糞準備 の糞便磨砕液抽出バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.1 では、130 mM の NaCl、。0.05 %1 x 1 mM PMSF、トゥイーン 20 完了プロテアーゼ阻害剤、EDTA 無料) 最終濃度 10% (w/v) を与える。均質化のバッファーを利用する前に準備して-20 で格納できます ° C</li>
		<li>Homogenize 糞便ペレット (1 g) とチューブ (例えば、gentleMACS M 管) の製造業者から事前に設定プログラムで室温で 1 分のための蛋白質の分解を使用してバッファー (10 mL)。糞便のサンプルは、完全にバッファーに均質になるまで 2 〜 3 回この手順を繰り返します</li>。
		<li>パラフィルムで管を密封し、室温で 1 時間放置のロッキング プラットフォームまたはロータリー シェーカーに配置します</li>。
		<li>室温で 5 分間 18,000 × g でチューブを遠心します</li>。
		<li>収集タンパク質を含む培養上清を抽出し、それらを 1.5 mL チューブ因数。因数は、さらにアプリケーション-80 ° C で保存できます</li>。
	</ol></li> <li>濃度の PrP Sc 糞便抽出 注: 蛋白質の沈殿物のステップの追加による RT QuIC、検出感度を向上、糞抽出 CWD プリオンを集中するためにプロトコル。
	<ol><li>NaPTA 沈殿法</li> <li>N-ラウリルメタクリ油脂肪酸サルコシン (sarkosyl) 糞便蛋白質の 1 ml の 10% (w/v) の追加の 250 μ L を最終濃度 2% (v/v) の sarkosyl を与える抽出します</li>。
		<li>シール管パラフィルムでサンプルを含む、37 ° c、thermomixer で 1,400 rpm で一定振動下で 30 分間インキュベートします</li>。
		<li>リンタングステン酸ナトリウム、pH 7.4、最終濃度が 0.3% (w/v) リンタングステン酸試料中の塩化マグネシウムの 170 mM の 10% (w/v) を含む原液と糞便のタンパク質抽出物と sarkosyl のミックスを調整します</li>。
		<li>400 rpm で一定の揺れで 2 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートします</li>。
		<li>遠心分離機の 14 ° c サンプル 15,800 x g に 30 分は培養上清を慎重に削除します</li>。
		<li>洗浄バッファーでそれらを再ペレットを洗浄 (10 mM pH 7.5、100 mM の NaCl、トリス-の Cl 0.5% トリトン X 100、10 ミリメートルの EDTA、0.5% ナトリウム 0.1% とデオキシ コール酸 (w/v)、sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>遠心分離機の 14 ° c サンプル 15,800 x g に 15 分は培養上清を慎重に削除します</li>。
		<li>は、100 μ L でペレットを再懸濁します (1/10 糞便中の蛋白質の元のボリュームの抽出) RT QuIC 希釈バッファーの 。
		メモ: RT QuIC 希釈バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.9、130 mM の NaCl、0.1 %sds (w/v) および 1 つ X N2 の補足) は、利用前に用意しています。10 mL の容量は注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターで濾過、-20 ° C で使用されるまで保存されます</li>。
		<li>RT QuIC アッセイに活用までの-20 ° C で扱われる NaPTA サンプルを格納します</li>。
	</ol></li> <li>RT QuIC 法 <ol><li>新鮮な 10 mM Th T 原液 (二重蒸留 H 2 O の ml の 10 Th T の 0.032 g) を準備します</li>。
		<li>1:10 Th T ダブルで原液を蒸留 H 2 O を最終濃度 1 mm 目 T 0.2 μ m acrodisc 注射器を通してそれを注射器を用いたフィルター フィルターの希釈を行う</li>。
		<li>マウス組み換え PrP (rPrP、aa 23-231) 基板 (RT QuIC 反応あたり 10 μ g/mL) を氷に-80 ° C で保存を解凍</li>
		<li>ロード 500 μ 100 kDa のサイズの除外フィルター チューブに一度に rPrP 基板と 14,000 x g で (1 つのチューブ/フィルター使用可能最大 2 倍) 室温で 5 分間遠心します</li>。
		<li>滅菌 1.5 mL チューブに溶出した基板を転送し、使用するまで 4 ° C でそれを維持します</li>。
		<li>-20 に格納されている解凍 RT QuIC 希釈バッファー ° C</li>
		<li>RT QuIC の種 (糞便タンパク質抽出物) を希釈希釈バッファー: 
		原液のサンプル: 糞便タンパク質抽出原液を使用する 希釈 2 x 10 -1 希釈 2 x 10 -2 希釈 2 x 10 -3</li> <li>RT QuIC 反応混合物の貯蔵液の準備: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS): 5 X NaCl: 2 M 在庫ダブル蒸留 H 2 o. で塩化ナトリウム 
		EDTA: 100 mM のダブルで準備 EDTA 原液を蒸留 H 2 o.</li>
		<li>(ステップ 1.3.8) のすべてのソリューションの利用前に注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターを介して各ソリューションを個別にフィルター、滅菌常温で置かなければ</li>。
		<li>は、すべての反応に十分な混合物を持っていることを確認するこのボリュームの 10% プラス使用するサンプル (サンプルあたり 98 μ L サンプルごとの反応量と 4 つレプリケートされます) の数に応じて RT QuIC 反応混合物の容量を準備します。
		RT QuIC の反応混合物を準備する <ol><li>使用 15 mL チューブ (20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.9, 1 mM EDTA、10 μ M の 300 mM NaCl、Th T、10 μ G/ml rPrP 基板、および二重蒸留水反応 rPrP 最終濃度を調整する) 株式の sol を使用utions.</li>
			<li>は、フィルター先端のピペットを使用して上下ピペッティングでよくすべてのソリューションを混ぜます。渦の使用を可能な限り避ける</li>。
			<li>50 mL 使い捨てピペッティング シリンジに混合物を注ぐ</li>。
			<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して光 96 ウェル底面プレートの各ウェルに RT QuIC 反応混合物の 98 μ L を読み込みます</li>。
		</ol></li> <li>各 RT QuIC 反応 2 μ 原液または 10 倍に希釈した糞便タンパク質抽出物を加えます。4 つのレプリケートで各サンプルをテストします 。
		注: 各実験 CWD 陰性と確認された CWD 陽性動物から糞便サンプル (2 x 10 -3 から原液まで) のシリアル希薄として使われる正と負のコントロールそれぞれ</li>。
		<li>プレート リーダー繰り返しサイクル 1 分二重軌道振動 (700 rpm) と潜伏中休憩 1 分で 25 時間 42 ° C で培養する前にシーリング テープでプレートをシールします</li>。
		<li>蛍光測定設定を定義: 
		励起: 450 nm 排出量: 480 nm 下を読むと、点滅の数: 20 手動ゲイン: 1000 (マシンによって異なります) 積分時間: 20 μ s</li> <li>25 h の終わりにプレート リーダーからプレートを取り外します</li>
		<li>井戸間の潜在的な汚染を避けるために 3 分間 3,000 x g でプレート スピンダウンします</li>。
		<li>プレートからシールを削除します</li>。
		<li>新鮮な基板と新鮮な蛍光を含む RT QuIC の反応混合物の 90 μ L Th T を染めるは、セクション 1.3.6 に 1.3.1 で説明を追加することによって新しい 96 ウェル プレートを準備します</li>。
		<li>新しく準備された 96 の最初のプレートの各ウェルから転送 10 μ L をウェル プレートします</li>。
		<li>は新しいプレートをシールし、ステップ 1.3.13 で説明されている手順に従って追加の 50 h の RT QuIC アッセイを続行します。50 h のこの追加の手順は、75 h の全反応時間になる 
		注: バイオ セーフティ キャビネットの下で RT QuIC アッセイのすべての手順を実行します</li>。
		<li>は、データを収集します。
		<li>読み取り、ドキュメントも 15 分毎回 T 蛍光信号</li> <ol>
			<li>データ解析ソフトウェアとスプレッドシートに転送を用いた, 反応の平均の総サイクル数のデータを収集します</li>。
			<li>は、データの平均値をプロットします。RT QuIC (h) の反応時間に対応する x 軸と y 軸が相対的な蛍光単位 (RFU) に対応します。各曲線は知られていたサンプルの希釈に対応します</li>。
			<li>各試験において陰性対照の最高の平均値を計算することでしきい値を画定プラス 5 の標準偏差電流に従って公開文献 41 。
			メモ:定義済みのしきい値を交差するすべての複製は、正と見なされます。敷居をまたぐ 4 つ複製のうち少なくとも 2 つ場合サンプルは、肯定的な見なされます</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 2。組み換えプリオンタンパク質 (rPrP) の精製 <ol><li>細菌の在庫と rPrP の式の成長 注: エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) ひずみロゼッタ (DE3) ベクトル ペット 24 エンコーディングで変換、マウス PrP (23-231 残基) は、rPrP を準備していました。
	<ol><li>氷のペット 24 mPrP(23-231) と変換ロゼッタ (DE3) のグリセロール ストックを解凍</li>
		<li>連勝 LB (ルリア ベルターニカミラ) 最終濃度 50 μ G/ml のカナマイシンのプレートし、37 ° C のインキュベーターで一晩インキュベートします。細菌を含んでいる固体媒体で湿度結露を避けるためにプレートが逆さまにしていることを確認します。2 つのプレートの少なくとも 1 つの成長があることを確認する 2 つのプレートを準備します</li>。
		<li>準備 1 L LB とオートクレーブ滅菌すること</li>。
		<li>1 ml のカナマイシン (50 mg/mL)、クロラムフェニ コール (34 mg/mL) 1 mL 滅菌 LB 媒体のサプリメント 1 L.</li>
		<li>カナマイシンとクロラムフェニ コールを含む LB 培地 3 mL を接種する使い捨て接種ループを使用して、各プレートのコロニーを拾う</li>。
		<li>5-6 のための 225 rpm で一定の揺れで 37 ° C でインキュベーターでミニ文化の場所</li>
		<li>タンパク質発現の誘導のため一緒にエクスプレス Autoinduction システム 1 LB 媒体のオリジナル 1 l の残りの部分にミニ文化を追加します</li>。
		<li>場所 2 L フラスコ、またはより大きい、20-24 のための 200 の rpm で一定の揺れで 37 ° C でインキュベーターでの培養</li>
		<li>4 × 250 mL 遠沈管に 1 L 文化を分割します</li>。
		<li>室温で 20 分間 3,750 × g で文化を含んでいる管でスピンダウンします</li>。
		<li>は、上澄みを廃棄し、50 mL 遠沈管に細菌のペレットを収集、処理まで-80 ° C でそれらを凍結します。結果として得られるペレットが良い蛋白質収量 3 に 4 g を圧迫している</li>。
	</ol></li> <li>封入体の準備 <ol><li>数分の 37 ° C で冷凍餌 (3 に 4 g) を解凍します</li>。
		<li>の凍結のペレット-80 ° C で 10 分間の 1 つのより多くの時間と再び解凍。さらに 2 回を凍結融解のこの手順を繰り返します</li>。
		<li>は、1 X で細菌のペレットを再懸濁します 溶解試薬 (例えば BugBuster マスター ミックス) によって徹底的にピペッティングします。細菌のペレットの 1 g に 5 mL の試薬を使用します。完全にミックスを均質化することを確認します</li>。
		<li>室温で 20 分間ロッカーの磨砕液をインキュベートします</li>。
		<li>室温で 20 分間 16,000 x g でホモジネートを遠心します</li>。
		<li>慎重にそれにオフを注ぐことによって培養上清を破棄</li>
		<li>溶解試薬として、前の手順で使用されている X 1 の同じ量のペレットをホモジナイズしてください</li>。
		<li>常温ロッカー上で 15 分間ホモジネートをインキュベートします</li>。
		<li>1:10 の十分な量を追加 (0.1 x) 40 mL の総磨砕液の容積を得るため溶解試薬。よく均質化確認する逆解析によるミックス</li>。
		<li>4時 15 分 7,900 x g でホモジネートを遠心分離機 ° C</li>
		<li>慎重にそれを注ぐことによって上澄みを廃棄</li>
		<li>溶解試薬 x 0.1 40 mL にペレットを再懸濁します</li>。
		<li>4時 15 分 16,000 x g でホモジネートを遠心分離機 ° C</li>
		<li>それを注ぐことによって慎重に上澄みを廃棄し、さらに処理するまで-20 ° C で封入体を含むペレットを格納します</li>。
	</ol></li> <li>蛋白質の浄化 <ol><li>室温で封入体を解凍</li>。
		<li>14 ml 8 M グアニジン HCl の解凍の封入体を溶解 (38 g グアニジン塩酸塩 0.1 M ナポ 4 pH 8.0 で塗りつぶし H 2 O 50 mL に懸濁液で最終的な解決の pH を調整しない) タンパク質の可溶化</li>。
		<li>上下ピペッティングでよく均質化してください</li>。
		<li>加温 50 分間室温でロッカーのライセート</li>
		Ni NTA 樹脂の準備 18 g <li>ビーズ (3 に 4 g 細菌ペレットの 18 g) 100 mL の真空と 100 mL 0.22 μ m ボトル上部フィルターを使用して水でそれらをすすいでください。
		<ol><li>50 mL のチューブで Ni NTA 樹脂ビーズの 18 g を配置し、最終巻をするためにバッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8) の変化の十分な量を追加 50 mL まで</li>。
			<li>常温ロッカー上で 50 分間変性バッファーのビードを平衡します</li>。
		</ol></li> <li>不溶性の残骸を削除する 5 分 16,000 x g でライセートの封入体を遠心します</li>。
		<li>平衡のビーズに上清を追加し、ペレットを破棄します</li>。
		<li>は、Ni NTA 樹脂に結合する蛋白質を許可する部屋の温度で 40 分のロッカーにミックスを入れて 。
		注: ニッケル キレート ビーズは、ニッケル親和性によって PrP を浄化するために使用されます。PrP のヒスチジン豊富な N 末端領域はニッケル イオン任意の彼タグなしにバインドする蛋白質を可能にするニッケル (ii) への親和性をレンダリングします</li>。
		<li>(A と B) の両方のラインをきれいに水で洗って FPLC</li>。
		<li>変性バッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8) プライム (列が添付されていない) システムに両方のライン (A および B) を実行</li>
		<li>は、列上に樹脂をロードします。気泡を最小限に抑えることを確認してください</li>。
		<li>は、FPLC に列をアタッチし、変性バッファー 0% と 100% 年末までにバッファーを巻き戻しする変性バッファー A 100% と 0% のリフォールディング バッファー B (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0) 最初から線形グラデーションを実行します。この徐々 にシフトが 240 分 0.75 mL/min の流速で実行され、PrP の適切な折りたたみに必要です 。
		注: クロマトグラフィー精製過程では、変性の PrP は最初ゆっくり refolded 樹脂の変性バッファーを交換するリフォールディング バッファーの線形グラデーションを適用することによって。このステップはまたカオトロ ピック グアニジン HCl を削除します</li>。
		<li>100% リフォールディング バッファーは 0.75 mL/分でさらに 30 分間カラムを通過し続けて確認</li>
		<li>リンス水溶出バッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、500 mM のイミダゾール pH 5.8) A の行、列をバイパスします。これが AKTA における溶出バッファーと今取替えは変性バッファーが消去されます</li>。
		<li>2 mL/分リフォールディング バッファー B と 0% 溶出バッファー A 最初に巻き戻しバッファーと 100% 溶出バッファー 0% に 100% から 40 分間の線形グラデーションを実行することによってタンパク質を想定し, 浸出液 。
		注: 溶出バッファーのイミダゾールの集中は PrP を競う &#39; s、ニッケルの (ii) にバインドします。蛋白質一次ピークの溶出がグラデーションを介しての方法の約 1/3 始めるべきであります。
		<ol><li>増加する OD 280 nm のクロマト グラムを見る</li>。
		</ol></li> <li>大きなピークの中心に蛋白質を含んでいる管のみを収集します 。
		注: 各 2 mL の溶出画分は 15 mL チューブに収集されます</li>。
		<li>透析バッファー (10 mM リン酸ナトリウム, pH 5.8) の約 1/3 量 (1 mL) ですぐにチューブに含まれる蛋白質を希釈します</li>。
		<li>すぐに氷のチューブを配置</li>
		<li>チューブに含まれる溶出蛋白質をプールします</li>。
		<li>悪い透析カセット (分子量カットオフ 10 kDa) にタンパク質</li>。
		<li>は中古冷蔵透析バッファー (3.6 L) 4 ° C で 2 時間にカセットを入れ、一晩のため新鮮な透析バッファー (3.6 L) にカセットを転送します。作る透析バッファーが一定の攪拌下にあることを確認します</li>。
		<li>タンパク質を透析後注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターをフィルター処理します</li>。
		<li>BCA タンパク質定量キットを用いたタンパク質濃度を測定します</li>。
		<li>濃縮または希釈タンパク質濃度 0.3 mg/mL に調整する必要がある場合 。
		注: SDS ページとブルー染色で純度を確認します</li>。
		<li>マイクロ遠心チューブ用のタンパク質の 1 mL 因数を行い、すぐにさらに使用するまで-80 ° C で保存、RT QuIC プロトコルで説明されているようです</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

RT QuIC 以前尿と糞便経口感染したミュールジカとオジロジカ38エキス CWD のプリオンを検出するため採用されました。この原稿に示すシステムは、RT QuIC アッセイの適応方法です。追加の手順は、検出と CWD プリオン感染した動物の糞便材料のためのアッセイの感度を改善するために「古典的な」RT QuIC 法に取り込まれました。
糞便抽出における検出感度は RT QuIC プロトコルの改善に私たちを導いた。敏感な生体外の糞便におけるプリオンの検出を達成するために重要なステップはプリオン変換および/または伝播を妨げるし、検出感度を向上させるコンポーネントを削除するためにサンプルの準備のために追加されました。CWD 感染前臨床・臨床のエルク、播種活動を検出および糞便抽出におけるプリオン変換の検出限界を高めるために不可欠だった RT QuIC と NaPTA/sarkosyl 治療のプロトコルで基板交換を組み込む.
NaPTA 降水量は、通常を特定し検出可能な...

プリオン病または伝染性海綿状脳症 (TSE) は、牛海綿状脳症 (BSE) 牛、スクレイピー羊とヤギ、無駄に慢性的な人間のクロイツ フェルト ・ ヤコブ病 (CJD) を含む神経変性疾患シカ科1,2病 (CWD)。Tse は、特徴的な海綿状外観と脳のニューロンの損失によって特徴付けられます。「タンパク質のみ」の仮説によれば、プリオンは主に PrPSc (スクレイピーの ' Sc') 3、PrPCホストでエンコードされたプリオン蛋白変性アイソ フォーム成る。PrPScは PrPCのバインドし、他の PrPC分子に変換するシードとして機能できる ᵦ シート4,5,6の濃縮形態への変換に起因します。新しく生成された PrPSc分子は小さいオリゴマー、感染核の高い数値で結果に分解成長ポリマー 7、8に組み込まれます。PrPSc集計しやすいプロテアーゼ9,10に部分的に耐性があります。
CWD に影響を与える野生と養殖のエルク (Cervus canadensis)、ミュールジカ (ジューテリウム ドルノゴビ)、オジロジカ (WTD;ジューテリウムで子鹿) (Alces alces) ムースやトナカイ (となかい座 tarandus tarandus) 11,12,13。それはシカの相互作用と感染14,15の環境の永続性によって支持される水平伝播と最も伝染のプリオン病と見なされます。その他プリオン PrPSc蓄積と感染が脳に限られているとは異なり CWD にこれらにも、末梢組織や体液など唾液、尿、糞便16,17,18。
免疫組織化学は、CWD PrPSc分布と海綿状病変19,20を検出する診断のゴールド スタンダードと見なされます。ELISA よりまれに、西部のしみ CWD 診断に使われまた。したがって、現在のプリオン病の診断は主に事後組織でプリオンを検出に基づいています。CWD の殺診断は、扁桃腺や直腸肛門粘膜関連リンパ組織 (RAMALT) バイオプシー;ただし、このプロシージャは侵襲性があり、動物の捕獲が必要です。したがって、尿や糞便などの簡単にアクセスできる検体の使用は、CWD プリオン検出のための実用的な方法でしょう。しかし、これら糞尿港プリオン現在診断法の検出限界値以下の濃度が比較的低い。その結果より高感度・高スループットの診断ツールが必要です。変換システムの in vitroタンパク質フォールディング繰返し増幅など分析 (PMCA) 21、アミロイド播種法とリアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) 試金22,23,24はプリオン変換プロセス体外を模倣する PrPScの自己増殖する能力を悪用し、それによりごく微量検出レベル25 に PrPScの存在を増幅する非常に強力なツール ,26。RT QuIC 法はただし、変換製品の β シートの二次構造の濃縮が thioflavin T (Th T) をバインドできる具体的事実を活用します。したがって、組み換え PrP (rPrP) シードの変換時に、バインド Th T と、検出できるリアルタイムで Th T 時間をかけて相対的な蛍光ユニット (RFU) として表現の蛍光を測定することによってアミロイド線維に生えています。監視、RFU は相対的な播種活動と遅れ位相など定量的パラメーターを評価する使用できます。遅れ位相は、どの rPrP Th T 蛍光の検出限界値以下は反応の早い段階で変換のしきい値に到達するために必要な時間 (h) を表します。明らかラグの段階では、十分なアミロイド核 (核/伸び) の形成に付随の終わりは、Th T 蛍光閾値レベルを超えているし、ポジティブになるときに発生します。アミロイド線維は実際の時間と初期の PrPScやサンプルに含まれているシードの活動で検出できるの成長はより多くの種を生成するセグメンテーションによって増幅されます。これらの種は順番、アミロイド線維の成長の急速な指数段階を誘発します。
この試金は低 1 として検出することができるので PrPSc 24fg、感度の高い資格様々 な末梢組織、排泄物や他の PrPScを検出することにより、事前事後分析や非侵襲的診断を達成するためにこのテクニック感染性の低レベルをかくまっている標本の種類。RT QuIC 再現性、実用性、速さ (50 h 未満)、生物検定と比較して低コストで他のアッセイの利点を間違いなく提供します。PMCA; で使用される超音波処理など技術的な複雑さを回避します。また、各ウェルのエアロゾル汚染の危険性を最小にするテープ ・ シールのマイクロ プレートでそれを行います。複数井戸のフォーマット実験では同じ最大 96 サンプルの解析が可能。 にします。偽陽性の問題を再発と生体外の試金の変換 rPrP の自発的な転換に対抗するには、RT QuIC でしきい値 (カットオフ) の実装に便利です。確かに、ネガティブ コントロール (否定的なサンプル +5 SD 27の平均 RFU) の結果に基づき、基準を設定するから正と負のサンプル間の差別を行うことができます。各サンプルの 4 つの複製の使用はこうして複製の少なくとも 50%、肯定的な信号を示すとき肯定的なサンプルの定義に助けることができる、すなわちカットオフ28を渡ります。例えば以前の研究ではハムスター rPrP 発見されたヒトの PrPvCJDの相同の基板と比較してより敏感な基板にシードし、羊スクレイピー シード反応、RT-QuIC でシードと基板との間の相同性は必要ありません。29. ハムスター羊キメラ rPrP も人間 rPrP 30人間バリアント CJD プリオンを検出するよりもより適して基板に示唆されました。したがって、rPrP 基板上の異なる種からの使用は、この試金で非常に一般的です。この試金は散発的な CJD 31,32,33, gen などのいくつかのプリオン病に正常に適用されています。エティックのプリオン疾患34BSE 35,36,37、スクレイピー 23,36,40,4139,CWD 38、、、 42。用いた研究処理髄液、全血、唾液、尿 RT QuIC で種子が40,4139,PrPSc 38、、、を検出するすべての成功したも42アミロイド線維形成阻害剤を含む血漿などのサンプルで検出能力を育成する Orrú et al.。(2011)Scの PrP の免疫沈降 (IP) ステップと RT quic 社によるアミロイド線維形成阻害剤を削除するための戦略を開発、「quic 社強化」の試金 (eQuIC) の名前。さらに、基板交換の手順は、感度を向上させるために反応時間 〜 24 時間後採用されました。最終的には、として低 1 として PrPScの ag eQuIC 30によって検知されました。
糞便抽出物を浄化し、糞便中に可能なアッセイの阻害剤を削除、するために糞便経口感染実験にエルクから前臨床、臨床段階で収集された洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで均質化されました。糞便抽出物は、ナトリウム リンタングステン酸アルゼンチンタンゴダンスプロフェッショナル降水による蛋白質の沈殿物を利用したサンプルの PrPScを集中する異なる方法論をさらに堤出されました。最初 Safarらによって記述された NaPTA 沈殿法43, を使用して、テスト サンプルに PrPScを集中します。PrPCよりもむしろ PrPScの優遇の沈殿物のサンプルの結果と NaPTA のインキュベーション。ただし、分子メカニズムはまだ明らかではありません。このステップはまたを含む、いくつかのケースで観察される rPrP の自発的な変換を防ぐことを助けた。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板としてマウス rPrP (aa 23-231) を使用して、プロトコルに基板交換を含む検出の感度を改善するために、テストされました。
ここでの結果は、この改良法 CWD プリオンの非常に低い集中を検出することができますなり、検出と糞便 NaPTA 降水量と基板交換せずプロトコルと比較して特異性の感度を示します。このメソッドは、可能性のある他の組織や体液に適用することができます、野生と飼育下のシカ科の CWD 監視のための偉大な使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AcrodiscセリンジフィルターPALL</td><td></td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td>ミリ<td>ポア</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C0378</td><td></td></tr>コー<tr><td>ニングボトルトップ真空フィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) ブロス</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine ナトリウム塩 (サルコシル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>オメガメンブレン付きナノセップ遠心装置 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc シーリングテープ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>4693159001</tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>リンタングステン酸ナトリウム水和物 (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>チオフラビン T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Commercial buffers and solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA スーパーフロー</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Standards and commercial kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>strong会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>機器のセットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTAタンパク質精製システム FPLC</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマンアバンティJ-25 遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマンローター JA-25.50</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマンローター JA-10</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar オメガ マイクロプレートリーダー</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Sofware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPadソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の cwd プリオンの検出

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

RT QuIC 法は、機密性の高い体外無細胞プリオン増幅試金シードの折りたたみと変換のためテンプレートとしてプリオン種子を用いた組換えプリオン蛋白質 (PrP) 基板の集計は主に基づいています。RT QuIC はリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に類似しているスループットの高い手法です。アミロイド線維の成長の検出は、Thioflavin T は、ᵦ シート豊富なタンパク質との特異的相互作用時に蛍光を発する色素に基づいています。したがって、アミロイド線維形成をリアルタイムで検出することができます。糞便抽出物の慢性消耗病 (CWD) プリオンを検出するための信頼性の高い非侵襲的なスクリーニング テストの開発を試みた。ここでは、我々 は具体的には PrPSc CWD の糞便内活動を播種感染シカ科を明らかにする RT QuIC 法を適応しています。当初、我々 は準備糞便抽出物の播種活動だった糞便材料の潜在的なアッセイの阻害によって RT-QuIC で比較的低かった。糞便抽出物の播種活動を改善し、潜在的なアッセイの阻害剤を削除は、洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーに糞便を均質化。また、ナトリウム リンタングステン酸と遠心力を使用して蛋白質の沈殿物に基づいて PrPScを集中する方法をサンプルを提出しました。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板交換を検出の感度を改善するためにプロトコルに含まれてによって調べた。したがって、我々 は RT QuIC、CWD の非侵襲的診断のための実用的なツールをすることができますでの前臨床・臨床のシカ科の糞便内活動を播種 CWD プリオンの高感度検出のためのプロトコルを確立しました。

検出の感度は低い27まだ CWD 糞便抽出液 10% (w/v) を用意していた RT QuIC 反応を播くことできます。具体的な取得することを許可鹿 rPrP 結果27のではなく、糞便の均質化の特定のバッファーを使用していたマウス rPrP 基板の使用する併用 RT QuIC 反応の高いバック グラウンド蛍光を避けるために重要なステップ。NaPTA 沈殿物の添加は、増幅反応 (図 2) のシードの活性を阻害することがなく rPrP RT QuIC (図 1) での自発的な転換を削減しました。NaPTA 治療に優れた増幅を認めた CWD 正糞便サンプルの結果の蛍光信号がまだ低い (図 1)。さらに、いくつかのサンプルのプリオンの増幅低蛍光レベル一定高原に達して。RPrP の劣化/変性または rPrP ...

ここでは、単純な高速かつ効率的なプリオンの増幅技術、リアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) メソッドを記述するプロトコルを提案する.

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

このプロトコルのリアルタイム震え誘発変換アッセイの全体的な目標は、子宮頸部の糞便サンプル中の慢性消耗性疾患プリオンを高感度に検出できるようにすることです。この方法は、糞便中の子宮頸部CWDプリオンがいつ感染するかなど、CWD研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特異的で感度が高く、サンプルの高スループットを可能にすることです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるGinny Chengです。この手順を開始するには、10ミリリットルの糞便抽出バッファーを含むチューブに1グラムの糞便材料を追加します。タンパク質のプリセットプログラムを備えた解離器を使用して、糞便ペレットを室温で1分間均質化します。糞便サンプルが完全に均質化されるまで、これを2〜3回繰り返します。次に、パラフィルムを使用してチューブをシールし、ロッキングプラットフォームまたはロータリーシェーカーに置き、室温で1時間のインキュベーションを行います。この後、室温で5分間、18, 000 gで遠心分離します。上清を集めて1.5ミリリットルのチューブに分注します。使用する準備ができるまでマイナス80°Cで保管してください。ナトリウムリンタングステン酸沈殿法を開始するには、1ミリリットルの糞便タンパク質抽出物に250マイクロリットルのサルコシルを追加します。パラフィルムを使用して、チューブを密封します。チューブをサーマルミキサーに入れ、摂氏37度で30分間インキュベートし、1, 400 rpmで絶えず振とうします。この後、10%のリンタングステン酸ナトリウムと170ミリモルの塩化マグネシウムを含むストック溶液を添加し、サンプル中のリンタングステン酸ナトリウムの最終濃度が3%になるようにサンプルをサーマルミキサーに移し、摂氏37度で400rpmで一定の振とうを行いながら2時間インキュベートします。次に、摂氏14度で30分間、15, 800gで遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを洗浄バッファーに再懸濁して洗浄します。次に、摂氏14度で15分間、800gの遠心分離機にかけます。上清を慎重に除去し、ペレットを100マイクロリットルのRT-QuIC希釈バッファーに再懸濁します。処理したサンプルは、RT-QuICアッセイを実行する準備ができるまで、摂氏マイナス20度で保存します。まず、0.032グラムのチオフラビンTを10ミリリットルの二重蒸留水に加えて、新鮮な10ミリモルのチオフラビンTストック溶液を調製します。次に、二重蒸留水を使用して、ストック溶液を1〜10希釈し、最終濃度が1ミリモルのチオフラビンT.0.2マイクロメートルのアクロディスクフィルターを装備したシリンジを使用して、1ミリモルのチオフラビンT溶液をろ過します。次に、最も組換え性の高いプリオンタンパク質基質を解凍します。一度に500マイクロリットルの組換えプリオンタンパク質基質を100 kgのダルトンサイズ排除フィルターマイクロチューブにロードします。室温で5分間、14, 000 gで遠心分離します。この後、溶出した基質を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移します。使用する準備ができるまで摂氏4度で保管してください。次に、保存したRT-QuIC希釈バッファーを解凍します。シードを希釈し、テキストプロトコルに概説されているように、ストック溶液とRT-QuIC反応混合物を調製します。フィルターチップ付きのピペットを使用して、反応混合物をピペッティングで上下に混合します。混合物を50ミリリットルの廃棄ピペッティングリザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、98マイクロリットルのRT-QuIC反応混合物を96ウェル光学ボトムプレートの各ウェルにロードします。各反応に、2マイクロリットルの原液または10倍連続希釈便タンパク質抽出物を加えます。次に、シーリングテープを使用してプレートをシールします。摂氏42度のプレートリーダーで25時間インキュベートし、700 rpmで1分間のダブルオービタル振と、インキュベーション全体で1分間の休止を繰り返します。その間、テキストプロトコルで概説されているように蛍光測定設定を定義します。25時間後、プレートリーダーからプレートを取り外します。プレートを3, 000gで3分間スピンダウンして、ウェル間の潜在的な汚染を回避します。次に、プレートからシールをはがします。新しいプレートを調製するには、新鮮な基質と新鮮なチオフラビンT蛍光色素を含む90マイクロリットルのRT-QuIC反応混合物を加えます。最初のプレートの各ウェルから10マイクロリットルを新しく準備した96ウェルプレートに移します。シーリングテープを使用して、新しいプレートをシールします。蛍光測定設定を定義した後、アッセイをさらに50時間続けます。各ウェルのチオフラビンT蛍光シグナルを15分ごとに読み取り、文書化します。次に、テキストプロトコルで説明されているようにデータを収集してプロットします。この研究では、感染していないヘラジカまたはミュールジカからの糞便物質を糞便抽出バッファーで均質化して、最終サンプル濃度10%を得ます。次に、一部のホモジネートを処理し、リンタングステン酸ナトリウム沈殿によって10倍濃縮します。精製されたサンプルでは自発的な変換の減少が見られますが、CWD陽性の糞便サンプルでは、すべてのサンプルで低い蛍光シグナルが示されました。プリオンの増幅を改善し、検出感度を向上させるために、基板交換ステップが組み込まれています。RT-QuICプロトコルの一部として基質交換を受けたサンプルでは、検出の感度と特異性が向上しており、18のサンプルのうち14が陽性で、陰性コントロールはいずれも偽陽性として登録されていません。一度習得すれば、糞便抽出物の調製とPRP/SCRP濃度は約4時間で完了し、RT-QuICアッセイは適切に実行されれば約1/1-2時間でセットアップできます。手順を試行する際は、基板をろ過することを覚えておくことが重要ですが、決してボルテックスしないでください。この手順に続いて、ウェスタンブロッティングなどの他の方法を使用して、得られるプロテアーゼがどの程度耐性を持つかなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、プリオン研究の分野の科学者が糞便サンプルをテストすることにより、生きた動物中のプリオンの存在を調査する道を開きました。このビデオをご覧いただければ、糞便抽出物からPRP/SCRPを調製および濃縮する方法や、高感度で特異的なプリオン検出を得るための改変RT-QuICアッセイの実施方法について、十分に理解できるはずです。プリオンの取り扱いは非常に危険であり、適切なPPEを着用し、手順を実行する際にはバイオセーフティキャビネットの下で作業することが重要であることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、すぐに精製することにより腹腔内接種に従い、蛍光して注射部位からの彼らの取り込みと動きを監視し、これらのイベントを媒介する細胞を特徴づける感染脳材料から集約されたプリオンロッドを標識する免疫細胞によるプリオンの取り込みと人身売買を監視するための新たなアッセイを説明します。...

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin...

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

スカベンジャーは無病領域に糞中の感染伝達性海綿状脳症プリオンを移動させる可能性を持っている。私たちはマウス適応スクレイピープリオンはアメリカのカラスの消化管（ アメリカガラス ）、死んだ動物の共通の消費者も通過した後、感染のままかどうかを判断するために使用される詳細な方法。...

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

このプロトコルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋生検組織におけるサイトメガロウイルスのqPCR検出について説明しています。これは、迅速で、感度が高く、特異的で、曖昧なヘマトキシリンとエオシン、または免疫組織化学染色パターンの解釈に役立ちます。...

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

プリオン病の種間伝播に対する障壁を測定することは困難であり、通常、動物実験や生化学的アッセイを伴います。ここでは、種障壁を予測する能力を持つin...

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する<em&gt;インビトロ</em&gt;プリオンタンパク質変換アッセイ

Provided は、サーマルサイクラーまたは顕微鏡とステージヒーターを使用して DNA...

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

植物病原体敷地内、特に土壌媒介病原菌の迅速かつ正確な検出は、さらに菌の生産やフィールドで植物の病気の拡散を防ぐために重要です。ここ携帯用リアルタイム PCR...

ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

逆のトランスクリプション (RT qPCR) と組み合わせてリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応分析は、RNA ウイルス感染のレベルを測定するため広く使用されています。デング熱ウイルスを含むいくつかの RNA ウイルスの定量化のために開発、RNA の精製ステップを必要としない直接 RT qPCR...

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

免疫組織化学プロトコルを使用して異常なプリオンタンパク質を免疫標識するには、特定のサンプルおよび抗PrP抗体調製方法が必要です。本プロトコルは、適切なPrP免疫標識を確保し、非特異的バックグラウンド染色を最小限に抑えるためのエピトープデマスキングの重要なステップを説明しています。また、このアプローチは、プリオン感染組織を用いて免疫組織化学研究を行う際のバイオセーフティ対策を考慮する。...

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

実験室で一般的に使用される領域をプリオン汚染と効果的な除染のために評価する方法が不足しています。ここで説明するプロトコルは、特定のラボの個々のニーズに合わせて簡単に変更できるラボプリオン安全性スワイプテストを実装するための重要な基本を提供します。...

プリオン安全研究所 スワイプ試験

学ぶ RT-QuIC法による鹿科動物糞便中のCWDプリオン高感度検出プロトコル。特定・感度が高く、複数サンプルの同時処理が可能なこの手法は、野生動物のプリオン病伝播動態の理解に貢献します。

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

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