リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

このプロトコルのリアルタイム震え誘発変換アッセイの全体的な目標は、子宮頸部の糞便サンプル中の慢性消耗性疾患プリオンを高感度に検出できるようにすることです。この方法は、糞便中の子宮頸部CWDプリオンがいつ感染するかなど、CWD研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特異的で感度が高く、サンプルの高スループットを可能にすることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるGinny Chengです。この手順を開始するには、10ミリリットルの糞便抽出バッファーを含むチューブに1グラムの糞便材料を追加します。タンパク質のプリセットプログラムを備えた解離器を使用して、糞便ペレットを室温で1分間均質化します。

糞便サンプルが完全に均質化されるまで、これを2〜3回繰り返します。次に、パラフィルムを使用してチューブをシールし、ロッキングプラットフォームまたはロータリーシェーカーに置き、室温で1時間のインキュベーションを行います。この後、室温で5分間、18, 000 gで遠心分離します。

上清を集めて1.5ミリリットルのチューブに分注します。使用する準備ができるまでマイナス80°Cで保管してください。ナトリウムリンタングステン酸沈殿法を開始するには、1ミリリットルの糞便タンパク質抽出物に250マイクロリットルのサルコシルを追加します。

パラフィルムを使用して、チューブを密封します。チューブをサーマルミキサーに入れ、摂氏37度で30分間インキュベートし、1, 400 rpmで絶えず振とうします。この後、10%のリンタングステン酸ナトリウムと170ミリモルの塩化マグネシウムを含むストック溶液を添加し、サンプル中のリンタングステン酸ナトリウムの最終濃度が3%になるようにサンプルをサーマルミキサーに移し、摂氏37度で400rpmで一定の振とうを行いながら2時間インキュベー

次に、摂氏14度で30分間、15, 800gで遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを洗浄バッファーに再懸濁して洗浄します。次に、摂氏14度で15分間、800gの遠心分離機にかけます。

上清を慎重に除去し、ペレットを100マイクロリットルのRT-QuIC希釈バッファーに再懸濁します。処理したサンプルは、RT-QuICアッセイを実行する準備ができるまで、摂氏マイナス20度で保存します。まず、0.032グラムのチオフラビンTを10ミリリットルの二重蒸留水に加えて、新鮮な10ミリモルのチオフラビンTストック溶液を調製します。

次に、二重蒸留水を使用して、ストック溶液を1〜10希釈し、最終濃度が1ミリモルのチオフラビンT.0.2マイクロメートルのアクロディスクフィルターを装備したシリンジを使用して、1ミリモルのチオフラビンT溶液をろ過します。次に、最も組換え性の高いプリオンタンパク質基質を解凍します。一度に500マイクロリットルの組換えプリオンタンパク質基質を100 kgのダルトンサイズ排除フィルターマイクロチューブにロードします。

室温で5分間、14, 000 gで遠心分離します。この後、溶出した基質を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移します。使用する準備ができるまで摂氏4度で保管してください。

次に、保存したRT-QuIC希釈バッファーを解凍します。シードを希釈し、テキストプロトコルに概説されているように、ストック溶液とRT-QuIC反応混合物を調製します。フィルターチップ付きのピペットを使用して、反応混合物をピペッティングで上下に混合します。

混合物を50ミリリットルの廃棄ピペッティングリザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、98マイクロリットルのRT-QuIC反応混合物を96ウェル光学ボトムプレートの各ウェルにロードします。各反応に、2マイクロリットルの原液または10倍連続希釈便タンパク質抽出物を加えます。

次に、シーリングテープを使用してプレートをシールします。摂氏42度のプレートリーダーで25時間インキュベートし、700 rpmで1分間のダブルオービタル振と、インキュベーション全体で1分間の休止を繰り返します。その間、テキストプロトコルで概説されているように蛍光測定設定を定義します。

25時間後、プレートリーダーからプレートを取り外します。プレートを3, 000gで3分間スピンダウンして、ウェル間の潜在的な汚染を回避します。次に、プレートからシールをはがします。

新しいプレートを調製するには、新鮮な基質と新鮮なチオフラビンT蛍光色素を含む90マイクロリットルのRT-QuIC反応混合物を加えます。最初のプレートの各ウェルから10マイクロリットルを新しく準備した96ウェルプレートに移します。シーリングテープを使用して、新しいプレートをシールします。

蛍光測定設定を定義した後、アッセイをさらに50時間続けます。各ウェルのチオフラビンT蛍光シグナルを15分ごとに読み取り、文書化します。次に、テキストプロトコルで説明されているようにデータを収集してプロットします。

この研究では、感染していないヘラジカまたはミュールジカからの糞便物質を糞便抽出バッファーで均質化して、最終サンプル濃度10%を得ます。次に、一部のホモジネートを処理し、リンタングステン酸ナトリウム沈殿によって10倍濃縮します。精製されたサンプルでは自発的な変換の減少が見られますが、CWD陽性の糞便サンプルでは、すべてのサンプルで低い蛍光シグナルが示されました。プリオンの増幅を改善し、検出感度を向上させるために、基板交換ステップが組み込まれています。

RT-QuICプロトコルの一部として基質交換を受けたサンプルでは、検出の感度と特異性が向上しており、18のサンプルのうち14が陽性で、陰性コントロールはいずれも偽陽性として登録されていません。一度習得すれば、糞便抽出物の調製とPRP/SCRP濃度は約4時間で完了し、RT-QuICアッセイは適切に実行されれば約1/1-2時間でセットアップできます。手順を試行する際は、基板をろ過することを覚えておくことが重要ですが、決してボルテックスしないでください。

この手順に続いて、ウェスタンブロッティングなどの他の方法を使用して、得られるプロテアーゼがどの程度耐性を持つかなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、プリオン研究の分野の科学者が糞便サンプルをテストすることにより、生きた動物中のプリオンの存在を調査する道を開きました。このビデオをご覧いただければ、糞便抽出物からPRP/SCRPを調製および濃縮する方法や、高感度で特異的なプリオン検出を得るための改変RT-QuICアッセイの実施方法について、十分に理解できるはずです。

プリオンの取り扱いは非常に危険であり、適切なPPEを着用し、手順を実行する際にはバイオセーフティキャビネットの下で作業することが重要であることを忘れないでください。