関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

この方法の全体的な目標は、ウイルスゲノム関連タンパク質のプロテオミクス解析のために、感染細胞から単純ヘルペスウイルス1型DNAを精製することです。この方法は、細胞因子とヘルペスウイルス感染の関与に関する重要な洞察を提供します。この技術の主な利点は、感染した細胞からウイルスDNAの異なる集団を直接精製するように適応できるため、感染の複数の側面を分析できることです。

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、MRC 5細胞の培養から開始します。次に、HSV-1を冷トリス緩衝生理食塩水またはTBSで希釈します。次の手順では、細胞の乾燥を防ぐために、ブロワーと組織培養フードをオフにすることが重要です。

ピペットを使用して、MRC 5細胞から増殖培地を滅菌ボトルに移し、感染後に細胞に戻します。7ミリリットルの希釈ウイルスを細胞に加えて細胞に感染させます。室温で1時間、10分ごとに細胞を揺さぶる。

吸収後、無菌を吸引し、50ミリリットルの室温TBSで細胞をすすぎ、元の増殖培地を交換します。次に、5%二酸化炭素の存在下で細胞を摂氏37度でインキュベートします。ウイルスDNA複製の開始後、感染後約4時間で、ウイルスDNA複製を標識します。

これを行うには、EdCを1ミリリットルの増殖培地で希釈し、感染細胞の細胞培養培地に2〜4時間加えます。核を回収するには、増殖培地を20ミリリットルの核抽出バッファーに交換し、時折揺さぶりながら摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、セルスクレーパーを使用してプレートから核をこすり落とし、氷上の50ミリリットルの円錐管に移します。

2、500 x gおよび4の摂氏温度で10分間遠心分離し、核をペレット化します。遠心分離後、上清を捨てます。核ペレットを10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで静かに取り除き、50ミリリットルの円錐管に移します。

その後、前と同じようにサンプルを遠心分離します。PBSを完全に除去した後、10ミリリットルのピペットで5回静かにピペッティングして、核ペレットを10ミリリットルのクリック反応ミックスに再懸濁します。サンプルを摂氏4度で1時間回転させてから、前と同じように原子核をペレット化します。

クイックリアクションミックスを完全に取り除き、ペレットを10ミリリットルのPBSに穏やかに再懸濁し、再度遠心分離して洗浄します。次に、核ペレットを1ミリリットルのPBSに慎重に再懸濁し、溶液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。遠心分離後、PBSを完全に除去し、ペレットを液体窒素で急速凍結します。

この時点で、ペレットを摂氏80度で保存することも、手順を続行することもできます。核を溶解してDNAを断片化するには、ピペッティングを上下させて、解凍した核を500マイクロリットルのバッファーB1に再懸濁します。懸濁液を氷上で45分間インキュベートします。

次に、3ミリメートルのマイクロチッププローブを使用して、サンプルを40%の振幅でそれぞれ30秒間6回超音波処理します。パルス間で少なくとも30秒間、サンプルを氷の上に置きます。超音波処理後、サンプルは曇りではなく、透明に見えるはずです。

細胞の破片を14, 000 x Gで摂氏4度で10分間遠心分離してペレット化します。ペレットのサイズは大幅に減少し、100ミクロンのセルストレーナーを介して上清をろ過し、流れを保持する必要があります。次に、ろ過した上清に500マイクロリットルのバッファーB2を加えます。

ビオチン化DNAをストレプトアビジン被覆ビーズに結合するには、300マイクロリットルのビーズスラリーを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して、ストレプトアビジン磁気ビーズを調製します。サンプルごとにビーズのチューブを1本準備します。ビーズをミリリットルのバッファーB2でボルテックスして再懸濁し、磁石に塗布してビーズを分離し、洗浄バッファーを吸引して3回洗浄します。

次に、洗浄したビーズに900マイクロリットルのサンプルを追加します。サンプルの残りの部分は、インプットDNAおよびタンパク質の単離に使用されます。サスペンションを摂氏4度で一晩回転させます。

翌日、サンプルを磁気マイクロチューブラックに入れ、上清を取り除きます。ビーズを1ミリリットルのバッファーB2に静かに再懸濁してから、摂氏4度で5分間回転させます。磁気マイクロチューブラックを使用して上清を再度取り除きます。

今回は、ビーズを1ミリリットルのバッファーB3に静かに再懸濁し、摂氏4度で5分間回転させます。磁石を使用してビーズ混合物から上清を取り除いた後、ビーズを50マイクロリットルの2x Laemmliサンプルバッファーに再懸濁して、DNAタンパク質複合体をほのめかします。次に、サンプルを摂氏95度で15分間煮沸します。

ミックスをボルテックスしてから、マイクロフュージでサンプルをすばやく回転させます。サンプルを磁石に塗布し、割り当てを新しいチューブに移します。最後に、サンプルを急速冷凍し、摂氏80度で保存します。

テキストプロトコールに記載されているようにタンパク質解析を行います。EdC標識は、0分、20分、40分、または60分間実施され、その後、ウイルスDNAおよび関連タンパク質の精製が行われました。溶出したタンパク質は、ウイルスDNA結合タンパク質であるICP4およびUL42に特異的な抗体を用いて、クマシーブルー染色およびウェスタンブロッティングを行いました。

矢印は、溶出中にビーズから剥がされたストレプトアビジンを示しており、これはすべての条件下で存在します。この方法で単離されたタンパク質は、次に質量分析の対象となります。円グラフは、感染後6時間でゲノム上の単純ヘルペスウイルスタイプと関連していることが判明した各機能カテゴリーのタンパク質の数を示しています。

同定されたタンパク質間のタンパク質間相互作用を詳しく調べる方法を、string functional protein association network databaseを用いて行いました。その結果、同じ生物学的プロセスで一緒に機能するタンパク質のサブ複合体が明らかになりました。このビデオを見れば、ウイルスゲノム関連タンパク質のプロテオミクス研究のために、感染細胞からウイルスDNAを精製する方法を十分に理解できるはずです。

このテクニックは3〜4日で完了します。この手順を試みる際には、サンプルのDNAseまたはプロテアーゼ汚染を防ぐための予防策を講じることを忘れないでください。この手順に加えて、免疫蛍光法などの他の方法を実行して、EdC標識ウイルスDNAの性質を確認することができます。

この技術は、ヘルペスウイルス学の研究者が宿主タンパク質とウイルス感染の機能を調査する道