灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養
2008年5月21日
我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。
こんにちは、私はエリック・ゴットワルドで、ウェア工科大学の生体界面研究所の研究員です。そして今日は、チップベースの灌流マイクロバイオアクティブシステムをご紹介します。チップを使用する前に 細胞培養アプリケーションでは、ポリマーを加水分解し、微細構造領域をディレートする必要があります。
これは、チップを異なる濃度のイソプロパノールに浸すだけで達成されます。まず、100%から始めて、チップを各濃度に数秒浸し、最後のステップは水だけです。その後、チップを乾燥させ、最後にチップをコラーゲンでコーティングする必要があります。これは、細胞のポリマーへの接着を促進するための1つの解決策です。これは、微細な構造領域の上に1つの溶液であるコラーゲンをわずか数滴滴下することで行われ、この状態でチップは摂氏4度で一晩インキュベートされます。
コラーゲン1溶液と一晩インキュベートした後、溶液を除去し、チップを滅菌PBSで洗浄します その後、PBSも除去され、チップは細胞の接種の準備が整います。次に、細胞に単一細胞の懸濁液を接種しますが、これは、マイクロ構造化領域の上に150マイクロリットルの細胞懸濁液を置くだけで行われます。細胞の沈着後、チップをインキュベーター内で37度で3時間インキュベートします。
3時間のインキュベーション期間の後、チップはインキュベーターから取り出され、エクターに挿入する準備が整います。このために、エクターは無菌包装から取り出され、この透明箔のガンマ線照射によって無菌性が達成されます。したがって、パッケージを開けてエクターを取り外すだけです。
次に行うことは、ボトルの上部をこの培地リザーバーに挿入して、チップを挿入するためのバイオリアクターハウジングを分解できるようにすることです。バイオリアクターハウジングを開けた後、チップをバイオリアクターハウジングの溝に入れるだけでチップを挿入でき、バクターを再度組み立てることができます。最終的にやらなければならないことは、培地リザーバーと1つの滅菌サンプリングポートに滅菌フィルターを接続することです。
閉循環ループ内の実際の酸素張力を測定するために、この2つのコネクタの間に2つの酸素センサーを取り付けるだけで挿入します。これで、バクターに培地を充填する準備が整いました。バクターシステムは、細胞培養培地を充填する準備ができており、これは閉循環ループをローラーポンプに接続するだけで達成されます。
これにより、バクターの循環全体を同時にディレーティングします。このEctorウィンドウでわかるように、下から上がってくるメディウムが上昇し、上昇し、バクターを上に残すのを見ることができます。バクターシステムをインキュベーターに入れる前に、循環ループの気泡フリー充填を制御します。
これで、システムは細胞培養培地で完全に満たされ、バイオリアクターをインキュベーターに移すことができます。次に、バイレクターをインキュベーションチャンバーに入れます。そしてこのために、最初に、あなたがすでに少し前に見たように、バイレクターはローラーポンプに接続されています、そして今、エクターはボトルからこの媒体によって積極的に灌流されています。
また、周囲の酸素濃度を維持するために、培地リザーバーをガス供給に接続します。そして最後に、2つの酸素センサーを循環に接続して、システム内の酸素濃度をオンラインで監視します。これでセットアップが完了し、実験を設計している限り実行できます。
MicroConコンテナ内の細胞の器官型機能を解析する際の最も強力なツールの1つは、レーザー走査型顕微鏡です。レーザー走査型顕微鏡は、MicroConコンテナを1つ1つ破壊することなく調べることができます。また、MicroConコンテナやチップは従来の免疫染色免疫蛍光法に使用できるため、マイクロコンテナ内のあらゆる種類のマーカーや器官型機能を検出することができます。
このチップのアニメーションでわかるように、このチップの底部はセルとMicroConコンテナの壁で完全に満たされています。非常に生きている細胞がたくさんあり、死んだ細胞はほとんどありません。次の図は、MicroConコンテナ内のあらゆる種類の器官型機能を検出できることを示しています。
例えば、肝細胞の場合、アルブミンの産生やEは細胞内の発現を聞くことができ、これはこのオーバーレイでうまく見ることができます。核は青色に染色されました。本明細書のエコは緑色に染色され、アルブミンは赤色で発現または染色される。
そして、ここで見事にわかるように、肝細胞に期待されるすべての器官型機能は、この種の3D培養でうまく表現されています。さらに、別の肝細胞マーカーを調べたところ、これはサイトケラチン18でしたが、この写真は、サイトケラチン18がそのような培養でもうまく発現していることを示しています。そして、これはうまくいけば、この種の器官型機能が他の器官型文化にも役立つかもしれないことをあなたに納得させます。
Biore実験の終了後、チップは、例えばトータルRNAのようなあらゆる種類の細胞成分の単離に使用することができます。ご覧の通り、ここではバイオリアクターシステムから単離した全RNAの摂取量を示します。このトータルRNAは、リアルタイムPCRなどのダウンストリームアプリケーションや、ここで見るようにマイクロアレイ解析に使用できます。
さらに、無傷の細胞をシステムから単離し、それらの細胞を従来のフローサイトメトリー分析に使用することができます。ご覧の通り、このシステムが器官型反応が必要なあらゆる種類のアプリケーションに役立つ可能性があること、また、これまで検討していなかったすべての種類のアプリケーション、例えば幹細胞のアプリケーションに役立つ可能性があることをお見せできれば幸いです。
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概要
この記事では、マイクロバイオリアクターでの細胞の三次元培養用に設計されたチップベースのプラットフォームを紹介します。このシステムは、無菌の閉鎖循環ループ内で最大1000万個の細胞を制御された条件下で培養することを可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞培養
- マイクロバイオリアクター技術
- バイオテクノロジー
背景
- マイクロバイオリアクターは、細胞培養環境を正確に制御することを可能にします。
- 三次元細胞培養は、in vivo 条件をより良く模倣できます。
- ポリマーの加水分解は、チップの準備に不可欠です。
- コラーゲンコーティングは、微細構造領域への細胞接着を向上させます。
研究の目的
- 効率的な細胞培養のためのチップベースのシステムを開発すること。
- 制御された環境下で細胞反応を研究するためのプラットフォームを提供すること。
- コンパクトな形式での高密度細胞培養を促進すること。
使用された方法
- イソプロパノールの様々な濃度を用いたポリマーチップの加水分解。
- チップの乾燥およびコラーゲン溶液によるコーティング。
- 細胞接着を促進するための低温でのコーティングチップのインキュベーション。
- 無菌条件のための閉鎖循環ループの利用。
主な結果
- チップは、最大1000万個の細胞の培養を成功裏にサポートしました。
- 培養プロセス全体を通じて制御された条件が維持されました。
- コラーゲンコーティングにより、細胞接着が大幅に改善されました。
- このシステムは、様々な細胞培養応用のための潜在性を示しました。
結論
- 開発されたチップベースのプラットフォームは、三次元細胞培養に効果的です。
- これは、細胞生物学およびバイオテクノロジーの研究者にとって汎用的なツールを提供します。
- 将来の応用には、薬物テストと組織工学が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Chip-based three-dimensional cell culture in perfused micro-bioreactors enables high-density, organotypic cell growth under controlled, physiologically relevant conditions. This platform addresses the need for predictive in vitro models that bridge the gap between traditional monolayer cultures and in vivo systems, supporting early discovery and translational research. Its modularity and compatibility with advanced analytics position it as a reusable asset for portfolio-wide R&D initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of therapeutic hypotheses in a 3D, organotypic environment.
- Enables functional validation of targets through preservation and measurement of organ-specific markers.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell viability and function over extended periods.
- Provides a platform for evaluating gene expression changes relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Enables reproducible, quantitative readouts via immunofluorescence and molecular assays.
- Supports assay standardization and scalability for high-content analysis.
- Allows for reliable evaluation of compound effects in physiologically relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by preserving organotypic functions such as albumin production and marker expression.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting long-term cell culture and downstream analytics.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions through robust, predictive in vitro data.
- Supports exploratory work in stem cell differentiation and organotypic modeling.
Pipeline & Workflow Integration
This chip-based 3D culture system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research within a single platform.
- Discovery Biology: Provides a controlled environment for testing biological hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures for quantitative compound evaluation.
- Analytics: Supports high-content imaging, molecular profiling, and flow cytometry for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains organotypic functions and biomarker expression for disease-relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable system adaptable across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust in vitro data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on physiologically relevant evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and microfluidic system handling.
- Needs access to laser scanning microscopy and molecular analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chip preparation and analytical protocols.
- Adaptable to various cell types, including primary cells and stem cells, with protocol optimization.
- Limited by the need for specialized bioreactor components and sterile workflow management.
