灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

こんにちは。私はWare工科大学 生体界面研究所のリサーチサイエンティスト、エリック・ゴットワルドです。本日は、当研究所のチップベース灌流式マイクロバイオアクティブシステムについてご紹介します。このチップを細胞培養に応用する前に、ポリマーの加水分解と、微細構造領域の脱気を行う必要があります。

これは、チップを異なる濃度のイソプロパノールに浸すことで行います。まず100%から始め、各濃度の溶液に数秒間ずつチップを浸し、最終ステップとして水に浸します。その後、チップを乾燥させ、最後に細胞のポリマーへの接着を促進させるため、チップをコラーゲンI溶液でコーティングします。これは、微細構造領域の上にコラーゲンI溶液を数滴滴下し、そのまま4°Cで一晩インキュベートすることで行います。

コラーゲン1溶液で一晩インキュベートした後、溶液を除去し、チップを滅菌PBSで洗浄します。その後、PBSを除去し、チップに細胞を接種する準備を整えます。次に、単一細胞の懸濁液を細胞チップに接種します。これは、微細構造領域の上に細胞懸濁液を150 µL滴下することで行います。細胞を播種した後、チップをインキュベーター内で37 °Cで3時間インキュベートします。

3時間のインキュベーション期間後、チップをインキュベーターから取り出し、エクターへ挿入する準備をします。まず、エクターを滅菌パッケージから取り出します。この透明フィルムはガンマ線照射によって滅菌されています。したがって、パッケージを開封してエクターを取り出すだけで準備が完了します。

次に、チップを挿入するためにバイオリアクターハウジングを分解できるよう、ボトルの上部をこの培地リザーバーに挿入します。バイオリアクターハウジングを開いた後、チップをハウジングの溝に配置することで挿入し、その後バイオリアクターを再び組み立てます。最後に、2つの滅菌フィルターと1つの滅菌サンプリングポートを培地リザーバーに接続します。

閉鎖循環ループ内の実際の酸素分圧を測定するため、これら2つのコネクタの間に2つの酸素センサーを取り付けます。これでbactorに培地を充填する準備が整いました。bactorシステムに細胞培養培地を充填する準備ができたので、閉鎖循環ループをローラーポンプに接続して充填を行います。

これにより、バイオリアクターの循環系全体を同時に脱気します。こちらのEctorウィンドウに見られるように、培地が下から上昇し、上部でバイオリアクターから排出されていくのがわかります。バイオリアクターシステムをインキュベーターに入れる前に、循環ループ内に気泡がない状態で充填されているかを確認します。

システム全体に細胞培養液が満たされたので、バイオリアクターをインキュベーターへ移動させることができます。それでは、バイオリアクターをインキュベーションチャンバー内に設置します。そのために、先ほど確認した通り、まずバイオリアクターをローラーポンプに接続し、ボトルからこの培地を能動的に灌流させます。

また、周囲の酸素濃度を維持するため、培地リザーバーをガス供給源に接続します。最後に、システム内の酸素分圧をオンラインで監視するために、2つの酸素センサーを循環系に接続します。これでセットアップが完了し、設計した実験期間に合わせて動作させることができます。

MicroConコンテナ内部の細胞における器官特異的な機能を解析する際、最も強力なツールの1つが、ここに示されている共焦点レーザー走査顕微鏡です。レーザー走査顕微鏡を用いることで、個々のMicroConコンテナを破壊することなく観察することが可能です。また、MicroConコンテナまたはチップは、従来の免疫染色や免疫蛍光法に使用できるため、マイクロコンテナ内部であらゆる種類のマーカーや器官特異的な機能を検出することができます。

こちらのチップのアニメーションでご確認いただける通り、底部およびMicroConコンテナの壁面は細胞で完全に満たされています。多くの生存細胞が確認でき、死細胞は極めてわずかです。次の写真では、MicroConコンテナ内であらゆる種類の器官型機能が検出できることが示されています。

例えば、肝細胞において、アルブミンの産生やE-カドヘリンの細胞内発現が確認でき、それはこちらのオーバーレイ画像で明確に見て取れます。核は青色で染色されています。E-カドヘリンは緑色で染色され、アルブミンは赤色で発現または染色されています。

ここで明確に見て取れるように、肝細胞に期待されるすべての臓器特異的機能が、この種の3D培養において良好に発現しています。さらに、別の肝細胞マーカーとしてサイトケラチン18を確認したところ、この画像が示す通り、これらの培養においてもサイトケラチン18が良好に発現していることがわかります。これにより、この種の臓器特異的機能が、他の臓器特異的培養においても有用である可能性が高いことがお分かりいただけるかと思います。

Biore実験の終了後、このチップを用いて全RNAなどのあらゆる種類の細胞成分を単離することが可能です。こちらで示しているのは、バイオリアクターシステムから単離された全RNAです。この全RNAは、リアルタイムPCRや、こちらで示しているマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

さらに、システムから生存細胞を単離し、それらの細胞を従来のフローサイトメトリー解析に使用することができます。こちらでご覧いただいたように、本システムが器官型反応を必要とするあらゆるアプリケーションに有用であること、また、幹細胞への応用など、これまで検討してこなかったあらゆる種類のアプリケーションに有用である可能性があることを示せたと考えております。