Name: 灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 学ぶ 灌流マイクロバイオリアクターによるチップベースの三次元細胞培養法。最大1000万個の細胞を閉鎖循環系で無菌培養し、コラーゲンコーティングで接着性を向上させます。創薬や組織工学への応用が期待されます。

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我々は優秀な技術支援のためにMechthildハーシュバックとアンケDechに感謝します。

本論文では、細胞株と同様に初代培養細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォーム（図1）の使用方法について説明します。多くの細胞が唯一の3D -環境の明示器官の機能を行うので、我々は細胞がすべての空間方向に付着することができるの足場を提供するポリマーチップを開発し、流体の流れを制御するためのバイオリアクターのハウジングにマウントできることを、実験のデザインに応じて酸素張力などは、ポリマーの表面は様々な技術、例えば、UV照射、PECVD、γ-移植するか、従来の湿式化学によって変更することができます。 <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="564_Figure - 01.png" width="546" height="386" /> 図01 1。脱気し、チップのhydrophilisation ご使用の前に、チップは脱気して親水化する必要があります。このため、アルコールのシリーズが行われる。 DMPC処理水で100％イソプロパノール、70％、50％、30％から成るイソプロパノール溶液を調製していると、チップが100％の解決で始まる、各濃度で浸漬され、30代までのため。シリーズの最後のステップは、純粋なジメチルピロカーボネート（DMPC）、処理水で構成されています。この時点から、それはチップがぬれておくことが重要です。 2。コラーゲンIコーティングアルコール系の後、チップは通常、ラットの尾からのコラーゲンI溶液でコーティングされています。 0.2パーセント酢酸2 mg / mlのコラーゲン原液から30μgのコラーゲンタンパク質に対応するアリコートを150μlの最終容量をDMPC処理水で希釈する。 10μgのコラーゲンIあたりcm 2の表面積の密度とチップ表面のコラーゲンコーティングのこの結果。 3。肝細胞癌の細胞の接種ラインヘップG2の肝細胞癌の細胞をトリプシン処理してカウントされます。短期実験（1〜6日）に5 * 10 6細胞を各チップとそれに対応する制御さ6cm組織培養ペトリ皿に接種されています。 inoculteに、チップ5 * 10 6細胞を150μlの培養培地に再懸濁し、チップの微小領域（図2）の上に配置されます。その後、それは2〜3時間のためのインキュベーター内に配置されます。この潜伏期間中の細胞の堆積物のマイクロコンテナへとコラーゲンIでコーティングされた足場に付着する。 <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="564_Figure - 02.png" width="300" height="225" /> 図2 4。バイオリアクターの住宅へのチップの挿入潜伏期間の後、チップは、インキュベータから削除され、バイオリアクターのハウジングにマウント。このため、クリーンベンチの下に、組み立て済みのバイオリアクターに無菌包装から削除され、チップの挿入を可能にする程度に解体。チップは、慎重に滅菌ピンセットで処理し、バイオリアクターの上部と下部コンパートメントの世代につながるシールチップをとガスケットが含まれている溝に配置されます。その後、バイオリアクターは、再び組み立てられ、それがポンプに接続されているインキュベーター、ガスの供給と酸素アナライザに転送されます。 5。システムの充填とすぐにバイオリアクターは培地リザーバに接続されているように、ポンプとガス供給閉鎖循環ループは、培地が充填されている。これは、チップの上に培地のフローとして定義されている灌流が達成されるように3方のコネクタを配置することによって行われます。これは、足場から細胞を除去することなく、バイオリアクターの循環から囲まれて空気の排出につながる。システムが完全に媒体が充填された後、3方のコネクタは、組織を介してチップの下から流れとして定義されている灌流が達成されるように切り替えられます。灌流の構成では流れが肝細胞には通常60〜500μL/ minからの範囲のセルのニーズに調整されます。 6。サンプリング実験中に培地のサンプルを描くことができる。このため、注射器は、培地タンクの上に滅菌したポートに接続されています。サンプリングした後、ポートを70％イソプロパノールで滅菌されています。 7。ダウンストリームアプリケーションのためのチップから無傷の細胞の分離実験の終了時に、バイオリアクターは、クリーンベンチに転送され、前述のように逆アセンブル、ガスの供給とローラーポンプから切断されています。滅菌ピンセットでチップは、バイオリアクターの筐体から削除さに配置され3.5センチメートルペトリ皿に、PBSですすいだ。その後、チップは、微細領域から細胞を分離するためにインキュベーターで5〜15分間トリプシン/ EDTA（0.25％/ 0.53mM）でインキュベートする。採取した細胞懸濁液を600 gで5分間遠心分離され次に、細胞を従来の下流の用途、例えば、全RNAまたはタンパク質の分離に使用することができます。日常的に、我々はマイクロアレイ解析やリアルタイムRT - PCRのためのトータルRNA（PARISキット、アンビオン社、オースティン、テキサス州、米国）を分離する。タンパク質発現は、レーザ走査型顕微鏡でチップ内のセルの免疫組織化学的染色後に分析されていますが、フローサイトメトリーにより、例えば、そうでなければ分析することができます。

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項を何も持っていません。

我々は積極的に灌流マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームを開発しました。チップは、マイクロ射出成形、ホットエンボス加工と同様のマイクロ熱成形技術3による生分解性ポリマーの非生分解性からだけでなく、製造することができる。実験のデザインに応じて、ポリマーの表面は、UV -照射4で修正することができます。式のいくつかの肝臓特異的遺伝子の解析だけでなく、いくつかの肝臓特異的タンパク質の分析5,6で示される可能性があるため肝細胞株と同様に初代ラット肝細胞が正常にこれらのデバイスで栽培することができる。

<table><tbody><tr><td>細胞</td><td>その他</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>ラットテール由来コラーゲンI</td><td>試薬</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>PARISキット</td><td>試薬</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>anti cytokeratin 18</td><td>抗体</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>一次抗体、マウスモノクローナル抗体、PBSで1/100に希釈して使用</td></tr><tr><td>Anti E-cadherin</td><td>抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>一次抗体、マウスモノクローナル抗体、PBSで1/50に希釈して使用</td></tr><tr><td>Goat anti-albumin</td><td>試薬</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>一次抗体、ヤギ抗ヒトAlbumin抗体、PBSで1/200に希釈して使用</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse IgG1</td><td>抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>二次抗体、Alexa Flour 488結合、PBS + 0.5 % BSAで1/100に希釈して使用</td></tr><tr><td>Cy3 anti-goat IgG</td><td>試薬</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG 抗体、PBS + 0.5% BSAで1/700に希釈して使用</td></tr></tbody></table>

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

我々は、細胞の三次元培養のためのチップベースの細胞培養システムを開発した。チップは通常、マイクロ射出成形、マイクロホットエンボス加工または熱成形マイクロによって、非生分解性ポリマー、例えば、ポリカーボネートやポリメチルメタクリレートから製造されています。しかし、それはまた、生分解性ポリマーから製造することができる。その全体的な寸法は0.7 × 1 20 × 20 ​​× 0.7 1ミリメートル（hxwxl）です。使用するチップの主な特徴は、どちら1156立方マイクロコンテナ（CF -チップ）までのグリッドであり、それぞれ120から300までの大きさ× 300 × 300μ（hxwxl）または300μの直径を有する円形凹部と深さの300μ（R -チップ）。足場は、10美緒を収容することができる。三次元構成で細胞。最適な栄養とガス供給の場合、チップは、バイオリアクターのハウジングに挿入されます。バイオリアクターは、最も単純な構成で、additionalyローラーポンプとガスの供給を持つ媒体タンクから構成され、閉じた滅菌の循環ループの一部です。バイオリアクター、灌流、灌流、あるいは混合操作モードで実行することができます。私たちは正常細胞株と同様に数週間の期間にわたって主要な細胞を栽培している。ラット初代肝細胞のために我々は2週間以上器官の機能の保全を示すことができた。肝細胞癌細胞株のために我々はされていないか、ほんの少しだけ標準的な単層培養で発現する肝臓特異的遺伝子の誘導を示すことができた。幹細胞株との最初の分化実験では有望されて以来、システムはまた、幹細胞の培養系として有用かもしれません。

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。

細胞の三次元培養を目的とした、チップベースの細胞培養システムを開発しました。このチップは通常、…から製造されます。

こんにちは。私はWare工科大学 生体界面研究所のリサーチサイエンティスト、エリック・ゴットワルドです。本日は、当研究所のチップベース灌流式マイクロバイオアクティブシステムについてご紹介します。このチップを細胞培養に応用する前に、ポリマーの加水分解と、微細構造領域の脱気を行う必要があります。これは、チップを異なる濃度のイソプロパノールに浸すことで行います。まず100%から始め、各濃度の溶液に数秒間ずつチップを浸し、最終ステップとして水に浸します。その後、チップを乾燥させ、最後に細胞のポリマーへの接着を促進させるため、チップをコラーゲンI溶液でコーティングします。これは、微細構造領域の上にコラーゲンI溶液を数滴滴下し、そのまま4°Cで一晩インキュベートすることで行います。コラーゲン1溶液で一晩インキュベートした後、溶液を除去し、チップを滅菌PBSで洗浄します。その後、PBSを除去し、チップに細胞を接種する準備を整えます。次に、単一細胞の懸濁液を細胞チップに接種します。これは、微細構造領域の上に細胞懸濁液を150 µL滴下することで行います。細胞を播種した後、チップをインキュベーター内で37 °Cで3時間インキュベートします。3時間のインキュベーション期間後、チップをインキュベーターから取り出し、エクターへ挿入する準備をします。まず、エクターを滅菌パッケージから取り出します。この透明フィルムはガンマ線照射によって滅菌されています。したがって、パッケージを開封してエクターを取り出すだけで準備が完了します。次に、チップを挿入するためにバイオリアクターハウジングを分解できるよう、ボトルの上部をこの培地リザーバーに挿入します。バイオリアクターハウジングを開いた後、チップをハウジングの溝に配置することで挿入し、その後バイオリアクターを再び組み立てます。最後に、2つの滅菌フィルターと1つの滅菌サンプリングポートを培地リザーバーに接続します。閉鎖循環ループ内の実際の酸素分圧を測定するため、これら2つのコネクタの間に2つの酸素センサーを取り付けます。これでbactorに培地を充填する準備が整いました。bactorシステムに細胞培養培地を充填する準備ができたので、閉鎖循環ループをローラーポンプに接続して充填を行います。これにより、バイオリアクターの循環系全体を同時に脱気します。こちらのEctorウィンドウに見られるように、培地が下から上昇し、上部でバイオリアクターから排出されていくのがわかります。バイオリアクターシステムをインキュベーターに入れる前に、循環ループ内に気泡がない状態で充填されているかを確認します。システム全体に細胞培養液が満たされたので、バイオリアクターをインキュベーターへ移動させることができます。それでは、バイオリアクターをインキュベーションチャンバー内に設置します。そのために、先ほど確認した通り、まずバイオリアクターをローラーポンプに接続し、ボトルからこの培地を能動的に灌流させます。また、周囲の酸素濃度を維持するため、培地リザーバーをガス供給源に接続します。最後に、システム内の酸素分圧をオンラインで監視するために、2つの酸素センサーを循環系に接続します。これでセットアップが完了し、設計した実験期間に合わせて動作させることができます。MicroConコンテナ内部の細胞における器官特異的な機能を解析する際、最も強力なツールの1つが、ここに示されている共焦点レーザー走査顕微鏡です。レーザー走査顕微鏡を用いることで、個々のMicroConコンテナを破壊することなく観察することが可能です。また、MicroConコンテナまたはチップは、従来の免疫染色や免疫蛍光法に使用できるため、マイクロコンテナ内部であらゆる種類のマーカーや器官特異的な機能を検出することができます。こちらのチップのアニメーションでご確認いただける通り、底部およびMicroConコンテナの壁面は細胞で完全に満たされています。多くの生存細胞が確認でき、死細胞は極めてわずかです。次の写真では、MicroConコンテナ内であらゆる種類の器官型機能が検出できることが示されています。例えば、肝細胞において、アルブミンの産生やE-カドヘリンの細胞内発現が確認でき、それはこちらのオーバーレイ画像で明確に見て取れます。核は青色で染色されています。E-カドヘリンは緑色で染色され、アルブミンは赤色で発現または染色されています。ここで明確に見て取れるように、肝細胞に期待されるすべての臓器特異的機能が、この種の3D培養において良好に発現しています。さらに、別の肝細胞マーカーとしてサイトケラチン18を確認したところ、この画像が示す通り、これらの培養においてもサイトケラチン18が良好に発現していることがわかります。これにより、この種の臓器特異的機能が、他の臓器特異的培養においても有用である可能性が高いことがお分かりいただけるかと思います。Biore実験の終了後、このチップを用いて全RNAなどのあらゆる種類の細胞成分を単離することが可能です。こちらで示しているのは、バイオリアクターシステムから単離された全RNAです。この全RNAは、リアルタイムPCRや、こちらで示しているマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。さらに、システムから生存細胞を単離し、それらの細胞を従来のフローサイトメトリー解析に使用することができます。こちらでご覧いただいたように、本システムが器官型反応を必要とするあらゆるアプリケーションに有用であること、また、幹細胞への応用など、これまで検討してこなかったあらゆる種類のアプリケーションに有用である可能性があることを示せたと考えております。

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