蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

この手順の全体的な目標は、タンパク質中のQa-1エピトープを同定することです。この方法は、免疫調節と免疫療法の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マッピングされたペプチドがQa-1制限CD8 T細胞を刺激することが知られており、この手順が容易に実行できることです。

この技術の意味は、多発性硬化症などの免疫介在性疾患の治療設計にまで及びます。この方法は、動物のQa-1を介した免疫制御に関する洞察を得ることができますが、ヒトのHLA-Eを介した免疫制御にも適用できます。手順を開始するには、隣接するペプチドが11個のアミノ酸でオーバーラップする15-merペプチドのライブラリを設計します。

無菌条件下でペプチドを入手し、再構成します。各ペプチドについて、5ミリグラムのペプチドと100マイクロリットルのジメチルスルホキシドを組み合わせます。各ペプチドストック10μLを清潔な1ミリリットルのクライオチューブに混ぜ合わせて、OLPプールストックを調製します。

次に、各ペプチドストックの20マイクロリットルをV底の96ウェルプレートにロードし、各ストックを80マイクロリットルの滅菌水で希釈します。残りの50ミリグラム/ミリリットルのペプチドストックと10ミリグラム/ミリリットルのペプチドストックのプレートの両方を摂氏20度で保存します。次に、無血清培地中の2ミリリットルの照射樹状細胞を含む15ミリリットルのチューブに10マイクロリットルのOLPプールストック溶液を加え、DMSOを200倍に希釈します。

残りのOLPプールストックは摂氏20度で保管します。DCをOLPプールと室温で3時間インキュベートします。15分ごとに手で細胞を静かに振ってください。

インキュベーション中に、キットを使用して、採取したマウス脾臓またはリンパ節からCD8+T細胞を精製します。無血清培地1ミリリットルあたり1000万個のT細胞を含む溶液を5ミリリットル調製し、インターロイキン2は1ミリリットルあたり50単位、インターロイキン7は1ミリリットルあたり100単位を調製します。精製されたCD8 T細胞にはビーズが付着していないか、手つかずのままでなければなりません。

0.5ミリリットルのT細胞溶液を48ウェルプレートの10ウェルのそれぞれに入れます。OLPプールパルスDC溶液のインキュベーションが完了したら、DCに10ミリリットルの無血清培地を加え、細胞をGの300倍で室温で10分間遠心分離します。

次に、5ミリリットルの無血清培地で細胞を再構成します。0.5ミリリットルの細胞懸濁液を10個のウェルのそれぞれに加えます。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気中で4日間インキュベートします。

次に、各ウェルから400マイクロリットルの培地を取り出します。IL-2およびIL-7をそれぞれ1ミリリットルあたり100単位を含む500マイクロリットルの新鮮な無血清培地を各ウェルに加える。OLPプールプライミング細胞を再刺激する前に、細胞をさらに2〜3日間インキュベー

再刺激に先立ち、マウス腹膜マクロファージを採取し、照射する。マクロファージ濃度を無血清培地1ミリリットルあたり500万細胞に調整します。10マイクロリットルのOLPプールストックと2ミリリットルの照射された腹膜マクロファージを組み合わせて、最終DMSO濃度を0.5体積%にします。

この溶液に、マウスマクロファージコロニー刺激因子のミリリットルあたり100単位を添加します。.48ウェルプレートに200マイクロリットルのOLPプールマクロファージ溶液を各ウェルに充填します。プレートを摂氏37度で4時間インキュベートします。

次に、200マイクロリットルの予熱済みRPMI-0培地で各ウェルをやさしく洗います。マクロファージ溶液には、多くのビーズが含まれます。OLPプールプライミングCD8 T細胞を添加する前に、プレートを顕微鏡でチェックし、すべてのウェルにビーズがないことを確認する必要があります。

次に、再刺激の準備ができているOLPプールプライミングされたCD8+T細胞を回収してプールします。IL-2 を 1 ミリリットルあたり 25 単位、IL-7 を 1 ミリリットルあたり 50 単位含む無血清培地で、T 細胞濃度を 1 ミリリットルあたり 100 万細胞に調整します。プールしたT細胞溶液を1ミリリットル、OLPプールパルスマクロファージを含む各ウェルに加えます。

細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気で4日間培養します。次に、各ウェルから約400マイクロリットルの培地を取り出します。IL-2およびIL-7をそれぞれ1ミリリットルあたり100単位を含む新鮮な無血清培地を各ウェルに500マイクロリットル加えます。

同じ条件下でインキュベーションを再開します。3〜4日後、インターフェロン-γ酵素結合免疫スポットアッセイを用いて、再刺激された細胞のOLPプール特異的Qa-1制限応答を調べます。結果を待つ間、CD8 + T細胞培地を3〜4日ごとに更新します。

希薄なペプチドストックを用いてELISPOTアッセイを行い、どのペプチドがOLPプール特異的なQa-1制限インターフェロン-ガンマ分泌を産生するかを決定します。最後に、ELISPOTで切断されたペプチドシリーズを評価し、最適なQa-1エピトープを特定します。インターフェロン-γ ELISPOT アッセイでは、プールされた MOG オーバーラップペプチドライブラリーによって刺激された CD8+T 細胞を C1R と組み合わせると、スポット形成細胞が有意に増加することが示されました。

Qa-1b細胞。このことは、T細胞がQa-1結合ペプチドに応答し、MOG_poolが1つ以上のQa-1結合エピトープを含んでいることを示しました。プール内の個々のペプチドをスクリーニングするために、別のアッセイを実施しました。

3つのペプチドは、C1Rの存在下での応答よりも少なくとも3倍大きい応答を示しました。ペプチドを含まないQa-1b細胞。これらのうち、最も反応が強いペプチドを、さらなる評価のために選択しました。

目的の15-merペプチドに基づく切断ペプチドのライブラリーを評価して、最適なQa-1エピトープを特定しました。エピトープは理想的には8〜10merで、9merが好ましいです。さらに、最適なエピトープは、15量体ペプチドと同等またはより強いインターフェロン-ガンマ応答を示すであろう。

9量体のN末端切頭ペプチドはこれらの基準に最も適しており、最適なQa-1エピトープとなります。その開発後、この技術は、免疫制御の分野の研究者が、膵臓などの他の組織の免疫制御の研究のための新しいQa-1エピトープを発見する道を開きました。放射線を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。

研究者は、機関の方針を厳格に遵守し、適切な訓練を受けるべきです。