Name: 蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ重複ペプチドライブラリ法によるQa-1エピトープ同定技術。15-merペプチドを用いてCD8陽性T細胞を刺激し、自己免疫疾患の治療戦略開発への応用可能性を示す免疫調節研究の手法です。

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彼女の技術支援とこの原稿の準備、ペネロペ ガルシアに感謝しますこの作品は、(681205-2967) ロマリンダ大学医学部から研究イノベーション助成金 (リグ) と XT に国民の多数硬化の社会 (PP1685) からパイロットの助成金によって支持されました。

<ol><li>Aldrich, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Tap-dependent+leader+peptide+recognized+by+alloreactive+T+cells+specific+for+a+class+Ib+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen.</a> Cell. 79 (4), 649-658 (1994).</li>
<li>Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD94%2FNKG2A+is+a+natural+killer+cell+receptor+for+the+nonclassical+major+histocompatibility+complex+%28MHC%29+class+I+molecule+Qa-1%28b%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b).</a> J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).</li>
<li>Oliveira, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20038604">The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects.</a> J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).</li>
<li>Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+MHC+class+Ib-restricted+cytotoxic+T+cells+monitor+antigen+processing+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum.</a> Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regulatory+CD8+T+cells+in+Qa-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice.</a> Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immunity+by+a+novel+population+of+Qa-1-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells.</a> J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).</li>
<li>Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+arthritis+through+mobilization+of+peptide-specific+CD8%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells.</a> J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).</li>
<li>Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+of+T+cell+regulation+that+enables+self-nonself+discrimination+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).</li>
<li>Panoutsakopoulou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+autoimmune+disease+after+vaccination+with+autoreactive+T+cells+that+express+Qa-1+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes.</a> J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).</li>
<li>Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TCR+antibody+treatment+activates+a+novel+population+of+nonintestinal+CD8+alpha+alpha%2B+TCR+alpha+beta%2B+regulatory+T+cells+and+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).</li>
<li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+CD8%2B+Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064(2016).</li>
<li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60%3A+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8%2B+T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210(2013).</li>
<li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).</li>
<li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li>
<li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li>
<li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells+with+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li>
<li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein%2C+PfAARP%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457(2016).</li>
<li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li>
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著者は利益相反を宣言しません。

ここでは、蛋白質の Qa 1 エピトープの分析のためのプロトコルを説明しました。このプロトコルに関連していくつかの他の方法は既に報告もしました。まず、同種の CD8+ T 細胞とクローンは Qdm1の識別のために使用されました。第二に、Qdm の解析から推定される Qa-1 結合モチーフは HSP60p216 224 と TCRBV8.1 エピトープ9,18の同定に使用されました。第三に、個別の重複するペプチド蛋白質からは、動物を免疫に使用されました。その後、CD8+ T 細胞免疫動物から分離された、TCRBV8.2 ペプチド p42-50 Qa 16,10,19へのバインドの確認された後を識別するために使用されました。第四に、機能的な CD8<...

Qa 1 はマウス (MHC Ib) 分子非古典的な主要な組織適合性の複雑な 1 b のグループに属しています。その人間の相同物 HLA-E のです。証拠はこれまでは、Qa 1 分子が生体の重要な機能であることを示しています。まず、Qa 1 分子構造と機能の整合性のための細胞の調査で重要な役割を果たします。この点、Qa 1 分子は、細胞の正常な機能を監視するいくつかの戦略を進化してきました。このような戦略の 1 つは、Qa 1 分子加工のリーダー ペプチド (エピトープ)、すなわちQa 1 決定修飾子 (Qdm) 小胞体1古典的 MHC Ia 分子から処理されると錯形成できます。これら後の Qa-1/Qdm の複合体は細胞の表面に表示され、アクティビティ2を殺す NK を抑制する NK 細胞の抑制性 NKG2A 受容体にバインドします。Ia MHC 分子の発現が失われた場合 (例えば悪性細胞) は2を殺す NK に敏感になります。その他の方法により、タップ (抗原処理に関連付けられているトランスポーター) に欠けている細胞の表面の新しい Qa 1/抗原複合体を形成する Qa 1 分子3および/または ERAAP (小胞体アミノペプチダーゼに関連付けられています。抗原処理)4 (両方の欠陥はしばしば悪性細胞に発生します)。これらの新しい Qa 1/抗原複合体を表現する細胞認識およびエピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限によって除去できる+ T 細胞。第二に、Qa 1 分子免疫制御5を誘発します。この点、Qa 1/抗原複合体は、CD8 を刺激するために示されている+自己組織6,7,8 の免疫介在性損傷の防止にとって重要な細胞 (Treg) T、9,10。第三に、Qa 1 制限 CD8+ Treg 細胞はウイルス感染11に対する免疫応答を制限する示されています。
したがって、エピトープ特異 Qa 1 点 CD8 の特定豊胸+ T 細胞は異常細胞の排除、免疫制御の強化との大きさの制御可能性のある有望な戦略ウイルスによる免疫応答。一方、それかどうか決定されていない豊胸エピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限の+ T 細胞は免疫監視を強化でき、ウイルスによる免疫応答を制限、研究所施設、その他ことが明らかQa 1 エピトープと予防接種は CD8 の Qa 1 制限の機能を増やすことが+ Treg 細胞病原性自己免疫性 cd4 陽性の特定+ T 細胞、CD4 の効率的な管理に至る+で T 細胞による自己免疫疾患、さまざまな動物モデルの実験的アレルギー性脳脊髄炎 (人間多発性硬化症の動物モデル)6,10、コラーゲン誘導関節炎 (ひと関節リウマチの動物モデル)7などと非肥満の糖尿病 (ヒト 1 型糖尿病の動物モデル)8。さらに、我々 は免疫組織固有の Qa 1 エピトープが CD8 の増強によってその組織の免疫炎症の特定のコントロールにつながることを発見した+ Treg 細胞12。前臨床試験の上記の成功が Qa 1 エピトープ免疫組織特異免疫介在性疾患の治療のため、潜在的タップの欠陥に関連付けられている他の疾患の治療のための完全な評価の必要性を示すとERAAP。
したがって、蛋白質の Qa 1 エピトープを確実かつ迅速に分析できる技術の需要があります。この点では、生物学的に重要な Qa 1 エピトープの限られた数が記載されています。これら Qa 1 エピトープのほとんどは CD8 の研究中に偶然に識別された+ T 細胞の反応惹起6、原因になるセル セル ERAAP4、欠損、タップ3欠損細胞細菌13 9。したがって、高スループット方法が定義されたタンパク質の生物学的に重要な Qa 1 エピトープの同定のため望ましいです。以下では、マップを使用して Qa 1 resrticted CD8 蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープ重複のペプチド (OLP) ライブラリ戦略について述べる+ T 細胞ライン OLP プール (OLP_pool) 蛋白質のために特定します。

<table><tbody><tr><td>分析するタンパク質</td><td>N/</td><td>A N/</td><td>A タンパク質の配列はNCBI</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td>から取得できます <td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#:D2650 SIGMA</td><td>DMSOは無菌で細胞培養試験を行う必要があります。</td></tr><tr><td>Kb-/-Db-/-マウス</td><td>The Lackson Laboratory</td><td>Stock#: 019995</td><td>Taconic H2-KbH2-Db doube ノックアウトマウスを使用しましたが、現在は入手できません。</td></tr><tr><td>AIM V 無血清中</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 12055091</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td>#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8 ポジティブアイソレーションキット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#: 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>Trasfer ピペット</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg#: 137238</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 315-02</td><td></td></tr><tr><td>48-well tissue culture plates</td><td>USA Scientific</td><td>Cat#: CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1ml deep 06-well PP plate, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>Item#: 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L:217-17</td><td></td></tr><tr><td>捕捉抗IFN-&γ;抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>カタログ#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>ELISPOTプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ#: S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td>ATCC</td><td>カタログ#: ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R.Qa-1b</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド (GenBank access#: NM_010398.3)</td></tr><tr><td>Qa-1 lentiviral vector</td><td>GeneCopoeia</td><td>Product#: Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>Detection anti-IFN-&gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: P9416</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: BD557630</td><td></td></tr><tr><td>AEC基質</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551951</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoSpot Analyzer</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>この目的のためには、どの免疫スポット分析器も機能するはずです。</td></tr></tbody></table>

蛋白質の qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (人間の HLA E) は、(MHC Ib) 分子をクラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b グループに属する。最近のデータでは、Qa 1 分子が細胞の構造と機能の整合性を調査、免疫調節の誘導、ウイルス感染に対する免疫応答を制限することにおいて重要な役割を果たすことを示唆しています。また、CD8 の Qa 1 制限の機能増強+ T 細胞エピトープを通じて予防接種がいくつかの自己免疫疾患動物モデル、例えば実験的アレルギー性脳脊髄炎、治療効果を示しています。コラーゲン誘発関節炎と非肥満の糖尿病。したがって、蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープを効率的かつ迅速に識別できる方法のための緊急の必要性があります。ここでは、CD8 の Qa 1 制限を利用するプロトコルについて述べる+ T 細胞の蛋白質の Qa 1 エピトープを決定するための重複のペプチド (OLP) ライブラリの特定行。この OLP ライブラリを含む 15 mer 重複するペプチド、蛋白質の全体の長さをカバーする、11 のアミノ酸によって隣接するペプチドを重ねます。このプロトコルを使用して、我々 は最近ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 9 mer Qa 1 エピトープを識別しました。この新しくマップされたモグ Qa 1 エピトープはエピトープ固有の Qa 1 制限 CD8 を誘導するために示された+ T 細胞その強化されたミエリン特異免疫調節。したがって、このプロトコルは、将来における新たな標的と CD8 の Qa 1 制限の機能に便利+ T 細胞。

蛋白質の全体の長さをカバー OLP ライブラリのデザイン
15 アミノ酸 (15 mer) タンパク質の N 末端から始まる、各ペプチドです。したがって、最初のペプチド 15 の位置に 1 の位置に します。2 番目のペプチドの N 末端は 11 アミノ酸によって最初のペプチドの C 末端と重複します。したがって、2 番目のペプチドにまたがる位置 5 ~ 19。(図 1) タンパク質の C 末端の端に、ペプチドの残りの部分をデザインします。私たちと他の人は 15 mer ペプチド, マクロファージ, 樹状細胞 (Dc) に追加されたときが効率的にすることができます示されているので、我々 は 15 mer ライブラリを選んだ CD8 による認識エピトープへの処理+ T 細胞14,<sup class="xref...

Qa-1 (人間の HLA E) は、クラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b 分子のグループに属しています。Qa-1 結合エピトープと予防接種はティッシュ特定の免疫制御が強化され、いくつかの自己免疫疾患を改善するのに示されています。本蛋白質の Qa 1 エピトープの同定のため重複のペプチド ライブラリ戦略について述べる。

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

この手順の全体的な目標は、タンパク質中のQa-1エピトープを同定することです。この方法は、免疫調節と免疫療法の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マッピングされたペプチドがQa-1制限CD8 T細胞を刺激することが知られており、この手順が容易に実行できることです。この技術の意味は、多発性硬化症などの免疫介在性疾患の治療設計にまで及びます。この方法は、動物のQa-1を介した免疫制御に関する洞察を得ることができますが、ヒトのHLA-Eを介した免疫制御にも適用できます。手順を開始するには、隣接するペプチドが11個のアミノ酸でオーバーラップする15-merペプチドのライブラリを設計します。無菌条件下でペプチドを入手し、再構成します。各ペプチドについて、5ミリグラムのペプチドと100マイクロリットルのジメチルスルホキシドを組み合わせます。各ペプチドストック10μLを清潔な1ミリリットルのクライオチューブに混ぜ合わせて、OLPプールストックを調製します。次に、各ペプチドストックの20マイクロリットルをV底の96ウェルプレートにロードし、各ストックを80マイクロリットルの滅菌水で希釈します。残りの50ミリグラム/ミリリットルのペプチドストックと10ミリグラム/ミリリットルのペプチドストックのプレートの両方を摂氏20度で保存します。次に、無血清培地中の2ミリリットルの照射樹状細胞を含む15ミリリットルのチューブに10マイクロリットルのOLPプールストック溶液を加え、DMSOを200倍に希釈します。残りのOLPプールストックは摂氏20度で保管します。DCをOLPプールと室温で3時間インキュベートします。15分ごとに手で細胞を静かに振ってください。インキュベーション中に、キットを使用して、採取したマウス脾臓またはリンパ節からCD8+T細胞を精製します。無血清培地1ミリリットルあたり1000万個のT細胞を含む溶液を5ミリリットル調製し、インターロイキン2は1ミリリットルあたり50単位、インターロイキン7は1ミリリットルあたり100単位を調製します。精製されたCD8 T細胞にはビーズが付着していないか、手つかずのままでなければなりません。0.5ミリリットルのT細胞溶液を48ウェルプレートの10ウェルのそれぞれに入れます。OLPプールパルスDC溶液のインキュベーションが完了したら、DCに10ミリリットルの無血清培地を加え、細胞をGの300倍で室温で10分間遠心分離します。次に、5ミリリットルの無血清培地で細胞を再構成します。0.5ミリリットルの細胞懸濁液を10個のウェルのそれぞれに加えます。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気中で4日間インキュベートします。次に、各ウェルから400マイクロリットルの培地を取り出します。IL-2およびIL-7をそれぞれ1ミリリットルあたり100単位を含む500マイクロリットルの新鮮な無血清培地を各ウェルに加える。OLPプールプライミング細胞を再刺激する前に、細胞をさらに2〜3日間インキュベートします。再刺激に先立ち、マウス腹膜マクロファージを採取し、照射する。マクロファージ濃度を無血清培地1ミリリットルあたり500万細胞に調整します。10マイクロリットルのOLPプールストックと2ミリリットルの照射された腹膜マクロファージを組み合わせて、最終DMSO濃度を0.5体積%にします。この溶液に、マウスマクロファージコロニー刺激因子のミリリットルあたり100単位を添加します。.48ウェルプレートに200マイクロリットルのOLPプールマクロファージ溶液を各ウェルに充填します。プレートを摂氏37度で4時間インキュベートします。次に、200マイクロリットルの予熱済みRPMI-0培地で各ウェルをやさしく洗います。マクロファージ溶液には、多くのビーズが含まれます。OLPプールプライミングCD8 T細胞を添加する前に、プレートを顕微鏡でチェックし、すべてのウェルにビーズがないことを確認する必要があります。次に、再刺激の準備ができているOLPプールプライミングされたCD8+T細胞を回収してプールします。IL-2 を 1 ミリリットルあたり 25 単位、IL-7 を 1 ミリリットルあたり 50 単位含む無血清培地で、T 細胞濃度を 1 ミリリットルあたり 100 万細胞に調整します。プールしたT細胞溶液を1ミリリットル、OLPプールパルスマクロファージを含む各ウェルに加えます。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気で4日間培養します。次に、各ウェルから約400マイクロリットルの培地を取り出します。IL-2およびIL-7をそれぞれ1ミリリットルあたり100単位を含む新鮮な無血清培地を各ウェルに500マイクロリットル加えます。同じ条件下でインキュベーションを再開します。3〜4日後、インターフェロン-γ酵素結合免疫スポットアッセイを用いて、再刺激された細胞のOLPプール特異的Qa-1制限応答を調べます。結果を待つ間、CD8 + T細胞培地を3〜4日ごとに更新します。希薄なペプチドストックを用いてELISPOTアッセイを行い、どのペプチドがOLPプール特異的なQa-1制限インターフェロン-ガンマ分泌を産生するかを決定します。最後に、ELISPOTで切断されたペプチドシリーズを評価し、最適なQa-1エピトープを特定します。インターフェロン-γ ELISPOT アッセイでは、プールされた MOG オーバーラップペプチドライブラリーによって刺激された CD8+T 細胞を C1R と組み合わせると、スポット形成細胞が有意に増加することが示されました。Qa-1b細胞。このことは、T細胞がQa-1結合ペプチドに応答し、MOG_poolが1つ以上のQa-1結合エピトープを含んでいることを示しました。プール内の個々のペプチドをスクリーニングするために、別のアッセイを実施しました。3つのペプチドは、C1Rの存在下での応答よりも少なくとも3倍大きい応答を示しました。ペプチドを含まないQa-1b細胞。これらのうち、最も反応が強いペプチドを、さらなる評価のために選択しました。目的の15-merペプチドに基づく切断ペプチドのライブラリーを評価して、最適なQa-1エピトープを特定しました。エピトープは理想的には8〜10merで、9merが好ましいです。さらに、最適なエピトープは、15量体ペプチドと同等またはより強いインターフェロン-ガンマ応答を示すであろう。9量体のN末端切頭ペプチドはこれらの基準に最も適しており、最適なQa-1エピトープとなります。その開発後、この技術は、免疫制御の分野の研究者が、膵臓などの他の組織の免疫制御の研究のための新しいQa-1エピトープを発見する道を開きました。放射線を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。研究者は、機関の方針を厳格に遵守し、適切な訓練を受けるべきです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、ペプチドマイクロアレイ技術を適用して、ヒストンペプチド上の翻訳後修飾(PTM)を認識する抗体の特異性をプロファイリングする技術を示しています。既知のPTMの組み合わせを持つ固定化された蛍光色素標識ヒストンペプチドを含むマイクロアレイスライドを、標的PTM特異的抗体で処理します。このプロセスは、標的に対する抗体の特異性と、非標的PTMとの潜在的な交差反応性を特定するのに役立ちます。...

抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫​​原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。...

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Peptideアレイスクリーニングは、タンパク質間相互作用部位を同定するためのハイスループットアッセイです。これにより、標的タンパク質の複数の相互作用をマッピングすることができ、タンパク質を標的とする阻害剤の部位を同定する方法として役立つことができます。ここでは、ペプチドアレイのスクリーニングと解析のためのプロトコールについて説明します。...

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。...

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

ひと白血球抗原 (HLA) シーケンス臓器提供者と受信者のペア間の不一致は、臓器移植での拒絶反応の抗体の主要な原因です。レシピエントの抗ドナー HLA 同種抗体をプローブする個々 のドナーの HLA...

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

Proteogenomic ツールの紹介ポゴと高速、量的なポスト翻訳の修正、変形のためのプロトコルの参照ゲノム上に質量分析法によってペプチド マッピングを有効にします。このツールは統合、proteogenomic や個人的なプロテオーム研究直交ゲノム解析データとのインタ...

翻訳後修飾とバリアントの高速、定量的な方法はペプチドのゲノムへのマッピングを有効に

本研究は、薬物とペプチドの相互作用を同定するための戦略を提示することを目的とした。この戦略は、水晶結晶マイクロバランス(QCM)バイオセンサーに基づく薬物認識短いペプチドのバイオパンニングを含み、続いてタンパク質上の薬物認識および薬物結合部位の注釈のために得られた情報を定量的に評価するためのバイオインフォマティクス分析を行う。...

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

ここでは、高品質な免疫ペプチド化データを提供するマウスおよびヒト細胞株からのMHCクラスIおよびクラスIIペプチド複合体の精製プロトコルを提示する。プロトコルは、市販の抗体を使用したサンプル調製に焦点を当てています。...

免疫ペプチドミクス:マウスとヒトMHCクラスI-およびII関連ペプチドの分離による質量分析

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶ重複ペプチドライブラリ法によるQa-1エピトープ同定技術。15-merペプチドを用いてCD8陽性T細胞を刺激し、自己免疫疾患の治療戦略開発への応用可能性を示す免疫調節研究の手法です。

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチドライブラリを重複

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蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

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