遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

この手順の全体的な目標は、遠心式離水処理を使用して細胞を異なる細胞周期段階に分離することです。この方法は、がん治療分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。細胞を別々のフェーズに単離することで、抗がん化合物のフェーズ依存性の影響を調べることができます。

この技術の主な利点は、化学的摂動ではなく、物理的特性を使用して細胞を特定の相に分離できることです。実験を開始するには、ストロボアセンブリを遠心分離機に取り付けて、電源コードが左側のポートからチャンバーから供給されるようにします。ストロボフラッシュを調整するamp view遠心分離機が閉じているときのウィンドウ

各ブラケットの上部にある2本のプラスネジを締めて、アセンブリを所定の位置に固定します。次に、ブラケットの下部にあるつまみネジを締めます。電源コードを遠心分離機の背面にあるストロボ電源ポートに差し込みます。

次に、ローターを遠心分離機のドライブハブにまっすぐ下にセットし、Tハンドル六角レンチでしっかりと固定します。次に、水簸チャンバー、カウンターバランス、回転シールアセンブリ、および取り付けプレートを含むアセンブリをローターに置きます。ローターのボルトが所定の位置にカチッと収まるまで、片方の手を水簸チャンバーに、もう一方の手をカウンターバランスに置き、均等に押し下げます。

ケーブルの一方の端にあるピンを、回転シールアセンブリの穴に差し込みます。そして、もう一方の端で、アンカーケーブルを接続するためのブラケットに固定されたプラスヘッドネジの1つでアイホールを固定します。フローシステムを組み立て、水簸チャンバーにバッファーを出し入れするには、サイズ16のチューブを可変速ポンプに接続します。

このチューブの一方の自由端を遠心分離チャンバーの左上にあるポートに挿入し、チャンバーに入るようにします。このチューブの自由端にフィッティングを取り付けてから、回転シールアセンブリの入力穴にフィッティングを挿入します。最後に、ポートを介して出力チューブを挿入し、回転シールアセンブリの上部にあるトランスファーチューブに取り付けます。

水簸システムが組み立てられたら、インプットチューブのもう一方の自由端を5%漂白剤で満たされた500ミリリットルのボトルに入れて滅菌します。そして、出力チューブを空の1リットルの廃棄物ボトルに入れます。次に、ポンプをオンにし、漂白剤が廃液ボトルに汲み出されるまで、水簸システム全体を流れさせます。

次に、遠心分離機の電源を入れ、指定された最大速度まで到達させて、気泡と背圧を解放します。設定速度に達したら、遠心分離機を停止します。ローターが完全に停止したら、蓋を開けてチャンバーに漏れがないか調べます。

次に、前述のように、同様の方法で、滅菌水をシステムに10分間流します。水で洗い流した後、貯水池を100ミリリットルの水簸緩衝液で満たされた滅菌ガラス瓶と交換します。入力チューブをこのボトルに入れて、一番下になるようにします。

遠心分離機を始動し、バッファーがシステム内を流れるのを待ちます。リザーバーボトルが空に近づき、水がシステムから完全に洗い流されたら、廃棄物ボトルから出力チューブをリザーバーに移動して、バッファーがシステムを通じて継続的にリサイクルされるようにします。最後に、ストロボランプのスイッチを入れ、水簸を左端に回します。

次に、ノブをゆっくりと右に回して表示ウィンドウを調整し、水簸室がはっきりと見え、ストロボライトがローターの速度と同期するようにします。テキストプロトコルに記載されているように細胞サンプルを調製します。再懸濁したセルを、リサイクル用水簸分析バッファーが入ったリザーバーボトルに加えます。

細胞がシステムに入り込み、水簸チャンバー内で平衡に達するのを待ちます。すべての細胞がチャンバー内に保持されるように、スライドガラス上に溶離液を一滴垂らし、顕微鏡で観察します。サンプルに無傷の細胞がない場合、チャンバー内の保持が確認されます。

すべての細胞がチャンバーに入り、チャンバーの最も白い部分に細胞と平衡を含む明確な境界が見られると、フラクションの収集を開始します。出力チューブを、W1というラベルの付いた50ミリリットルの円錐形チューブにあらかじめ冷却します。このチューブに50ミリリットルの水簸緩衝液を採取し、氷上に保存します。W1フラクションを回収した直後に、遠心分離機の速度を821Gに下げ、出力チューブをW2とラベル付けされた円錐管に移動し、この速度でさらに50ミリリットルを収集します。

速度の変更を続け、分数を収集します。リザーバータンクに媒体があることを確認し、収集したフラクションは常に氷上に保管してください。すべてのフラクションが収集されたら、遠心分離機を停止し、ストップとラベル付けされた円錐形のチューブに50ミリリットルを収集します。

ペレット細胞を各フラクションに集め、必要に応じてフローサイトメトリーやウェスタンブロッティングなどの下流分析を使用します。連続した水簸画分における細胞の平均直径を示す折れ線グラフが示されています。セルの直径が大きいほど、溶出するフラクション番号が高くなることに注意してください。

蛍光活性化細胞選別分析の結果は、20種類の水簸画分のそれぞれにおける細胞のDNA含量を示す。初期の画分F1〜F5は、G1期の細胞を表すDNA含有量が2Nの細胞をほぼ独占的に含んでいます。G1期とS期の細胞の混合物は、F6〜F9の中間画分で見られました。そして、G2からMの細胞を代表する4NのDNA含量を持つ細胞がF10から観察されました。

ここに示されているのは、G1期およびG2期からM期の細胞のプール画分中の細胞周期関連タンパク質のレベルを調査したウェスタンブロットの結果です。G2からMプールは、予想通り、G1プールと比較して、リン酸化RbとサイクリンBの濃度が高かった。サイクリンDの1つの信号は弱かったが、それでもG1プールでは検出可能であり、G2からMプールでは検出できなかった。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試行する際は、時間をかけて、水簸システムが適切に組み立てられ、すべての材料と溶液が準備されていることを確認することが重要です。この手順に続いて、治療用化合物が細胞周期位相依存的にどのように作用しているかを調べるために、細胞周期解析、細胞生存率アッセイ、イムノブロットなどの他の方法を実施することができます。