Name: 遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ遠心浄化法による急性リンパ性白血病細胞の細胞周期段階別分離技術。物理的特性を利用した化学的攪乱なしの分離で、抗がん剤の段階依存性効果を評価する研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NIH (TCC) に CA109821 によって支えられました。気前よく文書のコストをカバーするための資金を提供するためとセットアップと飛びだしシステムの運用に関する技術援助ベックマン ・ コールターに感謝します我々 は博士フレッド ・ ファルケンバーグが初期プライマリのすべての文化を提供することをありがちましょう。

注: このプロトコルは、B-すべての主要な細胞の直径は約 8 μ m (G1 期)、13 μ m (G2/M フェーズ) に範囲の最適化されています。したがって、特定の遠心速度とポンプ流量は異なるサイズの範囲のセルには適用できません。それにもかかわらず、沈降速度式を使用して適切な飛び出しパラメーターを推定できます。セル 1-3 10 6 セル/mL の x の最適密度で説明した 16 として無血清培地で培養されます。部屋の温度と最大 24 までの 20 ° C で設定遠心分離機で行われていますすべてのステップ 4 ° c の氷冷却管を使用して行われる分数のコレクションを除いて ° C
 1 飛びだしバッファーの準備と材料 細胞の凝集を低減、ハンクの飛びだしバッファーを準備するために <ol><li>&#39; s バランス 2% 牛胎児血清 (補足フェノールレッド食塩 (HBSS)。FBS) を使用して、浄化プロセス、および負荷電のセルの外観をレンダリングし、凝集を減らす 2-ナフトール-6, 8-ジスルホン酸二カリウム塩 (NDA)、1.6 g/L の間に機械的ストレスから細胞を保護するためにも。
	<ol><li>50 mL の円錐管に NDA の 1.6 グラムを追加します</li>。
		<li>無菌条件下で HBSS の 35 mL を 1 L ボトルから NDA を含む 50 mL の円錐管に追加。NDA が溶けるまでチューブを旋回します</li>。
		<li>新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに溶存 NDA 0.2 μ m フィルターを使用して転送します。HBSS の残り 1 L に NDA を追加します</li>。
		<li>では、最後に、21 mL FBS を最終濃度 2% (v/v) を取得する HBSS に追加します 。
		注: 飛びだしバッファーを作成し、HBSS またはインジケーター染料の黄変によって示されるように pH に大きな変化があるまで有効期限まで 4 ° C で保存します</li>。
	</ol></li> <li>ラベル 50 mL を分画のコレクションのための円錐管でチューブ ラベル 1、2 (W1 と W2) 分数 1-20 (F1 - F20) を洗浄し、停止があります。
	<ol><li>中古分数を収集する前に氷の上にこれらの管を寒さ</li>。
	</ol></li></ol> 2。浄化システムのアセンブリ <ol>左側のポートを通ってチャンバから電源を供給できるように、<li>まず、遠心分離機にストロボ アセンブリをインストールします。ストロボ フラッシュ ランプは商工会議所の前面は遠心分離機が閉じられたときそれが表示ウィンドウで整列されるのでを確認します。
	<ol><li>で各ブラケットの下部に蝶ネジを締めて、最初各ブラケットの上部に 2 つの穴に 2 つのプラス頭ネジを締めによって場所にアセンブリをセキュリティで保護します</li>。
		<li>遠心分離機の背面にあるストロボの電源ポートに電源コードを差し込みます</li>。
	</ol></li> <li>次に、遠心分離機ドライブハブにまっすぐにローターをセットし、T ハンドル六角レンチで固定します 。
	注: 場合非飛び出し用遠心分離機が必要でないストロボ アセンブリとローターに保存できます実行の間遠心分離機で</li>。
	<li>ローターを固定すると、一度は、ロータにシールの組立・取付板を回転飛び出し室、カウンター バランスを含むクイック リリース アセンブリを配置します。
	<ol><li>を均等に押す片手で飛びだし室とカウンター バランスの一方のローター ボルト取付板の穴にカチッとはまるまで</li>。
		<li>最後に、回転シール アセンブリの穴にケーブルの 1 つの側面のピンを配置すると左側に o のブラケット (2.1.1 に記載) + ネジの 1 つとケーブルの反対側アイホール固定アンカー ケーブルを添付します。f 商工会議所します</li>。
	</ol></li> <li>次に、変数の速度のポンプを使用してフロー システムを構築して、商工会議所飛びだしにチューブ ポンプ バッファーへと飛び出し室から移動するときに、バッファーを収集します。
	<ol><li>サイズ 16 入力管上部のポートを介して変速ポンプから来るまま遠心室内の商工会議所に入るので、挿入</li>。
		<li>入力管の自由端に継ぎ手を接続し、回転シール アセンブリ横の穴に入力に継手を挿入します</li>。
		<li>インサート サイズ 16 出力ポートを介してチューブ、回転の上部に転送管に取り付けますシールアセンブリします 。
		メモ: フロー システムの飛びだし実行の間組み立てられたままもできます</li>。
	</ol></li> <li>最後に、遠心分離機をオンにして、実験に必要な仕様を設定。
	<ol><li>ローターの ID の変更</li>
		<li>水簸分級実行を完了するよりも十分です 2 時間の遠心分離機は、時間の入力を必要とする場合を設定します</li>。
		<li>24 の最大温度 20 ° C に温度を設定 ° C</li>
		<li>最大の加速と減速のために遅く設定します</li>。
		<li>最後に、867 x g に速度を設定</li>
	</ol></li></ol> 3。浄化システムのプライミング 殺菌浄化システム、5% の漂白剤を含む 500 mL ペットボトルに貯留管を置き、空 1 L の廃プラスチック ボトルに出力管を配置するために最初の <ol><li>。
	<ol><li>それ廃液ボトルに出力管からポンプでくまれるまで飛び出しシステムをフローする 5% の漂白剤のポンプをオンにして速度を 25 mL/min に設定でき</li>。
		<li>遠心分離機をオンにして、泡と背圧を解放するために (867 x g) の速度を指定された最大値を出すことができます</li>。
		<li>は、遠心分離機を停止します。ローターの回転が停止すると、一度蓋を開き、室内楽、任意の漏れを検査します</li>。
		<li>リークがない場合させて漂白剤溶液で少なくとも 5 分間システムのフロー</li>
	</ol></li> <li>次に、漂白剤は、細胞に害をもたらすだけでなく、細胞の凝集につながる可能性があります飛びだしバッファーから析出物の形成につながる可能性としてオートクレーブ水システムをフラッシュします。
	<ol><li>場所オートクレーブの 1 L ボトルに貯留管水し、少なくとも 10 分をフラッシュするそれを許可</li>
	</ol></li> <li>水でフラッシュした後、システムに飛びだしバッファーを紹介します。飛びだしバッファーおよび細胞のための貯蔵を作成するオートクレーブ養生されている 150 mL 瓶を使用します。
	<ol><li>ボトルに 100 mL の水簸分級バッファーを追加し、チューブが一番下にくるように、貯水池のチューブ ガラスのボトルに移動します</li>。
		<li>遠心分離機を開始でき、流れる水を洗い流すシステムにバッファーします</li>。
		<li>リザーバー ボトルはほとんど空と水は完全にシステムから消去、移動、出力管廃液ボトルから貯蔵所に、バッファーがシステムでリサイクルされている</li>。
	</ol></li> <li>飛び出し商工会議所は、現在の速度で見ることができるので、さらに、表示ウィンドウを調整します。
	<ol><li>プレス、ストロボ ランプ電源ランプが点灯するので、遠心分離機の外側のボタンであります。飛び出し k を有効に左端に遠心分離機の外側にもノブ</li>。
		飛びだし室表示とストロボの光に来るまで右にノブは、ローターの回転と時間表示窓からゆっくりと探している間 <li>ターン 。
		注: 水簸分級システムことができます状態のままにこのセルを準備するまで.</li>
	</ol></li></ol> 4。細胞試料調製 <ol><li>カウント細胞といくつかの 50 mL の円錐管に分注 300 に 4 億で培。1210 x g で 3 分間で細胞をスピン</li>
	<li>25 mL の上下に軽くピペッティングによる飛び出しバッファーで成長のメディアと再懸濁します細胞を吸引します</li>。
	<li>を減らすために細胞を凝集、パス細胞 2 回、25 ゲージの針。
	<ol><li>10 mL の注射器を使用してセルを描く 25 ゲージの針を添付し、内側にからのセルを渡す滅菌 50 mL の円錐管の壁。この手順を繰り返してすべての 25 mL は、針を通過している</li>。
		<li>新しい針と注射器を入手し、一度上記の手順を繰り返します 。
		注意: 注射針はディスポに配置する必要があります 。
		注: セルを針を介してプッシュ水簸分級システムにそれらを導入する前にすぐを細胞凝集を最小限の維持が重要です</li>。
	</ol></li></ol> 5。導入細胞サンプルの水簸分級システムと分数コレクション <ol><li>を通じてリサイクル飛びだしバッファーの残りのあるリザーバ タンクにセルのサンプルを注ぐことによって浄化システムにセルのサンプルをご紹介.
	<ol><li>システムに入力し、飛び出しチャンバ内で平衡に達する細胞ができます 。
		注: このプロセスは約 5 分かかります、表示ウィンドウを介してチャンバを入力するとセルを見ることによって進捗状況を追跡ことができます。ドロップを取るようにすべてのセルは、商工会議所、溶離液のガラス スライド上に配置し、顕微鏡下で表示。これは商工会議所での保持を確認するサンプルがそのままなセルのフリーの場合</li>。
	</ol></li> <li>室にすべてのセルを入力し、セルが均衡商工会議所の最も広い部分で明確な境界がある分数を収集を開始します。
	<ol><li>開始 50 mL の円錐管に出力管を移動しては、W1 をラベル付けします。50 mL のリザーバ タンクに目を離さないし、飛び出しバッファー必要があるときに補充するようにして、この分数の飛びだしバッファーを収集します 。
		注: システムにすべてのセルが入力されていることを確認、するためにリザーバ タンク初めて貯水池を充填する前にほぼ空になることができます。最初の詰め替え後貯水池ほぼ空になるを待つ必要があります。また、これまで泡と背圧を作成するシステムで、これが空になるためにタンクを許可するしないで</li>。
		<li>W1 の 50 mL が収集されて、一度同時に 821 x g に速度を変更 W2 というラベルの付いた円錐管の出力管を移動し、50 mL この速度でより多くを収集します</li>。
		<li>は、速度を変更して、表 1 に示されているように、分数を収集を続けます。貯留層におけるメディア タンクし、常に氷の上の円錐管があることを確認します。さらに、速度が減少、徐々 つまみを右に回して、表示ウィンドウを調整します</li>。
		<li>20 のすべての分数は収集されているし、遠心分離機を停止、停止というラベルの付いた円錐形の管の 50 mL を収集します</li>。
	</ol></li></ol> 6。飛び出し系フラッシング <ol><li>遠心分離機が停止した後完全にフラッシュ システム オートクレーブ水と廃棄物のボトルに戻る出力管の 1 L ボトルで貯留管を置くことによって。
	<ol><li>50 mL/min までポンプの速度を切り、水がなくなるまで、システムを介して実行するを許可します</li>。
	</ol></li> <li>電源、ポンプをオフ クイック リリース アセンブリから入力と出力のホースを取り外し、アンカー ケーブルからピンを抜きます。
	<ol><li>ローターからクイック リリース アセンブリを削除します 。
		注: 遠心分離機が使用されるか、によって飛び出しシステム今をそのままです。それ以外の場合、アセンブリ全体が前述を逆の順序で閉鎖することができます。飛びだしチャンバーをクイック リリース アセンブリから削除し、清掃超音波水浴を使用して実行できます。これは後の実行に悪影響を及ぼす室壁から瓦礫や汚染物質を削除します</li>。
	</ol></li></ol> 7。分数と G1 または G2/M プールのコレクションの分析。
 注: 浄化の有効性を示すために各分画、細胞数、細胞径および DNA 量を分析し、に従って、イムノブロット解析の G1 または G2/M の段階で細胞のプールが作成されます代表の結果。このプロトコルのセクションは、これらのプールを作成し、実験用のためにそれらを準備する方法を説明します。
<ol><li>4 ° C と飛びだしバッファーを吸引で 5 分間 2000 x g で各分画をスピンします</li>。
	<li>G1 相プールと G2/M 段階プールの両方を取得するために一緒に結合分画。
	<ol><li>のための G1 相プール、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) 1 mL、15 mL の円錐管への転送の合計で 661 × g (F1 - f5 キーを押して) 788 × g の速度範囲で収集した画分を再懸濁します。G2/M 段階プール × g と 333 x グラム (F17 - F20) 387 の速度範囲で集められた分数を再懸濁します。</li>。
		<li>細胞 4 ° C と PBS を吸引で 5 分間 2000 x g でスピンダウンします</li>。
	</ol></li> <li>細胞数をとり成長媒体の 10 mL の細胞を再懸濁します</li>。
	<li>Propidium ヨウ化染色を介してコンテンツの DNA を分析するのに各プールから、因数を取るし、フローサイトメトリー解析 15 をフローします 。
	注: 各プールの残りの部分は、さらに実験のため使用できます</li>。
</ol>

<ol><li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote%2C+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+cell+res%22%5BJournal%5D)">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li>
<li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755438">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li>
<li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li>
<li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755441">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+biochem+physiol+Toxicol%2Cpharmacol+CBP%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li>
<li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Prep+biochem%2Cbiotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li>
<li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+cells+by+targeting+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+diff%22%5BJournal%5D)">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li>
<li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinic+oncol%22%5BJournal%5D)">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li>
<li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perspective+on+old+drugs%3A+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Pharmazie%22%5BJournal%5D)">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li>
<li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+res%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li>
<li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+hematol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li>
<li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+biochem+sci%22%5BJournal%5D)">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li>
<li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+biochem+biophys%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li>
<li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

アニシャ Kothari は現在聖ジュード小児研究病院学講座細胞分子学です。

CCE を使用して細胞周期の異なった段階でプライマリを取得するためのメソッドのすべてのセルを説明しました。最適な条件で G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で細胞の高濃縮人口に容易に得ることができた優れた収率で、必要な場合、S 期で高濃縮のセルを取得することも。ここで示された結果は、独立した文化、すべて 215ですべての文化 (具体的には、すべての-5) と本質的に同一の結果が得られている 1 つのプライマリを使用して得られました。さらに、他のすべてのプライマリ日付を調べてすべての文化非同期成長中に同じような密度の範囲があるし、可能性が高い実行同様に CCE を受けるとき。私たちの先行研究も CCE19,20を使用して異なる細胞周期段階分け他白血病細胞株 HL60 と K562 などを含むことができますを示しました。重要なステップの手順では、実行の開始時、セルの単分散とない周辺固定支持が確実対向速度と回転速度の条件の最適化汚れや破片; がないは、システムの...

培養細胞は通常非同期的に成長し、個々 の細胞が細胞周期の異なった段階の存在。いくつかの生物は当然のことながら同期の細胞周期を展示または特定の生理学的な刺激によって同期することができます。たとえば、粘粘菌変形体の巨大なでん内核分割高同期ファッション1, と指数養魚は光と闇を交互に同期できる緑の藻の細胞期間2。このような生物は、ユニークな実験的属性を提供する間不十分な哺乳類細胞の複雑さをモデルします。人工的に哺乳類セル人口の同期機能細胞周期チェックポイントの分子基盤と細胞周期制御の理解を推進する中心となっています。血清剥奪、化学ブロック、リリース、または物理的特性3,4を利用する一般的な方法があります。血清の撤退、静穏化を入力するセルが生じる、再血清添加 G1 フェーズ5細胞周期再突入に昇格させます。阻害剤には、余分なチミジンやヒドロキシウレア G1/S 境界で細胞をブロック、M フェーズ3,4のセルを通常逮捕微小管阻害剤などのエージェントが含まれます。分裂振り払い間期細胞6より少ない付着しているので、分裂期細胞の豊かにするために使用できる物理特性を悪用する手法が含まれます。ただし、すべてのこれらの技術の潜在的な欠点があります。たとえば、すべてのセル型は分裂振り払いは有糸分裂阻害薬の事前同期せず限られた後血清や化学剤の存在の有無と細胞の収量で生存率を維持します。
初期胚細胞周期、場所細胞は分類7サイズが徐々 に減少を除いてほとんどの細胞周期を進める成長段階を経るし、サイズが大きくなります。このプロパティは、対向流遠心浄化 (CCE)、サイズの異なる細胞を分離する使用ことができますし、それゆえ細胞周期段階8,9の手法で利用されます。CCE、中に細胞が 2 つの反対勢力の影響の下で: 回転の軸から細胞を運転する遠心力と流体の速度 (対向)、回転 (図 1) の軸に向かってセルを駆動します。これらの力が等しい平衡位置を飛びだしチャンバーで細胞に到達します。平衡位置を指示、重要な要因は細胞径および密度です。緩衝液の率の増加の流れとして、対向ドラッグ力が遠心力を上回る新しい均衡を確立すると、商工会議所の内部のセルの位置が変更されています。すべてのセルが対向流率はその出口を促進するために十分に増加するまで商工会議所内より大きい細胞にとどまるに対し小さいものは最初、商工会議所のままで、その結果、チャンバー出口に向かってシフトされます。特定分数で対向速度の連続増加と飛びだし室をエスケープ細胞を集めることができるし、各分画に順番にサイズの増加のセルが含まれています。対向流率の増加と飛び出しを行う必要がなく遠心分離速度を減少させることによって遠心力の連続の減少は、同じ結果を達成するでしょう。浄化のプロセスには、セル型、採用、飛びだしバッファーおよび使用される特定の装置によって最適化が必要です。これらの条件下で細胞の堆積速度はストークスの法則によって最もよく述べ: SV = [d2(ρp- ρm)/18η] .ω2r、SV = 沈降速度;d = 粒子の直径Ρp = 粒子の密度Ρm = バッファーの密度Η = バッファーの粘度Ω =; ローターの角速度r = 粒子の半径方向の位置。したがって、SV は細胞径および密度に比例して、細胞周期を通って一般に定数である密度より大きく寄与直径が 2 番目の電源に発生するので。
CCE の重要な利点は、細胞が化学治療や栄養欠乏の過酷な条件にさらされないと本質的に動じない優れた収率で回収することができます。要件は、細胞周期にトラバース、問題の細胞が直径の少なくとも 30% の大幅な増加を受けることです。主な欠点は、特殊な遠心分離機、ローター、アクセサリーのコストです。それにもかかわらず、CCE によって豊かに細胞周期の特定の段階で細胞を準備する機能は、酵母から哺乳類セル9,10の生物で細胞周期研究を促進しています。また、最近の進歩で、細胞の分離の使用を拡大して癌組織、異なる種類の細胞、異種混合物でし免疫療法9の特定の細胞型の生産分離対健康からいます。
我々 の主要な関心のビンカ アルカロイドやタキサン系薬剤などのエージェント (Mta) 微小管作用のメカニズムを理解されています。これらの薬は、有糸分裂、スピンドル微小管機能11,12のブロックにのみ行動すると考えられていたが、最近の証拠は、彼らが間期の微小管13,14の対象にも示唆しています。我々 は最近、プライマリ急性リンパ芽球性白血病 (ALL) セル G1 期のいずれかの死を受けるまたは M 相ビンクリスチンと細胞周期依存的15の他の Mta で処理することを報告しました。CCE によって異なった細胞周期の段階にすべてのセルを分ける機能はこの結論に達するに尽力しました。この記事では、技術的な詳細を説明して、異なった細胞周期の段階ですべてのセルの CCE のプライマリの調製への応用のための実用的なヒントを提供します。

<table><tbody><tr><td>ハンクスの平衡塩溶液</td><td>ロンザ</td><td>10-508Q</td><td>1 L ボトル</td></tr><tr><td>胎児プラス ウシ血清</td><td>アトラス バイオロジカルズ</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL ボトル</td></tr><tr><td>2-ナプトール-6,8-ジスルホン酸 ジカリウム塩</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>212-672-4</td><td>100 g 粉末</td></tr><tr><td>50 mL コンシェルチューブ</td><td>デンビル サイエンティフィック</td><td>C1062-P</td><td>500/ケース</td></tr><tr><td>PES メンブレン 0.22&マイクロ;m フィルターユニット</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/pack</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut.非IVD - 50/60 Hz、200/208/240V</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B14544</td><td>遠心分離機、水簸システム</td></tr><tr><td>JE 5.0 水簸装置ローターキット</td>に対応 <td>ベックマン・コールター</td><td>356900</td><td>ローターキット(ローター、Tハンドル六角レンチ、クイックリリースアセンブリ(水簸チャンバーなし)、アンカーケーブル、ストロボアセンブリを含む</td></tr>) <tr><td>チャンバー、標準、4 mL、「A」</td><td>ベックマン・コールター</td><td>356943</td><td>標準水簸室&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load ポンプヘッド</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 可変速ドライブ</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm プラチナ硬化シリコーンポンプチューブ、L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td>滅菌済み、使い捨てニードル</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lokシリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td>滅菌済み、使い捨てシリンジ</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase 染色緩衝液</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>ヨウ化プロピジウム/RNase 染色緩衝液</td></tr><tr><td>cyclin B1 (GNS1) マウスモノクローナルIgG抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) マウスモノクローナルIgG抗体</td><td>SantaCruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR ウサギモノクローナル抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) ウサギモノクローナル抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L)-HRP 結合体</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)-HRP 結合体</td><td>BioRad</td><td>〒170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

セルを同期する機能を細胞周期の規則の私達の理解を進める中心となっています。一般的な技法は、血清遮断;化学物質の細胞を別の細胞周期段階で逮捕または分裂振り払い減少への遵守を悪用するの使用します。しかし、これらすべての欠点を持ちます。たとえば、血清飢餓動作も正常な細胞が、腫瘍細胞が癌遺伝子の活性化や腫瘍サプレッサーの損失のための危険にさらされた細胞周期チェックポイントのあまり。同様に、化学的に扱われる細胞集団は薬害被害を抱くし、ストレス関連の変更を表示できます。これらの問題を回避する手法が対向流遠心浄化 (CCE) つの反対勢力、遠心力と流体の速度、サイズおよび密度に基づいて細胞の分離の結果をセルを受けます。通常サイクルを進める細胞が拡大するので、細胞を別の細胞周期の段階に分割する CCE を使用できます。ここで我々 は急性リンパ性白血病の主にこの手法を適用します。最適な条件下で、優れた収率で、G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で高濃縮細胞集団が取得できます。これらの細胞は、抗がん剤の作用の勉強の細胞周期依存性のメカニズムおよび他のアプリケーションには最適です。またどのように標準的な手順に変更の最適なパフォーマンスの結果を表示し、技術の制限について説明。紹介する詳細な方法は、アプリケーションや他の種類の細胞に手法の探査を促進するべき。

プライマリのすべてのセル (10 x 3 48) 遠心浄化を受けるし、プロトコルで説明されているように 2 つの洗浄分数と 20 の主な分数に収集されました。対応するローターの速度と同様、各画分のセルの合計数が表示されます代表的なデータを表 1 に示します。全体収率は通常 80% では以上。留分の細胞径の測定は、そのセル径に伴って飛び出し (図 2) を確認しました。これらの結果は、2 つの独立した測定の平均値を表し、データ再現性の高度を反映します。分数は、propidium ヨウ化染色が施された次におよびフローサイトメトリー DNA 量 (図 3) を決定します。初期分数 (F1 - f5 キー) は、G1 期を表す 2N DNA 量とほとんど専ら細胞を含まれています。G1 期と S 期の細胞の混合物は中間留分 (F6 - f9 キー) で観察されたと 4 n の DNA 量と細胞観察 [f10] キーで開始。後の分数は、G2/M...

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

この手順の全体的な目標は、遠心式離水処理を使用して細胞を異なる細胞周期段階に分離することです。この方法は、がん治療分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。細胞を別々のフェーズに単離することで、抗がん化合物のフェーズ依存性の影響を調べることができます。この技術の主な利点は、化学的摂動ではなく、物理的特性を使用して細胞を特定の相に分離できることです。実験を開始するには、ストロボアセンブリを遠心分離機に取り付けて、電源コードが左側のポートからチャンバーから供給されるようにします。ストロボフラッシュを調整するamp view遠心分離機が閉じているときのウィンドウ。各ブラケットの上部にある2本のプラスネジを締めて、アセンブリを所定の位置に固定します。次に、ブラケットの下部にあるつまみネジを締めます。電源コードを遠心分離機の背面にあるストロボ電源ポートに差し込みます。次に、ローターを遠心分離機のドライブハブにまっすぐ下にセットし、Tハンドル六角レンチでしっかりと固定します。次に、水簸チャンバー、カウンターバランス、回転シールアセンブリ、および取り付けプレートを含むアセンブリをローターに置きます。ローターのボルトが所定の位置にカチッと収まるまで、片方の手を水簸チャンバーに、もう一方の手をカウンターバランスに置き、均等に押し下げます。ケーブルの一方の端にあるピンを、回転シールアセンブリの穴に差し込みます。そして、もう一方の端で、アンカーケーブルを接続するためのブラケットに固定されたプラスヘッドネジの1つでアイホールを固定します。フローシステムを組み立て、水簸チャンバーにバッファーを出し入れするには、サイズ16のチューブを可変速ポンプに接続します。このチューブの一方の自由端を遠心分離チャンバーの左上にあるポートに挿入し、チャンバーに入るようにします。このチューブの自由端にフィッティングを取り付けてから、回転シールアセンブリの入力穴にフィッティングを挿入します。最後に、ポートを介して出力チューブを挿入し、回転シールアセンブリの上部にあるトランスファーチューブに取り付けます。水簸システムが組み立てられたら、インプットチューブのもう一方の自由端を5%漂白剤で満たされた500ミリリットルのボトルに入れて滅菌します。そして、出力チューブを空の1リットルの廃棄物ボトルに入れます。次に、ポンプをオンにし、漂白剤が廃液ボトルに汲み出されるまで、水簸システム全体を流れさせます。次に、遠心分離機の電源を入れ、指定された最大速度まで到達させて、気泡と背圧を解放します。設定速度に達したら、遠心分離機を停止します。ローターが完全に停止したら、蓋を開けてチャンバーに漏れがないか調べます。次に、前述のように、同様の方法で、滅菌水をシステムに10分間流します。水で洗い流した後、貯水池を100ミリリットルの水簸緩衝液で満たされた滅菌ガラス瓶と交換します。入力チューブをこのボトルに入れて、一番下になるようにします。遠心分離機を始動し、バッファーがシステム内を流れるのを待ちます。リザーバーボトルが空に近づき、水がシステムから完全に洗い流されたら、廃棄物ボトルから出力チューブをリザーバーに移動して、バッファーがシステムを通じて継続的にリサイクルされるようにします。最後に、ストロボランプのスイッチを入れ、水簸を左端に回します。次に、ノブをゆっくりと右に回して表示ウィンドウを調整し、水簸室がはっきりと見え、ストロボライトがローターの速度と同期するようにします。テキストプロトコルに記載されているように細胞サンプルを調製します。再懸濁したセルを、リサイクル用水簸分析バッファーが入ったリザーバーボトルに加えます。細胞がシステムに入り込み、水簸チャンバー内で平衡に達するのを待ちます。すべての細胞がチャンバー内に保持されるように、スライドガラス上に溶離液を一滴垂らし、顕微鏡で観察します。サンプルに無傷の細胞がない場合、チャンバー内の保持が確認されます。すべての細胞がチャンバーに入り、チャンバーの最も白い部分に細胞と平衡を含む明確な境界が見られると、フラクションの収集を開始します。出力チューブを、W1というラベルの付いた50ミリリットルの円錐形チューブにあらかじめ冷却します。このチューブに50ミリリットルの水簸緩衝液を採取し、氷上に保存します。W1フラクションを回収した直後に、遠心分離機の速度を821Gに下げ、出力チューブをW2とラベル付けされた円錐管に移動し、この速度でさらに50ミリリットルを収集します。速度の変更を続け、分数を収集します。リザーバータンクに媒体があることを確認し、収集したフラクションは常に氷上に保管してください。すべてのフラクションが収集されたら、遠心分離機を停止し、ストップとラベル付けされた円錐形のチューブに50ミリリットルを収集します。ペレット細胞を各フラクションに集め、必要に応じてフローサイトメトリーやウェスタンブロッティングなどの下流分析を使用します。連続した水簸画分における細胞の平均直径を示す折れ線グラフが示されています。セルの直径が大きいほど、溶出するフラクション番号が高くなることに注意してください。蛍光活性化細胞選別分析の結果は、20種類の水簸画分のそれぞれにおける細胞のDNA含量を示す。初期の画分F1〜F5は、G1期の細胞を表すDNA含有量が2Nの細胞をほぼ独占的に含んでいます。G1期とS期の細胞の混合物は、F6〜F9の中間画分で見られました。そして、G2からMの細胞を代表する4NのDNA含量を持つ細胞がF10から観察されました。ここに示されているのは、G1期およびG2期からM期の細胞のプール画分中の細胞周期関連タンパク質のレベルを調査したウェスタンブロットの結果です。G2からMプールは、予想通り、G1プールと比較して、リン酸化RbとサイクリンBの濃度が高かった。サイクリンDの1つの信号は弱かったが、それでもG1プールでは検出可能であり、G2からMプールでは検出できなかった。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試行する際は、時間をかけて、水簸システムが適切に組み立てられ、すべての材料と溶液が準備されていることを確認することが重要です。この手順に続いて、治療用化合物が細胞周期位相依存的にどのように作用しているかを調べるために、細胞周期解析、細胞生存率アッセイ、イムノブロットなどの他の方法を実施することができます。

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、3つの白血病細胞亜集団の空間的分離の方法を説明しています。これは、培地中に自由に浮遊する懸濁白血病細胞、間葉系細胞単層の表面に付着した位相明るい白血病細胞、および2D共培養により間葉系間質細胞単層の下に移動した薄暗い白血病細胞です。...

白血病亜集団の収穫:2D共培養からの白血病細胞亜集団の空間的分離のための方法

このビデオでは、末梢血から慢性リンパ性白血病(CLL)細胞を分離する技術について説明しています。このプロトコルでは、ヒト患者の血液サンプルからCLL細胞を分離し、その後の核画分および細胞質画分の効率的な生成を実現します。...

密度勾配遠心分離法:末梢血からCLL細胞を単離する方法

このビデオでは、白血病細胞から細胞内画分と核分画を生成する方法である白血病細胞からの細胞内画分の調製について説明しています。核画分と細胞質画分は、さらに下流の分析に使用できます。...

白血病細胞からの細胞内画分の調製:白血病細胞から細胞画分および核画分を生成する方法

染色体は、例えば、リンパ球または皮膚線維芽細胞等の生細胞から、ヒトまたはマウスを含む生物から単離することができる。これらの染色体調製物は、さらに、ルーチンG-バンディングなどsituハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）、スペクトル核型分析（SKY）のような分子細胞遺伝学手順のために利用することができる。...

培養細胞からの染色体の準備

現在のレポートは、最も化学療法抵抗性のある亜集団の濃縮に重点を置いて、白血病細胞に対する骨髄微小環境ニッチの影響をモデル化するために利用できるプロトコルをまとめています。...

モデル化学療法抵抗性白血病<em&gt;インビトロ</em

好中球は最も豊富な種類の白血球です。ここでは、密度勾配分離法によるヒト血液からの好中球の単離と、顆粒球経路に沿ったヒト前骨髄球(HL60)細胞の分化について説明します。抗リンパ腫薬に対するリンパ腫細胞の感受性に対するそれらの役割をテストするため。...

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

B-LCLを確立するための単純な赤血球溶解方法は、少量の血液を必要とし、凍結保存し、開始からの時間を節約し、高い不死化効率で開発されました。...

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ)...

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

このプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらのサンプルは、タンパク質の局在化と、細胞刺激および薬物治療時に核と細胞質区画の間で起こるタンパク質の密売の変化を決定するために使用されます。...

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

このプロトコルは、注射の 4 日後に行われる患者由来の B および T 急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の卵子異種移植...

Ovoに位置 患者由来急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の異種移植 (PDX-ALL)

このプロトコルは、導入化学療法に対する反応のダイナミクスに基づいて、急性リンパ芽球性白血病の再発を生成するためのマウスモデルを説明することを目的としています。...

急性リンパ芽球性白血病に対する導入化学療法への白血病再発のマウスモデル

学ぶ遠心浄化法による急性リンパ性白血病細胞の細胞周期段階別分離技術。物理的特性を利用した化学的攪乱なしの分離で、抗がん剤の段階依存性効果を評価する研究に応用できます。

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

さらに動画を探す