Name: Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶSOD1タンパク質凝集の高コンテンツ定量法。HEK-293細胞を用いたレンチウイルス導入と自動共焦点イメージングにより、神経変性疾患における低分子化合物の効果を時系列・用量依存的に評価する手法を確立します。

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この作品は、韓国政府 (MSIP) (NRF 2014K1A4A7A01074642)、および国立研究財団の韓国 (NRF) 個々 の科学者サポート プログラム (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) によって資金を供給された助成金によって支えられました。

1 レンチ ウイルス生産 注: 生産およびレンチウイルスベクターの操作は含む組換え研究の国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従って実施された。DNA。キム ら 説明野生型および A4V 変異 SOD1 が付いた (SOD1WT YFP と SOD1A4V YFP) 強化された YFP プラスミド エンコードします。 11 両方遺伝子融合製品 PCR プライマー 5 を使用して増幅された &#8242; - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 &#8242; 5、&#8242;-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 3 &#8242; pTRIP デルタ U3 CMV 挿入プラスミド 19 XhoI と BsrGI 制限のサイトを使用しています。事前の実験で HEK 293 t 細胞は、2 日ごと 1:4 1:6 の比率で分割されました。20 以上の通路と少ない 60% の合流により良いトランスフェクションの効率を確保するために細胞の維持の回避します。
<ol><li>日 1 に、ウイルスの生産のための細胞培養液 (10 %fbs と 4 mM L グルタミンの高グルコース DMEM) 10 mL に 10 cm 径組織培養プレート (3 x 10 の 6 セル/ディッシュ タイプ) 30-40% 合流 HEK 293 t 細胞を分割します</li>。
	<li>直径 10 cm の組織培養プレート (37 ° C、5% CO 2) CO 2 インキュベーターで一晩保持します</li>。
	<li>日 2 の準備レンチウイルスベクターの 10 μ g を含む DNA トランスフェクション ソリューション (pTRIP デルタ U3 の CMV - SOD1WT YFP または - SOD1A4V-YFP)、レンチ ウイルスとプラスミド (pVSVg の 5 μ g; pCMV dR8.71 の 10 μ g) (包装 図 2 a) 20. 1 M CaCl 2 125 μ L を追加し、蒸留水を使用して 500 μ L にボリュームを調整します。ゆっくり混合物に 0.05 M HEPES の 500 μ L を追加し、室温で 10 分間インキュベートします</li>。
	<li>置換 HEK 293 t 細胞の抗生物質フリー 10 mL に予め温めておいた新鮮な培養液 1 mL DNA トランスフェクション溶液と混合媒体と 37 ° C、5% CO 2 で一晩インキュベートします</li>。
	<li>3 日目、新鮮な培養液上清中のセルを置換します</li>。
	<li>日 4 では 15 mL チューブで死んだ細胞および残骸を取除く 500 x g で 5 分間遠心上清を収穫します。さらに 60 mL の大型シリンジを使用して 0.45 μ m のフィルターを通過して上清を浄化します。すぐに使い捨ての因数 (300 μ L) に分配し、-80 ° C で保存最大製品活動を維持するために凍結融解サイクルを回避します</li>。
</ol> 2。レンチ ウイルス伝達 <ol><li>分割 60% 合流で感染する細胞株 (HEK 293 細胞と SH SY5Y; ウェルあたり 5 x 10 の 5 セルと U2OS; ウェルあたり 1 x 10 の 5 セル) DMEM 培地 2 mL に 6 も組織培養プレートに10 %fbs</li>。
	<li>37 ° C の定温器で 5% CO 2 に一晩 6 ウェル培養プレートを保持します</li>。
	<li>-80 ° C のフリーザーから冷凍のレンチ ウイルスを削除、各使用前に氷の因数を解凍; 再冷凍しないでください</li>。
	<li>ウイルスを解凍すると中は、暖かい関心の細胞ラインと互換性の血清を含む培養液です。ウイルスは完全に解凍、希釈の範囲を準備 (1:3、1:10、1:30 と 1: 100) 1.5 mL の新鮮なおよび microfuge の管に DMEM で</li>。
	<li>低下した血清中のメディアと 1 mL にチューブ内のボリュームをもたらすします</li>。
	<li>ウイルス/メディアの ml (4 μ g/μ L の在庫) で Polybrene の追加 2 μ L。ピペッティングでよく混ぜるし、セルに混合物の 1 つの mL を追加します。24 時間のウイルスと細胞をインキュベート</li>
	<li>ウイルスのメディアを削除し、通常 DMEM 培地 10% に置き換える FBS。37 ° c、5% CO 2 細胞を維持します</li>。
	<li>は、細胞の成長を監視し、文化メディア 2 日ごとに変更します。Confluence (コンフルエンス) で直径 10 cm の組織培養プレートに 6 よく皿を展開します</li>。
	<li>セルが十分に展開されている一度、DMEM 384-well アッセイ プレート、YFP の表現レベルをチェックするメディアの 50 μ L の井戸あたり種子 1.5 × 10 4 細胞顕微鏡による蛋白質のタグ。タグ付きの YFP 発現細胞信号対雑音比が表示されます &#8805; 3、セルの対応する線の細胞の在庫を準備します</li>。
</ol> 3。時間依存蛋白質凝集に及ぼすプロテアソーム阻害剤 注: 自動顕微鏡による画像の取得を実行 (マテリアル を参照してください).
<ol><li>DMSO やプロテアソーム阻害剤の 384 ウェル平底プレート (ALLN, 2 mM) 100 %dmso に溶解の 0.25 μ L を分注します</li>。
	同じメディア <li>DMEM を 50 μ l 添加のウェルあたり手動でシード 1.5 x 10 の 4 の細胞アッセイ用プレート。プロテアソーム阻害剤 (ALLN) の最終濃度は 10 μ M をする必要があります</li>。
	<li>は、37 ° C、5% CO 2 顕微鏡システム環境制御ユニットを設定します。実験のセットアップのスクリーン ショットは、 図 3 に示す.</li>
	<li>広視野蛍光モードでは、次の設定でソフトウェアを使用しての顕微鏡の動作: 時間のキャプチャ間隔と X の目的、非共焦点モード、4 フィールド/まあ、LWD 20。それぞれの実行の最後に、撮影した画像が自動的にサーバーにアップロードします</li>。
</ol> 4。生きている細胞で YFP 式のタイムラプス イメージングの時間し、画像解析 (シングル チャンネル) 注: (例えば コロンブス) ソフトウェア アプリケーションを次に示します。
<ol><li>選択適切なアルゴリズム (細胞質と集計) のプライマリ オブジェクトをセグメント化します。必要な場合は、背景のしきい値とコントラスト パラメーター ( 図 4) を調整します</li>。
	<li>数のセルを使用して &#39; のセルを検索 &#39; YFP 輝度チャンネルの 0.1 の個々 の閾値。集計を使用してを決定する、&#39; のスポットを見つける &#39; 相対 YFP スポット強度とアルゴリズム &#62; 0.2 と分割係数 1.0</li>。
</ol> 5。線量応答プロテアソーム阻害蛋白質の集合の細胞に及ぼす生活 (2 チャンネル) の核を染色 注: 自動顕微鏡による画像の取得を実行します。最適なカーブ フィットを確保するため期待される IC 50 値に基づいてプロテアソーム阻害剤 (ALLN、Epoxomicin、および MG132) の濃度範囲を決定する。
<ol><li>準備 384 ウェル ストレージ ポリプロピレン化合物のシリアル希薄標準で 1:3 希釈系列をプレートします。化合物の希釈をミックス確認も化合物濃度が正確であることを確認する</li>。
	<li>は、0.25 μ L 空フラット底黒 384-well アッセイ プレートに対するプロテアソーム阻害剤の調剤します。我々 はボリュームを転送できる 384 キャピラリー頭装備液体ハンドラーを使用します</li>。
	アッセイ プレートに DMEM メディアの 50 の井戸あたり 10 の 4 セル x <li>シード 1.5 μ。孵化 24 時間の CO 2 を 37 ° C、5% でアッセイ プレート</li>
	<li>染色液 (10 mg/mL の在庫でヘキスト 33342) (37 ° C に加温) DMEM メディアの 10 μ L を追加し 10 分間室温でインキュベート</li>
	<li>マイクロを起動します。オペレーティング ソフトウェアを対処します。実験装置のスクリーン ショットを 図 6 に示します。選択、&#34; 構成 &#34; 目的と正しいプレート タイプ X 20 を選択します。確認 &#34; 襟 &#34; 異なるプレートの種類と適切なフォーカス可能にする目的で正しい値に設定されます</li>。
	<li>選択、&#34; 顕微鏡 &#34; タブ定義露出 YFP として 1 (488 レーザー) とヘキストとして露出 2 (405 レーザー)。両方のエクスポー ジャーのフィルターをアクティブにし、カメラ 1 とカメラ 2 の露出 2 に露出 1 を割り当てます。露出 1 ~ 800 ms に露光時間を設定露出 2 〜 40 ミリ秒です</li>。
	<li>選択露出 1。選択は、0 μ m にフォーカスの高さを設定 &#34; フォーカス &#34;。一度、フォーカス、カメラ 1 を公開します。露出面を最適化しをクリックしてフォーカスの高さを調整する &#34; の高さにする &#34;。露出時間を変更し、〜 3000 の最大ピクセル強度を与える力をレーザーします。露光パラメーターを保存します。露出 2 の繰り返し</li>。
	<li>選択 &#34; 実験の定義 &#34; タブのレイアウトと sublayout を作成します。ドラッグ アンド ドロップ関連のレイアウト、露出、参照イメージ、skewcrop ファイル、および sublayout。実験を保存します</li>。
	<li>選択 &#34; 自動実験 &#34; タブをクリックし、画像を取得します。それぞれの実行の最後に、撮影した画像が自動的にサーバーにアップロードします</li>。
</ol> 6。2 つのチャンネルの画像の解析を画像 <ol><li>(核、細胞質、および集計) のプライマリ オブジェクトをセグメントするソフトウェア アルゴリズムを選択 ( 図 7).</li>
	<li>は、正確にセグメント化されたオブジェクトの外観検査で核をセグメント化する方法を選択します。ヘキスト染色のオブジェクト チャネル 1 (Ch1) は、細胞の数を決定する使用されます。YFP 染色から突然変異体 SOD1-A4V チャネル 2 (Ch2) では、骨材の量を決定する使用されます</li>。
	<li>を使用してセルを数える、&#39; 核を見つける &#39; ヘキスト染色領域としてアルゴリズム &#62; 20 μ m 2 7.0、0.40 とコントラスト閾値の分割係数 &#62; 0.10</li>。
	<li>データ テーブルを作成しを使用して化合物のそれぞれの EC 50 を決定する、&#39; 非線型回帰 &#39; グラフ作成ソフトウェアで方程式</li>。
</ol>

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</ol>

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安定したセルラインを生成するための 2 つの主な方法があります。最初の数週間を要するし、ゲノムの統合されたプラスミド DNA ベクターの一時的なトランスフェクションと抵抗の選択が必要です。2 番目は、限られた努力で複数の細胞株における標的タンパク質の効果的な表現に従うこのプロトコルを作る、レンチを使用して時間の問題を受け取ります。保存された伝達効率と安定した遺伝子発現の使用する持続的なベクトルに旅行 CMV ベクター19はあった。驚いたことに、生成された 3 つのセルの行を示した一過性発現に基づく実験的プロトコルとは対照的突然変異体 SOD1 の表示の集計には以前11説明ないです。一過性発現が蛋白質の集合を支持するようにそれは時間の比較的短い期間でより高い蛋白質の表現を生成する可能性が高いです。一過性トランスフェクションに蛋白質の大半が低下、ユビキチン-プロテアソーム システム集計しやすい蛋白質を低下させる能力は活用飽和ポイントに達する。しかし、我々 は安定したラインが、プロテアソームによって誤って折りたたまれたタンパク質の除去に一致する比較...

蛋白質の集合であり、生物学的プロセス ミスフォールド蛋白質グループを (アミロイドーシス) の神経変性疾患の原因となるエージェントとして機能するかもしれない。蛋白質の集合を特徴づける細胞機能障害の病態の発症に影響する新しい要因の発見を促進するように同様の骨材の役割を理解することに不可欠です。細胞内のタンパク質の蛍光タグの可視化は、スクリーニング (HCS)1,2,3,4高の内容に適用される試金の開発に役立つ可能性があります強力な手法です。
筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は集計および家族性 ALS (fALS) および散発的 ALS (Sal)5,6 の運動ニューロンに蓄積する傾向の誤って折りたたまれたタンパク質の存在によって引き起こされる proteopathic 疾患とみなされる.FALS の場合の 20% のサブセットが関連付けられているゾル性細胞質の抗酸化酵素遺伝子に支配的な遺伝子変異を有する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1)7,8」と入力します。この遺伝的派生機能不全のいくつかの潜在的な原因が提案されている, 構造と機能の異常な安定性、展開数の増加、および集計9、性向などの SOD1 バリエーションの変更など 10。特に、両方の ALS リンク SOD1 の変形によって共有プロパティのみが検証し、潜在的に有害と野生型 (WT) SOD1 は仕切られたタンパク質凝集体やタンパク質の介在物11,12 を形成する増加傾向.誤って折りたたまれた突然変異体 SOD1、永続的 polyubiquitinated、ユビキチン-プロテアソーム系により劣化します。その結果、プロテアソーム活性の阻害の低レベルが突然変異体 SOD1 集計13,14, 可溶性変異 SOD1 と交換することができます水溶性の成分から成る非晶質構造を形成するの蓄積につながる細胞質15。特に、SOD1 突然変異体 A4V (アラニン コドン 4 におけるバリンに変更) は、最も一般的な ALS の原因となる突然変異と病気発症16後 2 年未満の平均生存時間と急速な神経変性に 。生化学、SOD1 A4V が monomerize、集計、およびアミロイドの毛穴を形成する傾向が増すその孔のような集計他病気にリンクされた突然変異体の形態の α-シヌクレインと β-アミロイド蛋白質17などアミロイド毛穴に似ています。SOD1 集計蓄積のダイナミクスを研究するには、水溶性と不溶性 SOD1 集計フォームを監視する方法は開発されるままです。
我々 は以前に、住セルイメージ投射を使用して、HEK 293 細胞一過性発現蛍光タンパク質タグ SOD1、ALS 関連変異体が SOD1 の活性化と集計11を損ないます。一過性発現システムは、短期的な遺伝子発現の生物学的結果について有用な情報を提供できますが、目的の遺伝子の強固な統合を提供するメソッドがアッセイ開発に適して可能性があります。そのため、レンチウイルスベクターは哺乳類セル18長期的かつ調整された遺伝子の発現を付与する能力を提供しています。本研究では WT を軸受組換えレンチ ウイルスで導入した安定したセルラインの生成に着目した、変異 SOD1 が付いた黄色い蛍光蛋白質 (YFP)。生細胞イメージング顕微鏡と SOD1 集計の自動定量評価を使用して、我々 はトリガーされ、プロテアソームの阻害に SOD1 集約イベントを定量化します。

<table><tbody><tr><td>ALLN (C20H37N3O4)</td><td>Millipore</td><td>208719</td><td></td></tr><tr><td>MG132 (C26H41N3O5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>エポキソマイシン (C28</サブ>H<サブ>50</サブ>N<サブ>4</サブ>O<サブ>7</サブ>)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>E3652</td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H-3570</td><td></td></tr><tr><td>オペラ・</td><td>パーキン・エルマー</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>オペラ・エボシェル・ソフトウェア</td><td>パーキン・エルマーVer</td><td>1.8.1</td><td></td></tr><tr><td>オペレッタ</td><td>・パーキン・エルマー</td><td>OPRT1288</td><td></td></tr><tr><td>ハーモニーイメージングソフト</td><td>パーキンエルマーVer</td><td>3.0.0</td><td></td></tr><tr><td>コロンバス画像解析ソフト</td><td>パーキンエル</td><td>マーVer 2.3.2</td><td></td></tr><tr><td>CyBi Hummingwell リキッドハンドリング</td><td>CyBio AG</td><td>OL 3387 3 0110</td><td></td></tr></tbody></table>

sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は、遺伝子符号化銅亜鉛スーパーオキシドのディスムターゼ 1 (SOD1) で受継がれた突然変異によって引き起こされることができます致命的な神経変性疾患です。SOD1 構造の不安定性および家族性 ALS 患者に SOD1 正介在物の検出は、ALS の病理変性および/または集計 SOD1 の潜在的な因果的役割をサポートしています。本研究では細胞内 SOD1 集合のダイナミクスを定量化する高いコンテンツのスクリーニングのアプローチによって設計された細胞ベースのアッセイの開発について述べる.レンチ ウイルスのベクトルを使用して、我々 は野生型と変異型の A4V SOD1 黄色い蛍光蛋白質を付けられ、両方のタンパク質が細胞質凝集の兆候なしで表現された発見を表現する安定したセルラインを生成されます。興味深いことに、SOD1 A4V だけは安定、HEK 293 で表現がない U2OS または SH SY5Y 細胞におけるプロテアソーム阻害剤投与時に集計を形成します。各種のプロテアソーム阻害剤の用量反応解析に基づく集計を定量化するタイムラプス顕微鏡による集合体形成過程を追跡することが可能であるを示す.我々 のアプローチは、SOD1 A4V 塊り形成を防止する小分子のスクリーニングし同様、形成 SOD1 の役割に ALS 変異の影響の定量化の可能性を紹介します。

レンチを使用して生成する安定したセルライン:SOD1 タンパク質凝集体を監視するための全体的な戦略を図 1に示します。最初のステップで我々 は細胞 (ステップ 1) に SOD1 遺伝子の安定配信するためのレンチ ウイルス発現ベクターを生成されます。エンコード YFP タグ SOD1 WT と SOD1 A4V 2 レンチウイルスベクター (SOD1WT YFP と SOD1A4V-YFP、それぞれ) プラスミド パッキングと封筒 (図 2 a) を作製しました。レンチ ウイルス伝達 (ステップ 2) セルに線テスト (HEK 293、U2OS、および SH SY5Y) (図 2 b)、健康、示した高発現レベルと YFP 標識 SOD1 フォームに関係なく長期に残った。興味深いことに、どちらも WT も突然変異体 SOD1 の一過性発現細胞モデルと対照をなしての...

誤って折りたたまれたタンパク質の凝集を定量化する手法について述べる.レンチ ウイルスのプロトコルの詳細は、安定的な細胞ラインの生成、自動の共焦点レーザー顕微鏡、タンパク質凝集体の画像解析に誘導されます。説明アプリケーションとして SOD1 集計時間と用量依存的に促進する上で小さな分子の影響を検討しました。

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

この実験の全体的な目標は、時間と用量に依存する方法でミスフォールドタンパク質の凝集を調節する小分子の影響を研究するためのアッセイを開発することです。この方法は、細胞アッセイの開発における重要な疑問に答えるのに役立ち、ハイコンテントスクリーニング技術に利用されています。この手法の主な利点は、いくつかの神経変性疾患で発生するタンパク質凝集を検出および定量化する簡単な方法を提供することです。この技術の意味は、細胞アッセイを開発し、低分子モデレーターのスクリーニングを行うことを可能にする簡単な方法を提案しているため、ALSなどの神経変性疾患の潜在的な治療にまで及びます。ウイルス産生を開始するには、プラスミドトランスフェクションの前に、10cmの組織培養皿と10ミリリットルの細胞培養培地でHEK-293 T細胞を30〜40%のコンフルエンスで分割します。培養プレートを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、パッケージングプラスミドレンチウイルスベクター、1モル塩化カルシウム125マイクロリットルのDNAトランスフェクション溶液を調製し、蒸留水を加えて容量を500マイクロリットルに調整します。500マイクロリットルの0.05モルHEPSバッファーを静かに加え、室温で10分間インキュベートします。その後、HEK-293 T細胞培地を、1ミリリットルのDNAトランスフェクション溶液と混合した10ミリリットルの予熱した抗生物質を含まない新鮮培地と交換します。摂氏37度と5%二酸化炭素インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、細胞上清を新鮮な培地と交換し、再度一晩インキュベートします。最後に、翌日に上清を採取し、15ミリリットルのチューブに移します。死んだ細胞や破片を取り除くには、チューブを500 gで5分間遠心分離します。スーパーナテントをさらに精製するには、60ミリリットルの注射器を使用して0.45マイクロメートルのフィルターに通します。次に、ろ過した上清を直ちに300マイクロリットルの単回使用アリコートに分注します。形質導入のための細胞を準備するために、10%FBSを添加した2ミリリットルのDMAM中の6ウェル組織培養プレートで60%コンフルエンスで感染するように細胞を分割します。細胞を摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。翌日、冷凍レンチウイルスのアリコートを氷上で1アリコートずつ解凍します。その間、目的の細胞株に適合する血清を含む細胞培養培地を温めます。ウイルスが完全に解凍されたら、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブでDMEMで希釈します。次に、血清培地を減らして容量を1ミリリットルに調整します。.次に、培地1ミリリットルのウイルスに2マイクロリットルのポリブレンを加え、ピペッティングでよく混ぜます。この混合物を1ミリリットル細胞に加え、摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、ウイルスを含む培地を取り出し、10%FBSを補充した通常のDMEMと交換し、細胞をインキュベーターに戻します。細胞の成長をモニターし、2日ごとに培地を交換します 細胞が合流点に達したら、6ウェルディッシュの各ウェルを10cmの組織培養プレートに拡張します。プレートをインキュベーターに移動します。最後に、ウェルあたり10の1.5倍から4番目の細胞と50マイクロリットルのDMEMを384ウェルアッセイプレートに保存します。次に、YFPタグ付きタンパク質の発現レベルを顕微鏡で確認します。発現がS/N比が3以上であることを示した場合は、対応する細胞株の細胞ストックを調製します。化合物の移し替えには、384ウェル保存ポリプロピレンプレート上に、標準の1〜3希釈シリーズで化合物の段階希釈を加えます。次に、384キャピラリーヘッドを装備したリキッドハンドラーを使用して、0.25マイクロリットルのプロテアソーム阻害剤を空の平底の黒い384ウェルアッセイプレートに分配します。次に、これらのプレートの4番目のセルに1.5倍の10を播種します。摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。プロテアソーム阻害剤で処理した細胞株をイメージングする前に、予熱したDMEMを10マイクロリットル加え、染色溶液を加え、室温で10分間インキュベートします。染色後、顕微鏡タブを選択して自動顕微鏡操作ソフトウェアを起動します。まず、構成タブを選択し、次に正しいプレートタイプで20倍の目的を選択します。さまざまなプレートタイプで適切なフォーカスを可能にするには、発信者が対物レンズの正しい値に設定されていることを確認してください。次に、露出1を選択します。フォーカスの高さをゼロマイクロメートルに設定し、フォーカスを選択します。ピントが合ったら、カメラ1を露出します。露出面を最適化するには、フォーカスの高さを調整し、撮影高さをクリックします。露光時間とレーザー出力を最大ピクセル強度約3000に変更し、露光パラメータを保存します。[実験定義] タブを選択し、レイアウトとサブレイアウトを作成します。次に、関連するレイアウトの露出、参照画像、傾斜切り抜きファイル、およびサブレイアウトをドラッグアンドドロップします。次に、実験を保存します。最後に、自動実験タブを選択し、画像を取得します。2チャンネル画像の場合は、まずソフトウェアアルゴリズムを選択して、核、細胞質、凝集体などの主要なオブジェクトをセグメント化します。まず、100%DMSOまたはDMSOに溶解した0.25マイクロリットルのプロテアソーム阻害剤を384ウェル平底プレートに分配します。同じプレート上で、50マイクロリットルのDMEMにウェルあたり1.5倍から4番目の細胞に1.5倍を手動で播種します。次に、顕微鏡システムの環境制御ユニットを摂氏37度と二酸化炭素5%に設定します。顕微鏡を広視野蛍光モードで操作し、ソフトウェア設定として、LWDの20倍の対物レンズ非共焦点モード、ウェルあたり4つのフィールド、および1時間のキャプチャ間隔を選択します。次に、適切なアルゴリズムを選択して、サイトゾルや凝集体などの主要なオブジェクトをセグメント化します。必要に応じて、背景のしきい値とコントラストのパラメーターを調整します。SOD-1野生型およびSOD-1 A4V変異体で形質導入した試験細胞株は、健康なままで、高い発現レベルを示し、SOD型に関係なく長期にわたる広範なファイ標識を示しました。プロテアソーム阻害剤ALLNによる24時間の治療により、HEK-293細胞におけるSOD-1 A4V YFP凝集体の蓄積が促進されましたが、SOD-1野生型YFP形質導入細胞では促進されませんでした。さらに、同じベクターで形質導入したU2 OSおよびSH-SY5Y細胞株SOD-1 A4V YFPでは、凝集レベルが非常に低かった。ALLNの存在下または非存在下で細胞を播種した後、凝集体形成について50時間モニターしました。ALLN凝集体の形成は24時間でプラトーに達し、次の12時間にわたって安定していました。さらに、ALLNの細胞傷害効果の結果として、細胞密度は28時間後に有意に減少しましたが、DMSO処理されたネガティブコントロールでは細胞数が増加しました。SOD-1 A4V YFP細胞をプロテアソーム阻害剤の存在下で24時間培養し、Hoechst溶液で染色しました。3つの異なるプロテアソーム阻害剤の相対毒性は、Hoechst色素で標識されたウェルに残っている接着細胞株の数を測定することによって定量化されました。総細胞数は、プロテアーゼ阻害剤の用量増加に応答して減少しました。逆に、SOD-1 A4V凝集体を発現する細胞の割合は、プロテアーゼ阻害剤の濃度とともに増加しました。このプロセスを行う際には、細胞の品質が結果に大きく影響することを覚えておくことが重要です。したがって、細胞がマイクロプラズマを含まず、ステップ全体で健康であることを確認することが重要です。このプロセスに続いて、共鳴エネルギー移動を用いたタンパク質の分解またはタンパク質と他のタンパク質との相互作用に関する追加の疑問に答えるために、別のイメージング方法を使用することができる。このビデオを見れば、ハイコンテント画像解析を使用して複数の生細胞のタンパク質の運命を試験するツールを生成する方法について十分に理解できるはずです。したがって、この方法は、単純な細胞モデルで発生するタンパク質凝集に関する洞察を提供できます。また、患者特異的な人工多能性幹細胞から分化したニューロンなどの他のシステムにも適用できます。

assay-development-for-high-content-quantification-sod1-mutant-protein

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JoVE Journal

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神経科学

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Protein Aggregate Formation Assay:プロテアソーム阻害剤による誘導時に培養細胞内のタンパク質凝集を検出および定量する方法

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ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

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遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

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学ぶSOD1タンパク質凝集の高コンテンツ定量法。HEK-293細胞を用いたレンチウイルス導入と自動共焦点イメージングにより、神経変性疾患における低分子化合物の効果を時系列・用量依存的に評価する手法を確立します。

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

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