Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

この実験の全体的な目標は、時間と用量に依存する方法でミスフォールドタンパク質の凝集を調節する小分子の影響を研究するためのアッセイを開発することです。この方法は、細胞アッセイの開発における重要な疑問に答えるのに役立ち、ハイコンテントスクリーニング技術に利用されています。この手法の主な利点は、いくつかの神経変性疾患で発生するタンパク質凝集を検出および定量化する簡単な方法を提供することです。

この技術の意味は、細胞アッセイを開発し、低分子モデレーターのスクリーニングを行うことを可能にする簡単な方法を提案しているため、ALSなどの神経変性疾患の潜在的な治療にまで及びます。ウイルス産生を開始するには、プラスミドトランスフェクションの前に、10cmの組織培養皿と10ミリリットルの細胞培養培地でHEK-293 T細胞を30〜40%のコンフルエンスで分割します。培養プレートを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、パッケージングプラスミドレンチウイルスベクター、1モル塩化カルシウム125マイクロリットルのDNAトランスフェクション溶液を調製し、蒸留水を加えて容量を500マイクロリットルに調整します。500マイクロリットルの0.05モルHEPSバッファーを静かに加え、室温で10分間インキュベートします。その後、HEK-293 T細胞培地を、1ミリリットルのDNAトランスフェクション溶液と混合した10ミリリットルの予熱した抗生物質を含まない新鮮培地と交換します。

摂氏37度と5%二酸化炭素インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、細胞上清を新鮮な培地と交換し、再度一晩インキュベートします。最後に、翌日に上清を採取し、15ミリリットルのチューブに移します。

死んだ細胞や破片を取り除くには、チューブを500 gで5分間遠心分離します。スーパーナテントをさらに精製するには、60ミリリットルの注射器を使用して0.45マイクロメートルのフィルターに通します。次に、ろ過した上清を直ちに300マイクロリットルの単回使用アリコートに分注します。

形質導入のための細胞を準備するために、10%FBSを添加した2ミリリットルのDMAM中の6ウェル組織培養プレートで60%コンフルエンスで感染するように細胞を分割します。細胞を摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。翌日、冷凍レンチウイルスのアリコートを氷上で1アリコートずつ解凍します。

その間、目的の細胞株に適合する血清を含む細胞培養培地を温めます。ウイルスが完全に解凍されたら、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブでDMEMで希釈します。次に、血清培地を減らして容量を1ミリリットルに調整します。.

次に、培地1ミリリットルのウイルスに2マイクロリットルのポリブレンを加え、ピペッティングでよく混ぜます。この混合物を1ミリリットル細胞に加え、摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、ウイルスを含む培地を取り出し、10%FBSを補充した通常のDMEMと交換し、細胞をインキュベーターに戻します。

細胞の成長をモニターし、2日ごとに培地を交換します 細胞が合流点に達したら、6ウェルディッシュの各ウェルを10cmの組織培養プレートに拡張します。プレートをインキュベーターに移動します。最後に、ウェルあたり10の1.5倍から4番目の細胞と50マイクロリットルのDMEMを384ウェルアッセイプレートに保存します。

次に、YFPタグ付きタンパク質の発現レベルを顕微鏡で確認します。発現がS/N比が3以上であることを示した場合は、対応する細胞株の細胞ストックを調製します。化合物の移し替えには、384ウェル保存ポリプロピレンプレート上に、標準の1〜3希釈シリーズで化合物の段階希釈を加えます。

次に、384キャピラリーヘッドを装備したリキッドハンドラーを使用して、0.25マイクロリットルのプロテアソーム阻害剤を空の平底の黒い384ウェルアッセイプレートに分配します。次に、これらのプレートの4番目のセルに1.5倍の10を播種します。摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。

プロテアソーム阻害剤で処理した細胞株をイメージングする前に、予熱したDMEMを10マイクロリットル加え、染色溶液を加え、室温で10分間インキュベートします。染色後、顕微鏡タブを選択して自動顕微鏡操作ソフトウェアを起動します。まず、構成タブを選択し、次に正しいプレートタイプで20倍の目的を選択します。

さまざまなプレートタイプで適切なフォーカスを可能にするには、発信者が対物レンズの正しい値に設定されていることを確認してください。次に、露出1を選択します。フォーカスの高さをゼロマイクロメートルに設定し、フォーカスを選択します。

ピントが合ったら、カメラ1を露出します。露出面を最適化するには、フォーカスの高さを調整し、撮影高さをクリックします。露光時間とレーザー出力を最大ピクセル強度約3000に変更し、露光パラメータを保存します。

[実験定義] タブを選択し、レイアウトとサブレイアウトを作成します。次に、関連するレイアウトの露出、参照画像、傾斜切り抜きファイル、およびサブレイアウトをドラッグアンドドロップします。次に、実験を保存します。

最後に、自動実験タブを選択し、画像を取得します。2チャンネル画像の場合は、まずソフトウェアアルゴリズムを選択して、核、細胞質、凝集体などの主要なオブジェクトをセグメント化します。まず、100%DMSOまたはDMSOに溶解した0.25マイクロリットルのプロテアソーム阻害剤を384ウェル平底プレートに分配します。

同じプレート上で、50マイクロリットルのDMEMにウェルあたり1.5倍から4番目の細胞に1.5倍を手動で播種します。次に、顕微鏡システムの環境制御ユニットを摂氏37度と二酸化炭素5%に設定します。顕微鏡を広視野蛍光モードで操作し、ソフトウェア設定として、LWDの20倍の対物レンズ非共焦点モード、ウェルあたり4つのフィールド、および1時間のキャプチャ間隔を選択します。

次に、適切なアルゴリズムを選択して、サイトゾルや凝集体などの主要なオブジェクトをセグメント化します。必要に応じて、背景のしきい値とコントラストのパラメーターを調整します。SOD-1野生型およびSOD-1 A4V変異体で形質導入した試験細胞株は、健康なままで、高い発現レベルを示し、SOD型に関係なく長期にわたる広範なファイ標識を示しました。

プロテアソーム阻害剤ALLNによる24時間の治療により、HEK-293細胞におけるSOD-1 A4V YFP凝集体の蓄積が促進されましたが、SOD-1野生型YFP形質導入細胞では促進されませんでした。さらに、同じベクターで形質導入したU2 OSおよびSH-SY5Y細胞株SOD-1 A4V YFPでは、凝集レベルが非常に低かった。ALLNの存在下または非存在下で細胞を播種した後、凝集体形成について50時間モニターしました。

ALLN凝集体の形成は24時間でプラトーに達し、次の12時間にわたって安定していました。さらに、ALLNの細胞傷害効果の結果として、細胞密度は28時間後に有意に減少しましたが、DMSO処理されたネガティブコントロールでは細胞数が増加しました。SOD-1 A4V YFP細胞をプロテアソーム阻害剤の存在下で24時間培養し、Hoechst溶液で染色しました。

3つの異なるプロテアソーム阻害剤の相対毒性は、Hoechst色素で標識されたウェルに残っている接着細胞株の数を測定することによって定量化されました。総細胞数は、プロテアーゼ阻害剤の用量増加に応答して減少しました。逆に、SOD-1 A4V凝集体を発現する細胞の割合は、プロテアーゼ阻害剤の濃度とともに増加しました。

このプロセスを行う際には、細胞の品質が結果に大きく影響することを覚えておくことが重要です。したがって、細胞がマイクロプラズマを含まず、ステップ全体で健康であることを確認することが重要です。このプロセスに続いて、共鳴エネルギー移動を用いたタンパク質の分解またはタンパク質と他のタンパク質との相互作用に関する追加の疑問に答えるために、別のイメージング方法を使用することができる。

このビデオを見れば、ハイコンテント画像解析を使用して複数の生細胞のタンパク質の運命を試験するツールを生成する方法について十分に理解できるはずです。したがって、この方法は、単純な細胞モデルで発生するタンパク質凝集に関する洞察を提供できます。また、患者特異的な人工多能性幹細胞から分化したニューロンなどの他のシステムにも適用できます。