ヒトの過剰発現と精製シス - プレニルトランスフェラーゼ大腸菌

このプロトコルの全体的な目標は、非変性条件下でコドン最適化ヒトcis-プレニルトランスフェラーゼを過剰発現および精製し、その酵素活性をアッセイすることです。この手順は、真核生物の長鎖シス-プレニルトランスフェラーゼデヒドロドリチル二リン酸合成酵素、またはDHDDSで実証されています。この方法は、イソプレノイド合成の理解を深め、DHDDSの変異に関連する網膜色素変性症の病態生理学的メカニズムに関する重要な洞察を提供することができます。

この手法の主な利点は、シンプルで費用対効果が高く、時間を節約できることです。また、他のシス-プレニルトランスフェラーゼタンパク質の大量生産にも一般化できます。この手順は、テキストプロトコルで説明されているように、ヒトDHDDSの発現をクローニングすることから始めます。

バッファーA、DNase Iの1ミリリットルあたり1マイクログラム、およびプロテアーゼ阻害剤混合物に細胞を再懸濁します。次に、ガラステフロンホモジナイザーを使用して再懸濁した細胞を均質化します。マイクロフルイダイザーまたは同等のものを使用して、12, 000〜15, 000 psiで細胞を破壊します。

次に、細胞溶解物を40,000回gで45分間摂氏4度で遠心分離する。可溶性画分を含む上清を回収します。上清を、10 ミリモルのイミダゾールを含む5〜10 mmのコバルト固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムにロードします。

高速タンパク質液体クロマトグラフィー装置にロードした後、バッファーAの10ミリモルイミダゾールでカラムを徹底的に洗浄し、非特異的タンパク質の結合を減らします。FPLCプログラムを開始します。過剰発現したタンパク質を、250ミリモルのイミダゾールを添加したバッファーAで溶出します。

溶出後、バッファーAで平衡化した53ミリリットルの分取脱塩カラムを使用してイミダゾールを除去し、溶出したタンパク質にヘキサヒスチジンタグ付きTEVプロテアーゼを添加して、ヘキサヒスチジンタグ付きチオレドキシンDHDDS融合液を除去します。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、切断したタンパク質を、5ミリモルイミダゾールを添加したバッファーAで平衡化したコバルト固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムにロードします。

フロースルーを収集して、切断されたヘキサヒスチジンタグ付きチオレドキシンとTEVプロテアーゼを除去します。30キロダルトンの分子量カットオフ遠心フィルターを使用して、フロースルーを3〜4ミリリットルに集中させます。次に、濃縮タンパク質をバッファーAで平衡化したSuperdex 200サイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードし、最終精製します。

サンプルをフラクションコレクターの96ウェルラックに入れます。タンパク質は二量体として溶出します。溶出プロファイルをカラム検量線と比較することにより、関連する画分を選択します。

この時点で、SDS-PAGEを使用して調製物の純度を評価します。最後に、下流の実験に必要なタンパク質濃度を決定し、精製した濃縮タンパク質の液体窒素中のアリコートを急速凍結します。アリコートは使用するまでマイナス80°Cで保管してください。

タンパク質が凍結融解サイクルに耐える能力を確保するために、凍結タンパク質のアリコートを解凍します。アリコートを21, 000倍gで10分間遠心分離し、不溶性凝集体を除去します。遠心分離後、上清を回収します。

次に、超高速液体クロマトグラフィーシステムを使用して、TNXBで事前に平衡化したSuperdex 200分析カラムにタンパク質をロードします。トリプトファン蛍光をモニターして、タンパク質の溶出プロファイルを検出します。分子量評価のための有効な検量線があり、SECカラムメーカーから入手

精製されたタンパク質の活性を確保するには、まず、精製されたDHDDSの5マイクロモルを10マイクロモルのFPPおよび50マイクロモルのC14 IPPと混合します。バッファーAで0.5ミリモルの塩化マグネシウムと摂氏22〜30度の反応を開始します。反応の即時クエンチング後、ゼロ、2、4、および6時間で15マイクロリットルのサンプルを反応から引き出し、20ミリモルEDTAを添加したバッファーAを15マイクロリットル追加します。

次に、水飽和1-ブタノールを1ミリリットル加え、十分にボルテックスして反応生成物を抽出します。ここでプロトコールを停止し、サンプルを後で読むために保持することができます。次に、シンチレーションカクテルをサンプルに加えます。

シンチレーションカウンターを使用して、C14を含むブタノール相の反応生成物と、反応の15マイクロリットルの放射能(総放射能を表す)を定量します。最後に、C14 IPP 濃度の合計から利用率を計算し、その結果を時間の関数としてプロットすることにより、各時点における C14 IPP の正味取り込みを計算します。正味のC14 IPPの組み込みは、時間とともに増加すると予想されます。

各精製ステップで得られたサンプルをここに示します。このSDS-PAGE解析では、DHDDSを段階的に精製し、高度に精製した製品が得られていることが示されています。このクロマトグラムは、精製された酵素のサイズ排除クロマトグラフィーの分析結果を表しており、タンパク質がホモ二量体としてのみ観察されることを明らかにしています。

ここで、矢印はボイドボリュームを示しています。代表的な時間依存性活性アッセイにより、C14 IPPの取り込みは6時間にわたって明確に上昇することが明らかになり、精製された酵素が機能していることが確認されました。この簡単な調製をマスターすれば、2〜3日で完了し、高純度で活性の高い酵素が得られます。

このビデオを見た後、大腸菌からヒトシスプレニルトランスフェラーゼを過剰発現および精製する方法と、その活性を時間依存的に測定する方法について十分に理解しているはずです。