Name: レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学ぶ、ハイスループットトランスポゾン配列法を用いてレプトスピラ変異体の適応度を測定する方法。ハムスター感染モデルで病原性遺伝子を同定し、少数の動物で多数の変異体をスクリーニングできます。

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この作業にベテラン事務功労賞 (D.A.H.) に支えられ、国立衛生研究所 (D.A.H.) に R01 AI 034431 を付与します。

<ol><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li>
<li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+leptospirosis%3A+the+influence+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li>
<li>Marcsisin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+high-throughput+screen+to+identify+Leptospira+mutants+unable+to+colonize+the+carrier+host+or+cause+disease+in+the+acute+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection.</a> J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn-seq%2C+a+high-throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+barriers+to+Borrelia+burgdorferi+dissemination+during+infection+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing.</a> Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).</li>
<li>Wunder, E. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li>
<li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li>
<li>Coutinho, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Leptospira+interrogans+infection+in+hamsters+after+intradermal+and+subcutaneous+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307(2014).</li>
<li>Athanazio, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rattus+norvegicus+as+a+model+for+persistent+renal+colonization+by+pathogenic+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.</a> Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).</li>
<li>Ratet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+bioluminescent+Leptospira+interrogans+in+mice+reveals+renal+colonization+as+a+stealth+escape+from+the+blood+defenses+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359(2014).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+virulence+factors+required+for+respiratory+melioidosis+using+Tn-seq+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods Mol Biol. 859, (2012).</li>
<li>Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+between+Escherichia+coli+and+Leptospira+spp.+as+a+new+genetic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).</li>
<li>Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+parallel+sequencing+to+measure+fitness+of+Leptospira+interrogans+transposon+insertion+mutants+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117(2016).</li>
<li>Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+of+Leptospirapomona+and+growth+of+13+other+serotypes%3A+Fractionation+of+oleic+albumin+complex+and+a+medium+of+bovine+albumin+and+polysorbate+80%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80.</a> Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).</li>
<li>Johnson, R. C., Harris, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pathogenic+and+saprophytic+letospires.+I.+Growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li>
<li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+%28IncW%29+and+RP4+plasmid+%28IncPa%29+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li>
<li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScope%3A+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Database+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021(2009).</li>
<li>Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+microbial+fitness+determinants+by+insertion+sequencing+using+genome-wide+transposon+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries.</a> Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).</li>
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<li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%3A+disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. 12, 2(2006).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), R86(2010).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+web-based+genome+analysis+tool+for+experimentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists.</a> Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).</li>
<li>McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGenTA%3B+a+Galaxy+implemented+tool+for+complete+Tn-Seq+analysis+and+data+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization.</a> Bioinformatics. , 1367(2017).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fitness+landscapes+of+Vibrio+cholerae+at+important+stages+of+its+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003800(2013).</li>
<li>Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+markers+for+genetic+manipulations+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Pappas, C. J., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+in+Leptospira+spp.+by+Transcription+activator-like+effectors+demonstrates+a+potential+role+for+LigA+and+LigB+in+Leptospira+interrogans+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).</li>
<li>Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+gene+loss+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Selection-driven gene loss in bacteria.</a> PLoS Genet. 8 (6), e1002787(2012).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tn-seq+analysis+of+carbohydrate+utilization+and+vertebrate+infectivity+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).</li>
<li>Ramsey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+genetic+screen+identifies+previously+uncharacterized+Borrelia+burgdorferi+genes+important+for+resistance+against+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species.</a> PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225(2017).</li>
</ol>

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Tn シーケンスによって突然変異体のより大きいプールを検査することを見込んでこの腹腔内 42 l. カバー変異挑戦のハムスターのためのパイロット実験からの結果は17を提示されて、しかしながらの頻度が低いので (100-200 しかしながら/交配)、いくつかの交配が大型の Tn Seq 実験の突然変異体の十分な数を生成する必要。液体培養変異体の大規模な数の維持の対処しなければならない物流の課題を提示します。文化は深い 96 ウェル プレートで培養することができます。420 に設定分光光度計の光学密度測定値によって文化の密度を監視できる nm。使用する動物の数の決定入力プールのサイズに依存し、パワー解析によって決定する必要があります。大規模な実験、生物統計学者との協議で電力解析を実行することをお勧めします。
ボトルネックは出力プールからランダムな突然変異体の回復に影響を与えます。私たちのパイロット研究17 (図 7...

遺伝学的ツールが利用可能な限られた数のため、レプトスピラなどのいくつかの細菌の病原性遺伝子の同定は難しい。一般的に使用される方法の 1 つは、各変異株における挿入部位の同定と病原性の動物モデルにおける個々 のトランスポゾン変異体のテストが続くランダムなトランスポゾン変異による変異体のコレクションの作成です。この方法は時間のかかる、高価なと多数の動物が必要です。
ランダム突然変異誘発はレプトスピラ病原体の開発当初、病原性に関与する遺伝子は動物モデル1に個々 の変異をテストによって識別されました。変異体は、その潜在的なシグナル伝達における役割または運動または予測外膜面の位置などの条件に基づいて選ばれました。レプトスピラの大半として遺伝子の未知関数2仮説蛋白質を符号化、選択する突然変異体は、これら条件制限に基づいて小説レプトスピラ病原性遺伝子を発見する能力。
最近では、 l. カバートランスポゾン変異体のプールは、ハムスターやマウスのモデル3の感染性の上映。各動物は、最大 10 の突然変異体のプールに挑戦しました。変異株の感染性は、それが血液や腎臓から得られる文化の PCR による検出された場合肯定的な得点されました。プールで各変異体の個々 の PCR 反応を必要とするため、PCR 検査は手間がかかっていました。文化各突然変異系統の周波数は定量化されていませんので、アプローチは高度弱毒化変異体の同定への試み偏っていた。
トランスポゾンの病原性遺伝子のスクリーニングより効率的にするための戦略として (Tn Seq) 手法をシーケンス処理について述べる.Tn seq は、大規模な並列シーケンス4,5,6続いてトランスポゾン変異による変異体のライブラリの作成で構成されます。簡単に言えば、トランスポゾン変異体がプール、動物に接種、さまざまな器官 (出力プール) が治った後。出力プールから DNA は抽出し、制限の酵素と消化されるか sonication によってせん断。PCR トランスポゾン挿入サイトの接合部の 2 つのラウンドが行われます。この手順は、シーケンスに必要なアダプターを追加をできます。結果として得られる PCR の製品は、各変異体変異体のプールの初期の組成と比較しての相対的な豊かさと共にプールのトランスポゾン挿入サイトを識別する高スループット シーケンスによって分析されます。
このアプローチの主な利点は、同時に数匹の動物の突然変異体の数が多いを選別する能力です。Tn Seq は新しいレプトスピラを発見のチャンスを高めるトランスポゾン挿入サイトの事前の知識を必要としない-より少ない時間と効率と病原性に関与する特定の遺伝子。致命的な影響を受けやすい感染組織におけるレプトスピラ負担が比較的高いため齧歯動物のモデル (通常 104 108細菌/g の組織に)7,8,9同様貯水池ホストのように10,11, 文化、生体外で成長に伴うバイアスを軽減することがなく直接組織を分析できます。
Tn Seq 日付に記載されているほとんどの細菌性病原体の研究で挿入の高周波はまとめて持つすべての遺伝子4 内の複数の密接に間隔トランスポゾン挿入変異体を含む大規模なプールで感染を許可 ,12,13,14。突然変異誘発頻度、程度の低い6細菌の Tn Seq も開発しました。レプトスピラとトランスポゾン変異体のライブラリは Slamtiら15のとおり活用によって子実プラスミド上のトランスポゾンを導入することで生成できます。しかし、 l. カバーのトランスポゾン誘発突然変異の頻度は低いです。受信者ごとの 10-8 x のみ 8.5 l. カバー16ライ株細胞とになりそうです transconjugant 周波数が報告されたHimar1トランスポゾンが接合性プラスミドを導入された、L. カバーの他のほとんどの株と同様に悪い。ここで説明されているプロトコルに基づいてボレリアブルグドルフェリ、トランスポゾン挿入変異の頻度が低い6ではまたのために開発される部分です。
と共に、低ひずみでトランスポゾン挿入変異体を分離することで他のグループの成功のためにl ・ カバー型 Manilae ひずみ L495 とトランスポゾン変異を実施しましたプロトコル17パイロット実験LD50 (致命的な線量) 病原性1。Tn Seq による 42 変異体をスクリーニングし、いくつかの突然変異体候補候補アデニル酸シクラーゼ遺伝子の 2 つの挿入を含む病原性の欠陥を識別しました。ハムスターの 2 つの突然変異体の個々 のテスト彼らは病原性17の欠乏だったことを確認しました。

<table><tbody><tr><td>Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>2,6-ジアミノピメリック酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン二塩酸塩五水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 顕微鏡、暗視野コンデンサー付き</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy血液および組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR精製</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>モデル505 ソニックディスクレーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2.5インチカップホーン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>ビーズラプター24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Step 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Terminal deoxynucleotidyl transferase</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Master mix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Preparation of genomic libraries, step 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>トランスポゾン挿入部位の同定、ステップ1.2。</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProducts</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>ステップ 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>ステップ 3.6.</td></tr><tr><td>Qubitアッセイチューブの</td><td>寿命技術</td><td>Q32856</td><td>ステップ3.6。</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス No10</td><td>フェザー</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック K2 EDTA 2 ml チューブ</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ U-100 26G x &frac12;&rdquo;ニードル</td><td>BDバキュテナー</td><td>329652</td><td>IPチャレンジ、ステップ2.2.1。</td></tr><tr><td>3 mL Luer-Lokチップシリンジ</td><td>BDバキュテイナー</td><td>309657</td><td>心臓穿刺、ステップ2.4.2。</td></tr><tr><td>25G X 5/8 "針</td><td>BDバキュテイナー</td><td>305901</td><td>心臓穿刺、ステップ2.4.2。</td></tr><tr><td>ストッパー付き25mmフリットガラスベース</td><td>EMDミリポア</td><td>XX1002502</td><td>ろ過ユニットシステム、ステップ1.1.7。</td></tr><tr><td>25 mmアルミニウム製スプリングクランプ</td><td>EMDミリポア</td><td>XX1002503</td><td>ろ過ユニットシステム、ステップ1.1.7。</td></tr><tr><td>15 mlホウケイ酸ガラス漏斗</td><td>EMDミリポア</td><td>XX1002514</td><td>ろ過ユニットシステム、ステップ1.1.7。</td></tr><tr><td>125 mlサイドアーム三角フラスコ</td><td>EMDミリポア</td><td>XX1002505</td><td>ろ過ユニットシステム、ステップ1.1.7。</td></tr><tr><td>アセテートセルロースフィルター VVPP (細孔径 0.1 mm; 直径 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

本稿では,レプトスピラ変異ゴールデン ハムスター感染中フィットネスに変更の定量化 (Tn Seq) 手法をシーケンス トランスポゾンをについて説明します。Tn Seq は高スループット シーケンス技術の力とランダムなトランスポゾン変異を兼ね備えています。動物は収穫血液と組織の数日後、各器官 (出力プール) の突然変異体の数を定量化することによって続いてトランスポゾン変異体 (入力プール) のプールに立ち向かっています。出力のプールは、各変異体の生体内で適性を評価する入力のプールと比較されます。このアプローチにより、動物の限られた数の突然変異体の大規模なプールのスクリーニングです。マイナーな変更とレプトスピラ症の動物モデル、ラットなど貯留層ホスト モデルとの in vitro研究と同様、ハムスターなどの急性感染症モデルでこのプロトコルを実行できます。Tn Seq は、体内と体外のフィットネス欠陥を持つ突然変異体の画面に強力なツールを提供します。

活用によるl. カバーのトランスポゾン変異体のライブラリの作成では、図 1に示すように、ろ過装置が必要です。我々 はそれぞれの交配から 100-200 しかしながらを回復しました。
トランスポゾン挿入部位、各突然変異体におけるトランスポゾンの終わりをターゲットとする半ランダムな PCR によって生成された PCR の製品のシーケンスによって識別され、隣接するホスト系列15 (図 2 a)。半ランダムな PCR の結果の例を図 2 bに示します。ほとんどの場合 2 番目のラウンドのための PCR とタグ TnkN1 の最初のラウンドの Deg1、Tnk1 のプライマーを使用するとき支配的な増幅が観測されます。しか...

ここで高スループット シーケンス ハムスターの挑戦後トランスポゾン レプトスピラ突然変異体組織の定量化とトランスポゾン変異を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、生存と動物の普及のため画面変異体に使え、生体外で研究にも適用することができます。

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

このハイスループットトランスポゾンシーケンシング技術の全体的な目標は、in vivoおよびin vitroの適応度欠損を持つトランスポゾン変異体を同定および定量し、それによって病原性に関与するレプトスピラ遺伝子を同定することです。この方法は、宿主の細菌のコロニー形成、播種、生存に関与する遺伝子の特定など、レプトスピラ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、限られた数の動物で多数の変異体をスクリーニングできることです。この方法は、急性レプトスピラ症のハムスターモデルにおけるレプトスピラ・インターロガンズ変異体の適応度を調べるために設計されましたが、慢性感染モデル、in vitro研究、およびレプトスピラの他の株を通じても適用できます。手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるKritel LourdaultとKaren Evangelistaです。まず、ろ過ユニットを組み立てます。ベースを125ミリリットルのサイドアームErlenmeyerフラスコに置きます。アセテートセルロースフィルターをベースに置き、ファンネルをベースに固定します。ろ過ユニットを真空システムに接続します。次に、5ミリリットルのレプトスピラ培養物と0.5ミリリットルの大腸菌培養物を漏斗に加えます。真空をオンにして溶液をろ過します。次に、バクテリア側を上にしてフィルターをEMJHプレートに置き、DAPを補充します。プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。翌日、フィルターを1ミリリットルのEMJHを含む15ミリリットルのチューブに移し、チューブを10秒間ボルテックスして懸濁液中の細菌を放出します。次に、懸濁液を5枚のEMJHプレートに広げ、ガラスビーズまたはスプレッダーを使用してカナマイシンを補充します。プレートをパラフィルムで包み、コロニーが見えるまで摂氏30度で逆さまにインキュベートします。コロニーが見えるようになったら、それらを個々に収集し、カナマイシンを含む3ミリリットルのEMJHに移します。次に、チューブを摂氏30度で150rpmの攪拌で7〜10日間、または1ミリリットルあたり1億個の細胞の密度でインキュベートします。トランスポゾン挿入部位を同定するには、ネストされたPCRを実施します。まず、最初のPCR用のミックスを準備します。次に、培養物からのサンプルをPCRミックスに加えます。最初の反応を実行した後、2番目のPCR用の混合物を調製します。最初のPCRから2マイクロリットルのPCR産物を加えて、反応混合物を完成させます。PCRを実行した後、アガロースゲルで製品を調べます。次に、製品のシーケンシングを行い、トランスポゾン挿入部位を決定します。動物実験を開始するには、まずEMJHで個々の変異体を増殖させ、カナマイシンを補充します。次に、暗視野顕微鏡を使

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。...

の世代エンテロバクターエスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。...

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。...

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

クラスター化の前核 (PN) 注射は定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) を空間、CRISPR 関連タンパク質 9 ヌクレアーゼ (CRISPR/Cas9) システムは非常に効率的な遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの製造方法。ここで、遺伝子ノックアウト ハムスター CRISPR/Cas9 システムの生産のための詳細な PN...

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産

細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。...

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

シーケンシング(RH-seq)を介した相互異形性は、種間の形質の違いの遺伝的基礎をマッピングする強力な新しい方法である。ヘミジゴットのプールはトランスポゾン変異によって生成され、その適合性は、高いシーケンシングを使用して競争力のある成長を通じて追跡されます。得られたデータの分析は、形質の基礎となる遺伝子を特定します。...

ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体...

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

ここで、 レプトスピラ 種における特異的遺伝子サイレンシングに対するCRISPR干渉(CRISPRi)の適用について説明する。 レプトスピラ 細胞は、dCas9(触媒的に「死んだ」Cas9)とシングルガイドRNA(sgRNA)を発現するプラスミドとの共役によって形質転換され、所望のゲノム標的への塩基対合を担う。遺伝子サイレンシングを検証する方法を紹介します。...

レプトスピラの病原性種におけるCRISPR干渉(CRISPRi)の遺伝子サイレンシングへの応用

これは、 バークホルデリア 有益な共生者における候補昆虫コロニー形成因子を同定するための適応的方法である。このカブトムシ宿主はトランスポゾン変異生成を介して生成されたランダム変異体ライブラリーに感染し、コロニー形成後のライブラリーの複雑さは 、インビトロで増殖した対照と比較される。...

ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

ここでは、腹腔内(IP)または歯肉内(IG)を介して L.infantum-Lucに感染したゴールデンハムスターの縦断的評価を、生物発光イメージングとPCRによって紹介します。ハムスターは、感染の1日後(1 dpi)、感染の1週間後(8 dpi)、および感染の3週間後(22 dpi)に評価され、50dpi...

インビボ ルシフェラーゼを発現するAxenic Amastigotesの歯肉接種による Leishmania乳児感染ハムスターのイメージング

このプロトコルは、結晶バイオレットバイオマスアッセイ、タイムラプス位相コントラスト動態、共焦点3D/マトリックスマッピング、SEM超微細構造、 生体内 ハムスター感染モジュールを組み合わせたモジュール型BSL-2ワークフローを提供し、 レプトスピラ...

レプトスピラバイオフィルムの定量的、構造的、機能的分析のためのモジュール式ワークフロー

学ぶ、ハイスループットトランスポゾン配列法を用いてレプトスピラ変異体の適応度を測定する方法。ハムスター感染モデルで病原性遺伝子を同定し、少数の動物で多数の変異体をスクリーニングできます。

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

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