コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

この実験の全体的な目標は、コメットアッセイとも呼ばれるシングルセル電気泳動アッセイを使用して、がん細胞における遺伝毒性物質の有効性を調査することです。この手順は、4つの遺伝毒性学的研究を測定する感覚です。また、初期の薬剤候補の選択やDNA損傷と修復の基礎研究など、さまざまな評価にも適用できます。

この手法は、DNA損傷を定量的に評価する直接的な方法を提供します。また、効率的で、実行が容易で、比較的安価です。スライドコーティング用のアガロースを準備するには、1%のアガロースを電子レンジで2〜3分間、またはアガロースが完全に溶けるまで溶かします。

ガラス顕微鏡スライドをアガロースに浸し、糸くずの出ないワイプを使用してスライドの片側を拭きます。スライドを平らな面に置き、風乾させます。乾燥後に透明なアガロース膜を形成する必要があります。

コーティングされたスライドを摂氏37度に置いてから使用してください。化学療法の治療効果は、10%FBS、ペニシリン1ミリリットルあたり100単位、ストレプトマイシン1ミリリットルあたり10マイクログラムを添加したDMEM/ハムF-12培地で培養したU251神経膠腫細胞で評価されます。1ミリリットルのトリプシンを使用して細胞を3分間消化し、次にDMEM / Ham F-12培地とFBSを使用してトリプシンを中和します。

細胞を15ミリリットルのチューブに集めます。そして、Gの300倍で4分間回転します。媒体を吸引します。

そして、細胞を1×PBS中に1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の2倍で懸濁します。細胞は、アッセイを開始する直前に調製する必要があります。そして、それは暗闇の中で扱うべきです。

損傷を防ぐために、すべて薄暗い光の中で。細胞懸濁液を1パーセントの溶融低融点アガロースと1対10の体積比で組み合わせます。ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。

そしてすぐに30マイクロリットルをスライドにピペットで移します。ピペットチップのスライドを使用してアガロース混合物を広げ、薄い層の形成を確実にします。スライドを摂氏4度で平らに置き、暗闇の中で10分間置きます。

スライドを摂氏4度の溶解液に、暗闇で1時間から一晩浸します。アルカリコメットアッセイでは、スライドを溶解溶液から穏やかに取り出し、余分な液体を排出し、スライドをAESに静かに浸し、暗所で摂氏4度で1時間、DNAを巻き戻します。予冷したAESを電気泳動スライドトレイに加えます。

スライドから0.5センチメートルを超えないようにしてください。スライドを内側に置き、キャップで覆います。電源電圧を1ボルト/センチメートルに設定し、摂氏4度で30分間運転します。

電気泳動が完了したら、スライドから余分なAESを排出します。スライドを室温の蒸留水に2回、毎回5分間静かに浸します。その後、スライドを70%エタノールに室温で5分間静かに浸します。

中性コメットアッセイでは、スライドを溶解液から静かに取り出し、余分な液体を排出し、暗所で摂氏4度のNESに30分間静かに浸します。電気泳動スライドトレイに、スライドから0.5センチメートルを超えないように、事前に冷却したNESを追加します。スライドを内側に置き、キャップで覆います。

電源電圧を1ボルト/センチメートルに設定し、摂氏4度で45分間運転します。スライドから余分なバッファーを排出します。スライドをDNA沈殿液に室温で30分間静かに浸します。

30分後、スライドを室温で70%エタノールに30分間静かに浸します。この手順は、スライドを暗所で摂氏37度で10〜15分間乾燥させることから始めます。次に、各スライドの乾燥アガロースに50〜100マイクロリットルの緑色蛍光核酸染色溶液を載せ、暗所で室温で15分間染色します。

スライドを蒸留水で短時間すすぎ、暗闇の中で摂氏37度で完全に乾かします。彗星スライドを染色した直後に画像取得と解析を行います。スライドホルダー付きの蛍光顕微鏡の下にスライドを置きます。

10X対物レンズを選択し、アガロースゲルが対物レンズに面していることを確認します。染色された各彗星のスライドからランダムに画像をキャプチャします。エッジや気泡の周りを避けてください。

各彗星の尾が水平に分布していることを確認します。彗星の頭は左から、尾は右から発生する必要があります。各画像を、明るいDNA染色と暗い背景のバイナリ形式で保存します。

画像解析を行うには、まず、ツールバーの左側にあるSelect Files to Analyze(解析するファイルを選択)ボタンを使用して、すべての画像をCometアッセイソフトウェアにロードします。画像表示ウィンドウが表示されます。画面上に測定枠を描き、セルの彗星に合わせて大きさを調整します。

画像に従って、ヘッド、コメット、テールのしきい値を設定するには、[調整]をクリックします。次に、「測定の開始」をクリックします。フレームを使用して細胞を選択し、Assay the Cometボタンをクリックして測定をアクティブにします。

強度画像がプロファイルウィンドウに表示され、選択した測定パラメータが表示されます。「Store Results」ボタンをクリックして、結果を保存します。処理ごとに少なくとも50個の細胞を分析します。

アルカリ彗星アッセイと中性彗星アッセイの結果は、ドキソルビシン処理UT51細胞の彗星尾部が長く、DNA強度が高かったことを示しており、断片化されたDNAがかなり蓄積していることを示唆しています。アルカリ彗星または中性彗星アッセイの定量分析では、ドキソルビシン処理後に彗星の尾部形成が有意に増加したことが示され、DNA損傷が示されました。PARP阻害剤であるオラポリブとアルキル化剤であるテモゾロミドの併用療法は、神経膠腫細胞のDNA損傷を有意に増加させ、これは彗星尾シグナルの長さと強度の増加に反映されています。

オラポリブ単独では、DNA損傷を導入しませんでした。それがテモゾロミドの遺伝毒性効果を増強した場所。単回および併用治療下の神経膠腫細胞の代表的な画像は、テモゾロミドとオラポリブで治療された細胞の彗星尾部のより長く、より高強度であることを示しました。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば5時間で完了します。その開発後、この技術は、遺伝毒性の分野の研究者が多くの種類の核細胞のDNAストリング切断を測定するための道を開きました。培養細胞や生物から単離された細胞など。

このビデオを見れば、コメットアッセイを使用して単一細胞レベルで遺伝毒性物質の有効性を調査する方法について十分に理解できるはずです。損傷試薬の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。また、白衣や手袋の着用などの予防措置は、この手順を実行する際に常に講じる必要があります。