Name: コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶコメットアッセイによるがん細胞のDNA損傷評価法。アルカリ性と中性の両アッセイを用いて、化学療法薬の遺伝毒性効果を定量的に測定し、がん治療研究に応用する。

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この研究は、NIH、NCI、CCR の学内研究プログラムによって支えられました。すべての著者は、CCR、NCI、NIH から学内の研究助成金を受け取った。

1。 準備試薬 <ol><li>1x PBS <ol><li>900 mL dH 2 O 100 mL 10 x PBS を希釈し、pH メーターを使用して 7.4 に pH を調整します。室温で保管します</li>。
	</ol></li> <li>換散ソリューション (LS) <ol><li>2.5 M の NaCl、100 ミリメートル二ナトリウム EDTA、10 mM Tris ベース、および 200 mM NaOH 900 mL dH 2 O の準備; よく完全に溶解する混合物を許可するように約 20 分かかります。PH メーターを使用して 10 の pH を調整します。追加 1% ナトリウム ラウリル油脂肪酸サルコシンと 1% トリトン X-100 1,000 mL に最終的な音量を調整して。使用する前に、少なくとも 30 分のための 4 ° C に涼しい</li>。
	</ol></li> <li>アルカリ電気泳動ソリューション (AES)、pH &gt; 13 <ol><li>準備 200 mM NaOH と 1 mM ナトリウム EDTA 800 mL dH 2 O. 調整 pH と pH であることを確認してください &gt; 13。1,000 mL に最終的な音量を調整します。使用する前に新鮮なを確認し、使用する前に、少なくとも 30 分のための 4 ° C に冷却します</li>。
	</ol></li> <li>中立電気泳動 s sollution (ファミコン) <ol><li>氷酢酸と 100 mM 1,000 mL dH 2 O. 調整トリス酢酸ナトリウム ベースと 300 mM 9.0 pH を混合して準備 1,000 mL 中立電気泳動バッファー。使用する前に、少なくとも 30 分のための 4 ° C に涼しい</li>。
	</ol></li> <li>DNA の沈殿物の解決 (DPS) <ol><li>10 mL 7.5 M アンモニウム酢酸ストックの準備。DNA の沈殿物溶液の 50 mL 43.3 mL 95% エタノール 6.7 mL 7.5 M 酢酸アンモニウムを混在させます。室温で保管します</li>。
	</ol></li> <li>染色ソリューション <ol><li>追加 1 μ L 10,000 緑色蛍光核酸染色 (例えば、SYBR グリーン) 30 mL トリス EDTA バッファー (10 mM トリス-HCl、1 mM ナトリウム EDTA、pH 7.4) とストア x 4 ° c. の保護から光です</li>。
	</ol></li> <li>1% 低融点アガロース <ol><li>1% 低溶解点 agarose (100 mL dH 2 O で 1 g) 電子レンジで溶かします。旋回 agarose agarose が完全に溶融していることを確認するすべての 15-20 秒。使用する前に、少なくとも 20 分の 37 ° C の水浴の agarose を配置します</li>。
	</ol></li> <li>中古暖かいピペット チップ <ol><li>アガロースをピペッティングする前に 3 mm、37 ° C で暖かい P200 ピペット チップの狭い両端を切っています</li>。
	</ol></li></ol> 2。彗星のスライドを準備 <ol><li>コーティング スライド <ol><li>2 〜 3 分または agarose が完全に溶融するまで電子レンジで溶かす 1% アガロース (100 mL dH 2 O に 1 g)。Agarose にガラス顕微鏡スライドを浸し、糸くずのワイプを使用してスライドの 1 つの側面を拭く</li>。
		<li>は、空気乾燥または乾燥時間 50 ° C で熱を平らな面にスライドを置く; 乾燥後透明アガロース フィルムを形成する必要があります。使用する前に 37 ° C でコーティング スライドを配置します</li>。
	</ol></li> <li>単一細胞懸濁液の準備 <ol><li>文化と治療神経膠腫細胞 <ol><li></li><li> </li><li><li><li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li></ol><ol><li><li><li></li><li></li><li> <img alt="TM計算式,DNA解析,DNA損傷評価におけるテールモーメントの式" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> <img alt="OTM計算式;彗星アッセイにおけるDNA損傷解析のための方程式" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li><li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
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<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
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<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

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コメット ・ アッセイは、細胞レベルでの単一および二重鎖 DNA 切断を測定するための効率的なツールです。アッセイは、研究については遺伝毒性とバイオモニタ リング13基本病変、DNA クロスリンク、医薬品開発およびアルカリ敏感なサイトに至る「黄金の標準」として広く適用されています。本研究では、我々 はそれぞれアルカリ性と中性の彗星の試金のための 2 つの異なる手順プロトコルを示した。単一細胞電気泳動、蛍光顕微鏡と画像認識を組み合わせて、両方のアルカリ性と中性の彗星アッセイは、体外の損傷 DNA の程度を評価する定量的なアプローチを提供します。
いくつか重要な手順は、コメット ・ アッセイの実行が成功に不可欠です。たとえば、試薬調製の手順には注意が必要があります。各ソリューションをたて準備し、内因性 DNA 損傷を防止または修復サンプル準備の間に、使用する前に、少なくとも 30 分のための適切な温度で保たれる必要があります。もう一つの重要なステップは、実行可能な単一細胞懸濁液の準備です。彗星のスライドの準備の間の細胞生...

最初、1984 年は、中性条件1下核から断片を DNA の移行を示すことによっての Ostling と・ ジョハンソンによって開発コメット ・ アッセイが使用されました。テクニックは、シンら、アルカリ条件は、特異性と再現性アッセイ2に大幅に増加を示すによって後で開発されました。以来、中立コメットアッセイをほとんど使用して対し、アルカリ コメットアッセイは少量のシングルを含む、DNA 損傷に対してより敏感、二重鎖 DNA 切断、アルカリ不安定なサイト DNA DNA 二本鎖 DNA 切断を検出するか、Dna-タンパク質の架橋と不完全切除に関連付けられている DNA 一本鎖切断修復サイト3,4。両方試金断片化された DNA の可視化および DNA 損傷を定量的に評価する簡単な方法を提供できます。コメット ・ アッセイはin vitroとin vivo遺伝毒性学的研究法が機密とみなされ、初期医薬品候補の選択、環境モニタリング、人間バイオモニタ リングなど、様々 な研究分野に適用基礎 DNA 損傷研究し、5を修復します。
アッセイの原理は、電場下で断片化された DNA 核体 (「彗星頭」とも呼ばれる) のうちの移行、agarose のゲル (「彗星テール」とも呼ばれる) の DNA 汚れを形成します。ヌクレオチドは染色、この単一細胞の電気泳動によって形成された「彗星」を分析することによって DNA 損傷の程度を定量化することができます。テール モーメントの計算は、さまざまな実験的グループの間で DNA 損傷を比較するさらに助けることができます。DNA 損傷の検出の伝統的な方法と比較して、コメット ・ アッセイは直接、敏感な安価な比較的単純です。
放射線治療と化学療法は、癌治療のための一般的な戦略一本鎖の生成、二重鎖 DNA 染色体6に改します。DNA 修復阻害剤の最近の進歩の併用療法によりより効果的な遺伝毒性効果としたがって、貧血、感染症、骨髄抑制7,などの全身性の副作用が減る可能性があります。8します。 本研究で示したポリ (adp-リボース) ポリメラーゼ (PARP 阻害剤, olaparib (Ola)9の調査。PARP は豊富な核蛋白質である、10ポリ (adp-リボース) ポリマーを形成することにより DNA 塩基除去修復を担当。テモゾロミド (TMZ) は、経口投与可能なアルキル化剤で神経膠腫患者の治療に広く使用されています。DNA 損傷を定量化するコメット ・ アッセイを用いたテモゾロミドと深く olaparib を組み合わせて olaparib/テモゾロミド併用療法は神経膠腫の治療に効果的な戦略を提案する神経膠腫細胞における DNA 損傷を高めることを紹介します。テモゾロマイドだけで11と比較。

<table><tbody><tr><td><強>試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca++, Mg++フリー)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Sigma S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizmaベース</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>ラウリルサルコシン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td></td><td>Sigma 695092</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td></td><td>Sigma A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td><td>ス Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>strong<>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス組織スライド</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>企業情報</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microwave Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水平電気泳動</td><td>チャンバーTREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

コメットアッセイを用いた dna 損傷の in vitro評価

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA 損傷は、その寿命の間にセルごとに一般的な現象であるし、ゲノム DNA の化学構造の変化として定義されています。ラジオや化学療法などのがんの治療法は、癌の進行を抑える細胞周期停止やアポトーシスにつながる追加の DNA 損傷の膨大な量を紹介します。実験的ガン治療中に DNA 損傷の定量評価は、遺伝毒性エージェントの有効性を正当化するための重要なステップです。本研究では単一を定量化できますコメット試験として知られている単一細胞電気泳動アッセイに着目し、体外で二重鎖 DNA の区切り。コメット ・ アッセイは、効率的かつ容易に行える、DNA 損傷定量化法、低時間/予算要求、高い再現性。ここでは、我々 は olaparib/テモゾロミド併用療法 U251 神経膠腫細胞の遺伝毒性影響を評価することで臨床研究のコメット ・ アッセイの有用性を強調表示します。

議定書は、彗星の試金実行とデータ分析 (図 1) ステップバイ ステップ ワークフローを説明します。ドキソルビシン処理 U251 細胞 (1 μ M、20 h) の彗星の尾が長く高い DNA 強度、化学療法 (図 2) により断片化された DNA のかなりの蓄積を示唆があったことを示したアルカリ性と中性の彗星の試金からの結果。
アルカリか中立コメットアッセイのいずれかの定量的な解析は、ドキソルビシン治療 (図 3 a) DNA 損傷を示す後大幅に増加した彗星の尾形成を示した。結果は、平均 ± SEM とtとして表示されます-テストが統計上の比較のために使用されました。両方試金から尾の瞬間の定量化は平均テール モーメントの増加を確認した: アルカリ コメットア...

コメット ・ アッセイは、単一および二重鎖 DNA を含む DNA 損傷の中断を検出する効率的な方法です。化学療法の治療効果を評価するためがん細胞における DNA 損傷を測定するアルカリ性と中性の彗星の試金を記述します。

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

この実験の全体的な目標は、コメットアッセイとも呼ばれるシングルセル電気泳動アッセイを使用して、がん細胞における遺伝毒性物質の有効性を調査することです。この手順は、4つの遺伝毒性学的研究を測定する感覚です。また、初期の薬剤候補の選択やDNA損傷と修復の基礎研究など、さまざまな評価にも適用できます。この手法は、DNA損傷を定量的に評価する直接的な方法を提供します。また、効率的で、実行が容易で、比較的安価です。スライドコーティング用のアガロースを準備するには、1%のアガロースを電子レンジで2〜3分間、またはアガロースが完全に溶けるまで溶かします。ガラス顕微鏡スライドをアガロースに浸し、糸くずの出ないワイプを使用してスライドの片側を拭きます。スライドを平らな面に置き、風乾させます。乾燥後に透明なアガロース膜を形成する必要があります。コーティングされたスライドを摂氏37度に置いてから使用してください。化学療法の治療効果は、10%FBS、ペニシリン1ミリリットルあたり100単位、ストレプトマイシン1ミリリットルあたり10マイクログラムを添加したDMEM/ハムF-12培地で培養したU251神経膠腫細胞で評価されます。1ミリリットルのトリプシンを使用して細胞を3分間消化し、次にDMEM / Ham F-12培地とFBSを使用してトリプシンを中和します。細胞を15ミリリットルのチューブに集めます。そして、Gの300倍で4分間回転します。媒体を吸引します。そして、細胞を1×PBS中に1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の2倍で懸濁します。細胞は、アッセイを開始する直前に調製する必要があります。そして、それは暗闇の中で扱うべきです。損傷を防ぐために、すべて薄暗い光の中で。細胞懸濁液を1パーセントの溶融低融点アガロースと1対10の体積比で組み合わせます。ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。そしてすぐに30マイクロリットルをスライドにピペットで移します。ピペットチップのスライドを使用してアガロース混合物を広げ、薄い層の形成を確実にします。スライドを摂氏4度で平らに置き、暗闇の中で10分間置きます。スライドを摂氏4度の溶解液に、暗闇で1時間から一晩浸します。アルカリコメットアッセイでは、スライドを溶解溶液から穏やかに取り出し、余分な液体を排出し、スライドをAESに静かに浸し、暗所で摂氏4度で1時間、DNAを巻き戻します。予冷したAESを電気泳動スライドトレイに加えます。スライドから0.5センチメートルを超えないようにしてください。スライドを内側に置き、キャップで覆います。電源電圧を1ボルト/センチメートルに設定し、摂氏4度で30分間運転します。電気泳動が完了したら、スライドから余分なAESを排出します。スライドを室温の蒸留水に2回、毎回5分間静かに浸します。その後、スライド

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、ドキソルビシン処理細胞における一本鎖および二本鎖DNA切断を定量するためのアルカリ性単一細胞電気泳動アッセイを実演します。アルカリ性条件では、DNA塩基対間の水素結合が破壊され、DNA鎖が完全にほどかれて分離します。これにより、電気泳動時にアガロースゲル中の損傷していないDNA断片と損傷したDNA断片の異なる移動が可能になり、円形の彗星頭を形成する損傷していないDNA断片がゆっくりと移動し、損傷したDNA断片が細長い彗星尾を形成する彗星型の構造が明らかになります。...

アルカリ性単一細胞ゲル電気泳動:化学療法後の個々の癌細胞におけるDNA損傷の定量的推定のための高感度技術

このビデオは、有害物質にさらされた後のDNA損傷を検出するための彗星アッセイを示しています。アルカリ性条件下では、DNAは巻き戻されて変性し、電気泳動では、損傷していないDNAと損傷したDNAがアガロースゲル内で異なる方法で移動し、彗星状の構造を形成します。ゆっくりと移動する損傷を受けていないDNAは円形の彗星の頭を形成し、急速に移動する損傷したDNA断片は細長い彗星の尾を形成します。...

細胞内のDNA損傷検出のためのCometアッセイ

コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。...

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。...

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

コメットアッセイは、様々な要因によって誘発されるDNA破壊を測定します。 DNAの損傷を引き起こす（酸化ストレスを除く）すべての要因が一定に保持される場合、DNA損傷の量は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。このプロトコルの目的は、酸化ストレスの間接的な測定のためのコメットアッセイを使用することです。...

全身酸化ストレスの間接的な指標として、コメットアッセイ

アルカリ彗星アッセイは、真核細胞のDNA鎖切断を測定します。エンドヌクレアーゼIIIまたはヒト8-オキソグアニン-DNA-N-グリコシラーゼ消化ステップを追加することで、アッセイは酸化的DNA損傷を効率的に検出できます。これらのアッセイを使用してラット肝臓のDNA損傷を検出する方法について説明します。...

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。...

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

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I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

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上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

学ぶコメットアッセイによるがん細胞のDNA損傷評価法。アルカリ性と中性の両アッセイを用いて、化学療法薬の遺伝毒性効果を定量的に測定し、がん治療研究に応用する。

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

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