Nested pcr 法を使用してのタイマー刻みでライム病ライム病スピロヘータを検出

ライム病は、スピロヘータ病原体であるボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラトによって引き起こされる衰弱性疾患です。この細菌は、感染したダニに噛まれることで人間に感染し、皮膚、関節、心臓、神経系に影響を与える可能性のある多系統症状を引き起こします。犬の散歩やハイキングなどの日常的な活動は、ライム病にかかるリスクを高める可能性があります。

したがって、この増大する脅威に対抗するための戦略には、マダニの病原体の有病率を示し、懸念される地理的領域を特定できる堅牢な監視手段が含まれます。このビデオでは、Borreliaの分子スクリーニングツールとしてのネステッドポリマー連鎖反応の有用性を示しています。具体的には、外面プロテインA遺伝子とフラジェリンB遺伝子の両方を増幅の標的とします。

ワークフローは、ダニの収集、DNA抽出、そしてボレリア特異的遺伝子座を検出するための最初のPCRラウンドから始まります。セカンドラウンドPCRは、ファースト反応の生成物を新しいテンプレートとして使用して、より小さな内部増幅フラグメントを生成します。ダニは、両方のボレリア遺伝子からの内部アンプリコンをアガロースゲル電気泳動によって検出できる場合、病原体に対して陽性と見なされます。

受動的監視は、市民と獣医師の助けを借りて、ダニを収集して検査に提出します。このプロセスの一環として、ダニのホスト、日付、遭遇の場所などの情報を取得することが重要です。実験室では、まずマダニを撮影し、標準的なキーとの形態学的比較に基づいて識別する必要があります。

ネストPCRの感度が高いため、この手法はコンタミネーションに対して脆弱であるため、サンプル処理の各段階は別々の清潔な場所で行い、試薬と環境に汚染物質がないように複数のコントロールを含める必要があります。作業スペースが適切に準備されたら、滅菌された生物学的安全キャビネットでダニを二等分し、半分を微量遠心チューブに入れます。PCR適合テンプレートが得られるDNA単離手順であれば、どのようなものでも使用できます。

このビデオでは、キレート化に基づく簡単なDNA抽出を実演しています。まず、ダニの断片のサイズに応じて適切な量の溶解性キレート化バッファーを追加し、マイクロチューブ乳棒を使用して均質化します。サンプルを摂氏60度の水浴で45分間インキュベートし、ボルテックスしてから、内容物を遠心分離します。

待っている間に、50マイクロメートルのイソプロパノールを分注して、各検体に新しい微量遠心チューブを準備します。上清を新しい微量遠心チューブに移し、反転して混合し、前と同じように再遠心分離します。今回は上清を捨て、DNAペレットを70%エタノールですすいでください。

ピペットで残った液体を取り除き、ペレットを室温で15分間風乾します。最後に、各ペレットに50マイクロメートルの1ミリモルトリスを加え、60度の水浴で1時間インキュベートしてDNAを再懸濁します。サンプルは、将来の分子分析のために摂氏マイナス20度で保存できるようになりました。

まず、UV光と70%エタノールを使用してPCRキャビネットを滅菌します。反応カクテルは、ポリメラーゼ、水、フォワードおよびリバースアウタープライマー、および前の手順で抽出されたDNAを含むマスターミックスで構成されています。各ダニ検体でOspAとFlaBを独立して検出するように、別々の反応が設定されています。

サンプルをパルス遠心分離し、サーマルサイクラーに入れて、マシンをプログラムします。最初のPCR実験では、長いアンプリコンを産生する遺伝子特異的なアウタープライマーを使用します。最初の反応からのPCR産物は、その後の増幅のためのテンプレートになります。

このネステッドPCRは、最初のアンプリコン内でアニールする遺伝子特異的プライマーを使用して、DNAのより短い断片を新たに生成します。2回目の反応で得られた生成物は、1.2%アガロースゲル上の分子質量参照ラダーの隣にロードし、1時間電気泳動することができます。最後に、トランスイルミネーターを使用してゲルを観察します。

この例では、各レーンは、OspA と FlaB の両方で分析された異なるティック標本を表しています。アンプリコンは一部のレーンにのみ存在します。これら2つのサンプルはどちらもOspAのPCR産物を生成しましたが、FlaBを捕捉したのは1つだけでした。

サンプルは、両方の遺伝子が陽性と見なされるためにバンドを生成する必要があります。したがって、PCR産物の目視検査により、各ダニのボレリア状態を判断できます。全体として、ネストPCRは、ボレリアサーベイランスに適用できる、感度が高く、特異的で、比較的簡単な手法です。

このような取り組みから得られたデータは、ライム病の地理的な懸念事項を特定し、自然界におけるこの病原体の有病率を推定するのに役立ちます。