Name: 高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶ光学マッピングを用いたマウス心房の高解像度電気生理学的評価法。ラングドルフ灌流と蛍光色素を使い、膜電位とカルシウム動態を同時記録し、刺激誘発性不整脈の機序を詳細に解析します。

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この作品に支えられてプログラム研究環境の改善のため特別調整費から若手の科学と技術 (SCF) (t. s.) に、補助金の科学研究 (No. 16 K 09494、t. s.、号 26293052タスクフォースオニオン) に教育省、文化、スポーツ、科学、日本の技術 (文部科学省) からテクニカル サポート Brainvision と氏賢治坪倉を申し上げます、彼の言語援助のジョン ・ マーティン氏を申し上げます。

この動物実験は承認され、機関動物ケアおよび使用委員会の東京医科歯科大学・の規制の下で実行されます。
1. 準備
<ol><li>貯蔵液<ol>
<li>膜電位感受性色素 (ディ-4-ANEPPS および RH237) および Ca2 +インジケーターを解散 (ロード 2 だ) 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) にそれぞれ 6 mM、10 mM と 10 mM の濃度で原液で。</li>
		<li>興奮-収縮 (E C) ランプ、blebbistatin 50 mM 在庫ソリューションを作成する 90 %dmso を溶解します。</li>
		<li>分注溶液 0.2 mL PCR で暗い部屋でチューブし、酸化を避けるために窒素ガスを使用してストック チューブの空気を入れ替えます。</li>
		<li>光から保護するため個別にアルミ箔でストック チューブをラップし、-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>作業ソリューション<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 + (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.0 mM の Na2HPO4、および 1.5 mM KH2PO4、pH naoh 調整 7.40) なしの 1 L を準備します。</li>
		<li>タイロード液 (135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.53 mM MgCl2、0.33 mM NaH2PO45.5 mM D-グルコースと 5.0 mM HEPES、pH の水酸化ナトリウムによって調整 7.40) の 1 リットルを準備します。</li>
		<li>0.22 μ m ボトル上部フィルターとタイロード液をフィルターし、エアレーション O2ガス シリンダーに接続された空気石を使用しても通気します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 光蛍光潅流心のマッピング
<ol><li>(図 1 a& b) 二つの相補的金属酸化物半導体 (CMOS) カメラを使用して光学マッピング システムを構築します。<ol>
<li>光学マッピング システム図 1 a・ bに示すように CMOS カメラ、ビームスプリッター、対物レンズ、レンズ リボルバー、光源、ダイクロイック ミラー、フィルター、およびその他の部品を組み立てます。</li>
		<li>異なる倍率 (1.6 X、5 X) を装備、砲塔内の対物レンズを変更することにより、倍率を選択します。 メモ: CMOS センサーのサイズは 10 mm × 10 mm、5 X 対物レンズと、このシステムは、20 μ m の空間分解能を提供しますを意味 100 × 100 の解像度です。</li>
		<li>530 の中心波長の発光ダイオード (LED) ランプを使用して励起光を設定帯域通過フィルターを通した nm (520/35 nm)、ダイクロイック ミラーで反射し、(560 nm)。</li>
		<li>レコード発光信号は、分割線での分割 (665 nm)、長い設定カメラ 1 のフィルターを通過 (697/75 nm) バンドパス フィルターを用いた膜電位感受性色素 (ディ 4 ANEPPS または RH237) とカメラ 2 蛍光を検出 (572/28 nm) を検出し、Ca2 +インジケーター (Rhod2 AM) の信号。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光灌流回路を組み立てる<ol>
<li>ポリ塩化ビニル (PVC) 管を蠕動性ポンプに接続します。</li>
		<li>1.2.3 のステップで述べたように 100% O2曝気タイロード液に PVC チューブの吸気側を置きます。</li>
		<li>手作り空気トラップに塩ビ管の吐出側を接続し、5 μ m フィルター、三方活栓、圧力トランスデューサー、加熱ガラス コイル 21 g 鈍い針 (針のサイズは合わせて大動脈のサイズ変更) を手配順次、その他の塩ビ管を使用しています。</li>
		<li>回路で、空気の泡を避けタイロード液で灌流回路を埋めるし、中心部が回路に接続されるまでの流れを止めます。</li>
	</ol></li>
	<li>パリン投与群と麻酔<ol>
<li>未分画ヘパリン (200 IU、体重に関係なく) を 25 ゲージ針と 1 mL 注射器を使用してマウス腹腔内注入します。</li>
		<li>ヘパリン注射後 10 分ペントバルビ タール 65 mg/kg の腹腔内投与によるマウスを麻酔します。</li>
	</ol></li>
	<li>挿管および灌流<ol>
<li>仰臥位の位置にマウスを配置します。ピンチをつま先への応答の欠乏によって動物を麻酔を確認します。はさみを使用して剣状突起レベル下腹壁を開きます。横隔膜の横切開を作る、心に損傷せず内側腋窩線で肋骨の両側をカット、前胸壁を上向きに反転します。心臓の後ろにカーブタイプ鉗子を進めるし、下行大動脈、食道、下大静脈を保持します。その後、隣接した血管、大動脈、肺、気管、食道、脂肪細胞、胸腺などの組織とともに急速にハサミで心を切除します。</li>
		<li>シャーレで 10 mL の氷冷 PBS で心を洗うし、隣接した組織を削除します。</li>
		<li>上行大動脈に灌流回路に接続されている 21 ゲージ鈍い針の先端を紹介し、実体顕微鏡下のスレッドでそれを修正します。</li>
		<li>タイロード液 100% O2と通気するおくと 10 分間心臓を灌流を開始します。</li>
		<li>アンプとレコーダーに接続されて圧力トランスデューサーと灌流圧を継続的に監視します。</li>
		<li>次の手順を実行中に (通常は 2-5 mL/分の流量に対応する) 80-100 mmHg の間灌流圧を保ちます。</li>
		<li>初期の灌流 (ステップ 2.4.4。)、の間に極薄のポリエチレン (PE) 管を挿入 (外径: 0.8 mm)、SVC にし、スレッドで固定。その後、温めたガラス室 (図 1 b& c) に中心を配置します。</li>
		<li>24 g 留置針を穿刺 (外径: 0.7 mm)、アトリウムへの損傷を避けるために、内側の針を削除心尖部から左心室 (LV) キャビティに LV の外部のカニューレを残して</li>
		<li>RA で電気刺激を実行する SVC の PE 管を通って 1 フランス サイズ カスタム電極カテーテルを導入します。必要な場合は、心室ペーシングのため右心室 (RV) にカテーテルを進めます。</li>
		<li>上行大動脈 (図 1 c) ピン電極、穿刺針の間双極心電図 (ECG) を継続的に記録する心尖部に針電極を挿入します。</li>
		<li>全体の研究を通して心電図と灌流圧の監視を継続します。</li>
		<li>ライトをオフにし、暗い部屋で次の実験を実行します。</li>
		<li>2.5 手順に進みます。膜電位または 2.6 の単一の記録。膜電位と Ca2 +過渡のデュアル記録。</li>
	</ol></li>
	<li>膜電位の単一の記録のために汚れる<ol>
<li>膜電位の単一の記録のためのこの汚損のプロトコルの間は 37 ° C の温水灌流液を維持します。</li>
		<li>(最終濃度は 5 μ M) タイロード溶液 10 mL ・ ディ ・ 4 ANEPPS 原液 (6 mM) の 8.3 μ L を希釈します。</li>
		<li>5 分 tyrode のウォッシュ アウトが続く、2-5 分間血流ルートを介して心臓にディ 4 ANEPPS 薄めたの総量 (10 mL) を吹き込みます。</li>
		<li>(最終濃度は 250 μ M) タイロード溶液 1 mL で blebbistatin 原液 (50 mM) の 5 μ L を希釈します。</li>
		<li>灌流ルート経由で希釈した blebbistatin ソリューションの合計を管理します。</li>
		<li>2.6 の手順をスキップして手順 2.7 ウォッシュ アウトのために進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>膜電位と Ca2 +過渡の二重の記録のために汚れる<ol>
<li>室温で、タイロード液を維持します。 注: 温度のこの初期設定は膜電位 (手順 2.5) の単一の記録のために汚れるで異なる。</li>
		<li>2.5.4 と 2.5.5 の手順と同様の方法で、blebbistatin を管理します。</li>
		<li>Rhod2AM 原液 (10 mM) のミックス 3 μ、30 μ L のポリオキシ エチレン ポリオキシプロピレン ブロック共重合体 F-127 (DMSO は 20%)、し、タイロード溶液 10 mL との混合物を希釈します。</li>
		<li>Rhod2AM ソリューション (3 μ M) の合計金額をロード、blebbistatin と同じルートで 2-5 分以上。</li>
		<li>RH237 原液 (10 mM) の 7 μ L をタイロード溶液 10 mL で希釈します。</li>
		<li>RH237 薄めた (7 μ M) の総量を管理 2-5 分以上。</li>
		<li>上記の手順の完了後、37 ° C で、タイロード液を熱に開始します。</li>
	</ol></li>
	<li>ウォッシュ アウト<ol>
<li>次の実験では 37 ° C でタイロード液の温度を保ちます。</li>
		<li>少なくとも 5 分余分な染料を洗い流す tyrode の心臓を灌流します。 注: ステップをこの洗浄中に流量を増加する必要はありません (2.4.6 の手順を参照してください)。</li>
		<li>収縮し、灌流心臓の均一染色により任意のモーションアーチファクトの消失を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプリングとデータ解析<ol>
<li>慎重に、あまりにも多くの機械的ストレスなく心房表面を平らに灌流心臓のカバーガラス (25 mm × 60 mm) を置くし、ソリューションの振動から動きアーチファクトを防ぐ。アトリウムが適切にカバーガラスに接続を確認します。</li>
		<li>レコード サンプリング CMOS カメラによる蛍光率・ ディ ・ 4 ANEPPS、および 1 まで 0.1 ms RH237 と Rhod2AM ms 染色します。</li>
		<li>製造元の指示に従ってソフトウェアの実際の運用によると分析ソフトウェアを使用して得られた記録を分析します。</li>
		<li>関心、ドリフト除去、時間フィルタ リングおよび 3 X 35のビニングの領域を抽出した後、活性化マップとムービーを作成します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 電気生理学的研究
<ol><li>ペーシング電極と刺激装置の設定<ol>
<li>刺激のため組織に RA のカスタムメイドのペーシング電極の先端の接触を確認 (ステップ 2.4.9 を参照)。</li>
		<li>ペーシングカテーテル プログラマブル刺激装置に接続してからすべてペーシング刺激を提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペーシング閾値の決定<ol>
<li>セット 100 ~ 150 ms (0.4 ms のパルス幅)、ペーシング間隔は、ペーシング レートを上回っている任意の本質的なリズムを回避します。</li>
		<li>安定した心房ペーシングを取得する少なくとも 20 のビートを一定のペーシング刺激を提供します。</li>
		<li>ペーシング出力で設定 5 mV、心房の脱分極を可能に配信のペーシングが失敗するまで徐々 に減らします。</li>
		<li>光記録して心電図、および/または心房の興奮信号における P 波の存在によって心房の興奮を確認します。</li>
		<li>ペーシング出力ペーシング閾値として心房脱分極することができる最小値を決定します。</li>
		<li>ペーシング閾値 2 回で次の研究のペーシング出力を設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>定数とバーストのペーシング<ol>
<li>99 ビートを一定ペースを提供ペーシング間隔 150 ms、開始または本質的なリズムを上回っているを回避する最長間隔に。</li>
		<li>5 ms の手順、40 ms まで、またはアトリウムの 1:1 キャプチャの取得に失敗する間隔に達するまでに徐々 にペーシング間隔を減らします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペーシング単一 extrastimulus<ol>
<li>本質的なリズムを上回る基本的なドライブまたは 1:1 の心房の興奮を取得するペーシングが失敗しない限り、120 ms、100 ms、80 ms の基本的なドライブ (S1) ペーシング サイクルの長さを設定します。</li>
		<li>基本的な駆動系の 10 ビートに刺激をペーシングの数を設定します。</li>
		<li>最初 extrastimulus (S2) を基本サイクル長-10 ms に設定します。</li>
		<li>基本的なドライブの最後のペーシング刺激後 S2 を提供します。</li>
		<li>S2 が心房の脱分極を可能になるまで 5 ms の手順で徐々 に S2 の連結間隔を短きます。</li>
		<li>心房の脱分極を可能に失敗した最長の S2 間隔として有効不応期 (ERP) を決定します。</li>
		<li>ERP のレート適応を評価するために、少なくとも 3 異なる基本的なサイクルの長さと ERP を評価します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>心房頻脈性不整脈を誘発するペーシング ダブル、トリプル extrastimuli<ol>
<li>不整脈が観察される場合、ポイント S2 ERP 外 20 ms に S2 間隔をリセットします。</li>
		<li>S2 と同じ間隔で始まる 2 番目 extrastimulus (S3) を追加します。</li>
		<li>S3 が心房の脱分極を可能になるまでは、5 ms の手順で徐々 に S2 と S3 の結合間隔を短きます。</li>
		<li>ERP、外 10 ms のポイントに S2 の間隔をリセットし、3.5.3 のステップを繰り返します。</li>
		<li>ポイント各 ERP 外 20 ms に S2 と S3 の間隔をリセットします。</li>
		<li>S3 と同じ間隔で始まる第 3 extrastimulus (S4) を追加します。</li>
		<li>S4 が心房の脱分極を可能になるまでは、5 ms の手順で徐々 に S3 と S4 の結合間隔を短きます。</li>
		<li>ERP、外 10 ms まで S3 間隔をリセットし、3.5.7 のステップを繰り返します。</li>
		<li>ポイント ERP、外 10 ms に S2 と S3 の間隔をリセットし、3.5.7 のステップを繰り返します。</li>
		<li>同様にプログラムされた刺激を用いた再現可能な誘導による心房頻脈性不整脈の誘発性を定義します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>心房頻脈性不整脈の誘発性の評価<ol>
<li>ペーシングのすべてのプロトコル (手順 3.3 3.5。) 中に心電図を連続記録します。</li>
		<li>心房頻拍 (AT) または反復的な心房応答 (RAR) の誘導を記録するため、それぞれの刺激前後の間に光学録音を実行します。</li>
		<li>AF または、RAR が誘導されるとき、ペーシングと同じプロトコルを適用することで再現性を確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gollob, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+the+Connexin+40+Gene+%28GJA5%29+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).</li>
<li>Gudbjartsson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variants+conferring+risk+of+atrial+fibrillation+on+chromosome+4q25%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25.</a> Nature. 448, 353-357 (2007).</li>
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<li>Sinner, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+genetic%2C+transcriptional%2C+and+functional+analyses+to+identify+5+novel+genes+for+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation.</a> Circulation. 130, 1225-1235 (2014).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

光学マッピングは老舗演習7心臓電気生理学を勉強するため、心室性不整脈8,9, だけでなく、心房のものを評価するために非常に便利なツール10,11.膜電位と Ca2 +トランジェントの同時マッピング、心臓障害や他の心臓病12,13に関連して不整脈の基になるメカニズムを理解することに役立ちます。単一のセルまたはセルのシートを使用するものなど、他の電気生理学的評価法を比較すると灌流心臓の光マッピングの絶対的な優越性の 1 つはそのままアトリウムにおける伝導パターンの評価と心室、洞調律の間にだけでなく、中には誘発不整脈14です。人間の代理としてマウスの心、特にアトリウムを利用しようがサイズが小さいため主に難しさを発生しました、しかし、マウスは遺伝子組み換え動物の評価の面で魅力的な実験モデルモデルは、この問題を克服する必要があります。我々 のアプローチは、それを解決する 1 つの方向を提供します。
私たち光マッピング装置全体マウス心15従来のシステムに基本的に類似していたが私たち方法にいくつか変更することによってマウスのアトリウムを評価する利点があります。まず、マウスのアトリウムにおける伝導速度と伝搬パターンの正確な測定に貢献したこの高解像度マッピングと 20 μ m/ピクセル、最大 0.1 ms/フレームの高時空分解能を取得追求。第二に、すべての不要な機械的な損傷や電気生理学的特性16,17を変えることができる、心房のストレッチを避けるために留置針はチャンバー内の圧力を減らすため LV に直接挿入します。以前の実行で、LA を挿入する代わりに15 を研究します。また、ペーシング刺激が、RA のカスタム作られた 1 フランス サイズ電極カテーテルを介して配信されますがない針電極によりこれがアトリウムを傷つける可能性があります。任意のピンは、過去研究15で使用された、心耳を固定で回避されます。第三に、不整脈の基になる機構評価の観点は、心房頻脈性不整脈を誘発するプログラムされた刺激プロトコルは重要な18,19です。バースト ・ ペーシングを含む臨床電気生理学的研究で、トリプル extrastimuli ペーシング、マウスの心臓のペーシング間隔の変更までプログラムされた刺激と同じを行います。したがって、ベースライン測定パラメーターに加えてプロトコルは AT のベンツピレン誘発を評価できません。必要な AT のベンツピレン誘発はイソプロテレノールや他の薬物の管理と評価されます。私たちの経験では野生型マウスはほとんど完全刺激プロトコル後も任意の ATs を示します。したがって、AT のベンツピレン誘発は、遺伝子の突然変異、外科的処置、薬11の管理などいくつかの病理学の条件の貢献を評価するための重要な情報をする必要があります。これらの変更は、そのままマウス アトリウムで正確な電気生理学的評価を最適化できます。
この方法では、いくつかの制限もあります。まず、5 X 対物レンズで最大の空間解像度を使用して、視野 (FOV) は心房の部分に限られている (すなわち。 に示す図 2 aとしてのみ左心耳)。アトリウムの大きな視野を得るため 1.6 X 対物レンズがあることが望ましい (図 2 b)。第二に、ピンとアトリウムを修正せず時々 だ心房伝導特性を正しく測定することは困難心房表面は湾曲します。だから、表面的にピンで固定ではなく平らにカバーガラスを配置しました。このメソッドもソリューションの振動から動きアーチファクトを防止するために有益です。第三に、私たちの方法で、全体の視野を得ることはかなり困難だため、前部と後部のビューを適切に使用する図 2に示すように、他のアプローチよりも我々 のアプローチでより重要です。前方ビューの利点付属物 (図 4) を中心に、病態の場合再突入のクリアな観察であります。その一方で、後部のビューは、心房後壁の良いビューを取得する利点を持ち、心筋の袖からアクティビティのトリガーの詳細な記録があります。適切なビューを取得する当社の方法で表面を平らにすることは困難です、アトリウムはピンで最低の張力で固定できます。
本手法は, 3 つの可能な問題、染色、ペーシングと不整脈誘導障害があります。染色、ない場合の失敗またはわずかな蛍光が観察される、光学マッピング装置が正しく組み立てられるかどうかと、試薬は適切に保存および使用するかどうかを確認する必要があります。灌流液の条件はまた重要、また心臓自体は、だから、pH、温度を含むソリューションの条件の電気生理学的特性に影響することができ、十分な通気が厳密に監視する、あったかどうか。中心部に任意の空気塞栓を避けるために重要です。ペーシング不全、ペーシング刺激はアトリウムを刺激できない場合研究者ください配線が回路テスターを使用して正しいかどうか。ペーシング刺激が正常に出力されると、問題は組織と電極との接触です。問題を解決することができます電極の再配置とペーシングのカテーテルを用いた我々 のアプローチを簡単します。不整脈誘導の難しさは、は、RV ペーシングは、限られたケースでの誘導に使用できます。RA から、右心室にペーシング部位を変更するは簡単だが 2 つの電極を遠位と近位電極に配置できます RV と RA、それぞれ極電極カテーテルを使用して、このカテーテルも同時心室興奮信号が心房の興奮信号をマスクするとき、心室の興奮をシフトするため便利です。
このメソッドが貢献する遺伝子型-表現型を評価するため心房細動における相互作用関連調査が他の方法でそれらを表示する失敗した遺伝子の特に GWAS など小説の研究で新たに発見された遺伝子。装置や技術の進歩、このアプローチでそのまま中心部に AF20の重要な源である肺静脈スリーブの電気生理学的特性を評価できます。

心は、哺乳類の 4 室で構成されます。上の 2 つの部屋は、アトリア、低いもの、心室です。心室は、全身または肺循環へ血液を排出するポンプとして働いています。心房は、全身または肺静脈から戻る血液を受け取るし、効率的な心臓ポンプ機能を取得する心室に血液を運搬を支援します。電気生理学的側面から心房の重要な機能は心臓のリズムを調整することです。電気信号上大静脈 (SVC) と右心房 (RA) との間の接合部にある洞結節から発信、RA および左心房 (LA) に反映し、房室結節と彼の-プルキンエを通じて心室に実施伝導システム。
心臓のリズム障害、不整脈は、心房と心室の起源によるとに分類されます。心房細動 (AF) は、心房のランダムな励起によって特徴付けられる、不整脈の最も一般的な持続的なフォームです。最近の遺伝学的解析とゲノムワイド関連研究 (GWAS) は、心房細動と遺伝の突然変異または monopolymorphisms1,2,3,4の関連付けを示されています。AF は、少なくとも部分的に遺伝的原因に関連付けられているが示唆されました。したがって、遺伝子改変動物モデルを用いた心房における遺伝子型-表現型相互作用を評価するため重要です。遺伝子組み換えの最も確立された哺乳類であるマウスを広く受け入れられています。
心臓組織の励起を評価する光学マッピング技術を開発しました。ただし、光マッピングによるマウスのアトリウムの観察は、比較的小さなサイズによって妨げられます。高い時間的・空間的解像度を持つマウスのアトリウムの詳細な評価を達成するために試みた。

<table><tbody><tr><td>(-)-ブレビスタチン</td><td>SIGMA</td><td>B0560-1MG</td><td>E-Cデカプラー 光学マッピング中のモーションアーチファクトを排除</td></tr><tr><td>RH237</td><td>ビオチウム</td><td>61018</td><td>電圧感受性色素</td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>ビオチウム</td><td>50024</td><td>Caインジケータ</td></tr><tr><td>プルロニック F-127 DMSO</td><td>ビオチウム</td><td>#59000</td>の20%溶液 <td>Rhod2AM</td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td> <td>による染色を強化する和光</td><td>041-29111</td><td>感電染料</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>和光</td><td>046-21981</td><td>試薬用溶剤</td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター</td><td>コーニング</td><td>430513</td><td>チロード液濾過用</td></tr><tr><td>ハパリン 持</td><td>田薬品工業株式会社</td><td>N/A</td><td>冠動脈の血栓を避けるため</td></tr><tr><td>エアストーン(&phi;8 mm x 10 mm)</td><td>東京 甲信理化学工業</td><td>N/A</td><td>曝気用</td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>共立製薬</td><td>N/A</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>プログラム可能な刺激装置</td><td>福田電子</td><td>BC-05</td><td>福田電子は親切にレンタルしてくれました。</td></tr><tr><td>Power Lab</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 26/8SP</td><td>血圧と心電図を記録するには</td></tr><tr><td>Bio Amp</td><td>AD Instruments</td><td>ML132</td><td>心電図用アンプ</td></tr><tr><td>BP Amp</td><td>AD Instruments</td><td>FE117</td><td>血圧用アンプ</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>AD Instruments</td><td>Version 7</td><td>血圧と心電図</td></tr><tr><td>を記録・分析するソフトウェア使い捨てBPトランスデューサ</td><td>ーADインスツル</td>メンツ <td>MLT0670</td><td>圧力トランスデューサ</td></tr><tr><td>ー1-Frカスタムメイド電極カテーテル</td><td>ユニークな医療</td><td>N / A</td><td>右心房をペースアップするために</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ(OD:0.8 mm、ID:0.5 mm)</td><td>Natume Seisakujo</td><td>SP31</td> 電極カテーテルMillex-SV 5.00 &muを導入する<td>ために優れた大静脈に入れ</td></tr>ます<tr><td>。m</td><td>Merk Millipore</td><td>SLSV025LS</td><td>循環するタイロードを濾過する</td></tr><tr><td>24ゲージ留置針</td><td>テルモ</td><td>SR-FS2419</td><td>左心室に導入し、チャンバー内の圧力を下げる</td></tr><tr><td>21ゲージ針</td><td>テルモ</td><td>SN-2170</td><td>針の先端を切って鈍くした</td></tr><tr><td>25ゲージ針</td><td>テルモ</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>PVCチューブ</td><td>テルモ</td><td>SF-ET0525</td><td>ランゲンドルフ灌流回路</td></tr><tr>用<td>三方活栓</td><td>テルモ</td><td>TS-TL2K</td><td>ランゲンドルフ灌流回路用</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>1つとして</td><td>3-1491-01</td><td></td></tr><tr><td>カスタム製加熱ガラスコイル</td><td>本橋里佳</td><td>N/A</td><td>灌流液の温度を保つため</td></tr><tr><td>カスタム加温ガラスチャンバー</td><td>本橋里佳</td><td>N/A</td><td>灌流液の温度を保つ</td></tr><tr>加熱<td>コイルと保温チャンバーに接続された</td><td>恒温循環装置</td><td>ラウダ</td><td>E100</td></tr><tr><td>カバーガラス(25mm回;60mm)</td> <td>松波</td><td>C025601</td><td>記録領域を平らにするためにアトリアに装着</td></tr><tr><td>ペリスタポンプ</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211</td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>Stemi DV4</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>実体顕微鏡</td></tr><tr><td>MiCAM ULTIMA-L2</td><td>Brainvision Inc.</td><td>UL-L2</td><td>光学マッピングシステム</td></tr><tr><td>BV_Ana Software</td><td>Brainvision Inc.</td><td>BV_Ana</td><td>データ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>Brainvision Inc.</td><td>THT-ZS</td><td>落射照明ユニット</td></tr><tr><td>LED光源</td><td>ブレインビジョン株式会社</td><td>LEX2-G</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 560nm</td><td>ブレインビジョン株式会社</td><td>DM560</td><td>エピイルミナチノン</td></tr><tr><td>励起フィルター 520/35nm</td><td>セムロック</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>プロジェクションレンズ プランS 1.0X</td><td>Carl Zeiss</td><td>435200-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>フォーカスドライブ</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ リボルバー</td><td>Carl Zeiss</td><td>435302-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>マニュアルフォーカスコラム</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>マクロスコープベース</td><td>Carl Zeiss</td><td>435430-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>ストレートライトガイド</td><td>モリテックス株式会社</td><td>MSG10-2200S</td><td>エピイルミナチノン</td></tr><tr><td>コンデンサーレンズ</td><td>モリテックス株式会社</td><td>ML-50</td><td></td></tr><tr><td>プラナポ 5.0X</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>10447243</td><td>対物レンズ</td></tr><tr><td>プラナポ 1.0X</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>10447157</td><td>対物レンズ</td></tr><tr><td>プラナポ 1.6X</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>10447050</td><td>対物レンズ</td></tr><tr><td>ビームスプリッター</td><td>株式会社ブレインビジョン</td><td>FLSP-2</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 665nm</td><td>ブレインビジョン</td><td>DM665</td><td>ビームスプリッター</td></tr><tr><td>蛍光フィルター 572/28nm</td><td>Edmund Optics</td><td>#84-100</td><td>Rhod2-AM</td></tr><tr><td>蛍光フィルター 697/75nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-697/75-25</td><td>RH237 & Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>0.2 mL PCRチューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td>東洋アルミ</td><td>0020</td><td></td></tr></tbody></table>

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

心房細動 (AF) を対象とする最近のゲノムワイド関連研究は、心房の電気生理学的表現型と遺伝子型の間に強い関連を示しています。AF の機構を解明する遺伝子組み換えマウス モデルを利用することを奨励します。ただし、サイズが小さいためマウス心房の電気生理学的特性を評価することは困難です。このプロトコルでは、光学マッピング システムを用いた灌流蛍光マウス心高時空分解能心房の電気生理学的評価について説明します。光学マッピング システムは、デュアル高速相補的金属酸化物半導体カメラや高倍率の対物レンズ、電位感受性色素と Ca2 +インジケーターの蛍光を検出すると組み立てられます。マウスのアトリアの評価に焦点を当てる、光マッピングは 2 mm × 2 mm または 10 mm x 10 mm、100 × 100 の解像度 (20 μ m/ピクセルまたは 100 μ m/ピクセル) と最大で最大 10 kHz (0.1 ms) のサンプリング レートの領域で実行します。1 フランス サイズ極電極カテーテルをペーシングはアトリウムに機械的な損傷を避け、上大静脈から右心房に配置され、ペーシング刺激カテーテルを介して配信されます。バースト、ペーシングとトリプル extrastimuli ペーシングまで、電気生理学的研究は、一定ペースを含むプログラム刺激で実行されます。自然やリズムをペーシング、下光マッピングは、活動電位持続時間、活性化マップ、伝導速度、および Ca2 +右と左心房で個別に一時的な記録。また、プログラムされた刺激は、心房頻脈性不整脈の誘発性を決定します。活性化の正確なマッピングが誘導心房頻中アトリウム内興奮伝播を識別するために実行されます。特殊な設定と光マッピング有効マウス病態モデルにおけるアトリウムの徹底的な電気生理学的評価にします。

図 1 aに示すように、デバイスを使用して光学マッピング実験を行った。光学系のスキーマは図 1 bに示されています。システムは、膜電位と Ca2 +アトリウムでは、過渡の高分解能解析を提供します。
図 1 cとdで描かれている、心臓は恒温室内に配置されています。1 フランス サイズの電極カテーテルは、SVC に挿入される PE チューブを介して RA に配置され、別の留置 PE 管が心腔に過度の圧力を避けるために LV の頂点から LV キャビティに挿入されます。同時心電図記録用穿刺針に陰極 (心電図リード [-]) が接続されているし、心尖部に挿入されるピン電極を陽極 (心電図リード [+]) が接続されています。このアセンブリの機能は心房の機械的な損傷を避けるためです。
膜電位の評価, とディ 4 ANEPPS を使用して蛍光を記録し、最大 10,000 のフレーム/秒のサンプリング レート (図 2)。RA から配信される定数ペーシング中に活性化マップが得られる精密マッピング小さなマウス アトリアで詳細な伝導パターンの解析が可能。 にします。
図 3膜電圧および Ca2 + RA から定数ペーシング中に RH237 と Rhod2AM を使用して LA で過渡の代表的な痕跡を示していますマッピングの現在の設定と Rhod2AM 信号の十分な信号/ノイズ比を得る 1000 フレーム/秒のサンプリング レートを削減します。ただし、システムは、活動電位および Ca2 +非定常の関係の分析のための十分な品質を提供します。
病的な状態の下でマウスを用いたプログラム刺激で心房頻脈性不整脈の誘導を実行します。図 4展示誘起の光記録・ ディ ・ 4 ANEPPS をステンド グラスのアトリウムにマウスで。マウスは、10 日実験6前に、房に圧負荷を適用する横方向の大動脈狭窄プロシージャを経る。我々 はペーシング (120/100/100/80)、トリプル extrastimuli によって AT を誘導し、リエントラント回路の伝搬を観察します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig1.jpg"> 図 1。光学マッピング システム。a.総会/光学電気生理学マッピング システム。b.光マッピング システムの構成の概略: 青の矢印の光源によって生成された励起光。対物レンズは、砲塔と交換できます。ステンド グラスの心から発せられた光は、カメラ 1 とカメラ 2 の分割されます。カメラ 1 は膜電位の長波長信号を検出し、カメラ 2 は Ca2 +非定常 580 ± 20 nm のバンドパス フィルターで波長を記録します。中には、心電図と灌流圧は連続的に記録と心電図信号はまた同時にレコーディング ソフト光マップにインポート。c.分離心の準備: 心が血流を介して上行大動脈鈍い針 cannulated。同時心電図、陰極は穿刺針に接続し、ピン電極を陽極が心尖部に挿入されます。d.送管と電極: 灌流 (穿刺針) の 21 ゲージ鈍い針で心臓を cannulated。刺激電極 (電極) 1 フランス サイズは、上大静脈に挿入されたポリエチレン管を通って右心房に配置されます。ガラス容器は、37 ° C で商工会議所の内で循環温水で温めています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig2.jpg"> 図 2。アトリウムの活性化マップします。a.代表的な活性化マップ 5 X 対物レンズとb前方ビューで1.6 X 対物レンズと後方ビュー。(左のパネル)摘出心臓およびアトリウムの概略図。(右側のパネル)左心房の活性化マップを用いてディ-4 ANEPPS 10,000 フレーム/秒で染色します。右心房に刺激電極を一定ペースの下で記録されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig3.jpg"> 図 3。活動電位および Ca2 +左房内のトランジェントの二重の記録。a.摘出心臓の概略図。b. Ca2 +過渡の膜電位 (Vm) と Rhod2AM の RH237 を使用して左心房に蛍光性の強度の代表的なイメージ。1,000 フレーム/s. c.で 5 X 対物レンズで記録されます。右心房に刺激電極を一定時心電図 (上)、RH237 信号 (中央) と Rhod2AM 信号 (下) の同時記録。黒い矢印は、心室の興奮刺激スパイクと黄色の矢印を示します。心室から光散乱効果も観察できます (黄色の矢印)、RH237 と Rhod2AM 信号の両方。d.結合された RH237 と Rhod2AM トレース。活動電位および Ca2 +過渡が同時に記録されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig4.jpg"> 図 4。心房頻拍中に活性化マッピングします。(左のパネル)摘出心臓の模式図。(中間パネル)心房性頻脈 (AT) 時活性化マップ。AT は、右心房から配信トリプル extrastimuli ペーシングによって誘導されました。(右側のパネル)同じマウスの心臓の洞調律の間に活性化マップです。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 1.膜電位・ ディ ・ 4 ANEPPS 染色を用いたアトリウム内の代表的な映画は。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_1.zip">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 2.房頻拍、洞調律時に活性化マッピングの代表的な映画は。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_2.zip">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

このプロトコルを記述する高時空分解能、膜電位のデュアル録音を含む光学マッピング システムを利用したマウスの心房の電気生理学的評価と Ca2 +の下で一時的なプログラム特殊な電極カテーテルを刺激。

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

この実験の全体的な目標は、電気刺激によって誘発される正常な洞調律および心房性不整脈の間に、高い時間的および空間的解像度でマウス心房の詳細な評価を達成することです。この方法は、遺伝子変異が心房性不整脈にどのように寄与するかなど、心臓電気生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、心房性不整脈の開始と維持メカニズムに焦点を当てて、心房内の正確な光学マッピングを取得できることです。灌流回路の組み立てを含む、ランゲンドルフ装置のセットアップに関する詳細は、テキストプロトコルに記載されています。イメージングパラメータも本文で提供されています。マウスをカニューレ挿入用に準備するには、ヘパリンで治療し、本文に詳述されているように麻酔をかけます。先に進む前に、必ず反射神経検査で麻酔を確認してください。続行するには、マウスを操作ボードの仰臥位に固定します。次に、はさみを使用して剣状突起レベルの下の腹壁を開きます。次に、横隔膜を横切開し、心臓を傷つけずに腋窩内側の肋骨の両側を切断します。次に、隣接する血管や組織と一緒に心臓を迅速に切除します。次に、10ミリリットルの氷冷PBSで心臓を洗い、周囲の組織を取り除きます。次に、上行大動脈に、灌流回路に接続された21ゲージの鈍い針の先端を導入します。ステレオスコープの下で、縫合糸で所定の位置に固定します。次に、純粋な酸素で曝気したタイロードの溶液で心臓を灌流します。灌流中は、灌流圧力を継続的に監視します。水銀柱の80〜100ミリメートルの間に保ちます。灌流中は、細いポリエチレンチューブを上大静脈に挿入し、縫合糸を使用して所定の位置に保持します。次に、温めたガラスチャンバーに心臓を入れます。チャンバーに入ったら、心室頂点を通過して24ゲージの留置針で左心室腔に穴を開け、心房の損傷を防ぎます。次に、左心室に外部カニューレを残して、内側の針を取り外します。次に、1-フレンチのカスタムメイドの四極電極カテーテルを上大静脈のチューブを通して導入し、右心房を刺激します。次に、ピン電極を心室頂点に挿入して、ピン電極とカニューレ挿入針の間のバイポーラ心電図を連続的に記録します。研究全体を通じて、心電図と灌流圧を継続的に監視します。膜電圧の単一の記録を染色するには、まず周囲の照明を最小限に抑えます。灌流溶液の温度は摂氏37度に維持する必要があります。灌流ルートで2〜5分かけて10ミリリットルの汚れを送達します。次に、Tyrodeの溶液を5分間灌流して汚れを追いかけます。灌流圧力は80〜100ミリメートルの水銀柱に保つようにしてください。次に、希釈したブレビスタチンの1ミリリットルを灌流経路で投与します。.心臓の収縮の解消を確認します。また、心臓が汚れを均一に取り込んでいることを確認してください。先に進む前に、ペーシング電極と刺激装置を設定し、ペーシングしきい値を見つけます。続行するには、灌流した心臓にカバーガラスを慎重に置き、心房表面を平らにし、溶液の振動による運動アーチファクトを防ぎます。アトリウムがカバーガラスに適切に取り付けられていることを確認してください。現在では、さまざまなペーシング連隊を評価できます。コンスタント ペーシングまたはバースト ペーシングの場合は、150 ミリ秒から始まるペーシング間隔、または固有のリズムを上回らないように最も長い間隔で 99 ビートを配信します。次に、ペーシング間隔を 5 ミリ秒ステップずつ 40 ミリ秒まで徐々に減らすか、間隔がアトリウムを励起しなくなるまで減らします。1 つの追加の刺激ペーシングの場合は、基本ドライブのペーシング サイクルの長さを設定するか、少なくとも 3 つの S1 から S1 の間隔 (120、100、80 ミリ秒など) をテストする必要がある S1.At を設定します。次に、最初の追加刺激 (S2) を基本サイクルの長さで負の 10 ミリ秒に設定し、基本ドライブの最後のペーシング刺激の後に S2 を配信します。S2 の結合間隔を 5 ミリ秒刻みずつ徐々に短くし、S2 がアトリウムの脱分極に失敗するまで繰り返します。アトリウムの脱分極に失敗する最長のS2間隔として有効不応期を決定します。患者の閾値や有効な不応期を決定する際、心電図のペーシングを観察することで心房捕捉を確認することが難しい場合があります。このような場合は、光学マッピングを使用して確認する必要があります。続行するには、テキストプロトコルに従って心房性頻脈性不整脈を誘発するために、二重および三重の追加刺激ペーシングを適用します。ランゲンドルフ心臓の膜電圧は、di-4-ANEPPSからの蛍光信号を毎秒10, 000フレームで監視することによって記録されました。活性化マップは、右心房から送られる一定のペーシングによって得られ、小さなマウス心房の詳細な伝導パターンを分析できました。RH237 と Rhod2AM を使用して、同じコンスタント ペーシング プロトコルで左心房のカルシウム過渡性を監視しました。毎秒1,000フレームでのサンプリングは、カルシウム過渡現象の活動電位を比較するのに十分な速さでした。次に、大動脈横行狭窄術の10日後にマウスから採取した心臓に心房頻脈性不整脈を生じさせ、心房に圧力過負荷を付与した。120 ミリ秒から 80 ミリ秒までの 3 倍の追加刺激ペーシングを使用して頻脈性不整脈を生成し、再入路回路を通過する頻脈性不整脈の伝播が観察されました。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試みるときは、心房の電気生理学的特性を変更する可能性のある損傷やストレスから心房を自由に保つことを覚えておくことが重要です。

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高周波高分解能心エコー検査：虚血 - 再灌流マウス心臓における心筋ストレイン、収縮性、および僧帽弁閉鎖不全の非侵襲的な反復測定に関する最初の証拠

学ぶ光学マッピングを用いたマウス心房の高解像度電気生理学的評価法。ラングドルフ灌流と蛍光色素を使い、膜電位とカルシウム動態を同時記録し、刺激誘発性不整脈の機序を詳細に解析します。

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

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