ミトコンドリア由来ペプチド治療時に ERK の活性化のための細胞レベル下の分別

この実験の全体的な目標は、ミトコンドリア由来ペプチドで刺激された細胞に関与する下流のシグナル伝達カスケードを特定することです。この方法は、ミトコンドリア由来のペプチド分野における重要な疑問、例えば、どのようなシグナル伝達経路が関与しているのか、どこで起こるのかといった疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、簡単で比較的簡単に実行できることです。

この手法のアイデアを最初に思いついたのは、ヒューマニン媒介ERKシグナル伝達を調べたときで、下流の事実に関する情報は限られていました。サブスケールカーシャー法は、ヒューマニン媒介シグナルの役割についてより深いアイデアを与えてくれました。3日目にめっきし、2回10回から6回に洗浄した後、SH-SY5YまたはHEK293細胞をテキストプロトコルに従って

S14G ヒューマニンペプチドをゼロポイント 2 ミクロンろ過蒸留水に溶解します。そして、それらを1ミリモルのストックソリューションとして再構成します。予め加温した血清含有培地または無血清培地を15ミリリットルの円錐管に分注し、室温のヒューマニンペプチドストック溶液を加えて作業濃度を上昇させます。

直ちに細胞内の培地を6ミリリットルのペプチド溶液と交換してください。そして、細胞を適切な時間インキュベートします。10ミリリットルの氷冷PBSを使用して、細胞を2回洗浄します。

次に、5ミリリットルの氷冷PBSで細胞をプレートからこすり落とします。そして、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。細胞をGの500倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

ペレットを200マイクロリットルの氷冷分画緩衝液に再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。チューブをGの250倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を細胞質画分として収集し、ペレットを核画分用に保持します。

上清を遠心分離機にかけ、Gの18000倍、摂氏4度で10分間、細胞の破片やその他の汚染物質を除去します。次に、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。これがシチゾール画分です。

ペレットを200マイクロリットルの氷冷洗浄緩衝液に再懸濁し、溶液をGの250倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を取り除き、100マイクロリットルの氷冷核抽出バッファーを使用してペレットを再懸濁します。次に、サンプルを氷上で10回超音波処理します。

サンプルを再度遠心分離します。次に、上清を新しい微量遠心チューブに移します。粗ミトコンドリア画分を単離するには、10ミリリットルの氷冷PBSを使用して、各10センチメートル皿の細胞を洗浄します。

次に、氷冷したPBSを5ミリリットル加え、セルスクレーパーを使用して細胞を分離します。細胞懸濁液を1本の15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞をGの600倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。

PBSを吸引し、1ミリリットルの氷冷ミトコンドリア分離バッファーを使用してペレットを再懸濁します。次に、ポリテトラフルオロエチレンでコーティングされた乳棒を氷上に置き、2ミリリットルのホモジナイザーを25回ストロークして細胞を均質化します。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに移し、サンプルをGの600倍、摂氏4度で10分間遠心分離して、核と壊れていない細胞を取り除きます。

次に、上清を回収し、新しいマイクロ遠心チューブに移し、Gの7000倍、摂氏4度の溶液を10分間遠心分離します。上清を除去した後、ペレットを200マイクロリットルの氷冷ミトコンドリア分離バッファーで再懸濁し、溶液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。チューブをGの7000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。

洗浄を繰り返した後、15マイクロリットルのRIPAバッファーを使用してペレットを再懸濁し、懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。次に、サンプルをGの16000倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。ミトコンドリア画分である上清を新しいチューブに移します。

テキストプロトコルに従ってウェスタンブロッティングを定量し、実施します。このビデオで紹介した手順を用いて、HEK293細胞とSH-SY5Y細胞は、強力なヒトニンアナログである100マイクロモルのS14 Gヒューマニンで後退しました。そして、全タンパク質抽出物からのテアニン202、チロシン204におけるERK12の総型およびリン酸化型を分析した。

ここで見られるように、S14Gヒューマニン治療は、ERK12とその調節テアニン-202、チロシン-204部位のリン酸化の増加を示しました。S14Gヒューマニンを介したERK12活性化の標的を理解するために、S14Gヒューマニン処理後の全およびリン酸化ERK12の細胞内局在を解析しました。これらのウェスタンブロットに示されているように、HEK293細胞では、リン酸化ERKは細胞質と核の両方で増加しましたが、ミトコンドリアでは増加しませんでした。

しかし、SH-SY5Y細胞では、リン酸化ERKが細胞質核とミトコンドリアで減少しました。S14Gヒューマニン媒介ERKリン酸化は、細胞タイプや条件によって異なる役割を果たす可能性があることを示唆しています。一度習得すれば、細胞核分画は1時間で、ミトコンドリア分画は適切に行えば1時間30分で行うことができます。

この手順を試みるときは、すべてのサンプルを氷上に保つことを忘れないでください。この手順に続いて、シグナル伝達分子の下流の標的を理解するために、共免疫沈殿法や質量分析などの他の方法を実行できます。