Name: 微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ細菌細胞の成長における重要プロセスの蛍光顕微鏡観察法。Agrobacterium tumefaciensを用いて生細胞の表面構造を可視化し、細胞分裂の調節メカニズムを解明する。

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図 2と図 4で FDAAs の贈り物ありがとうマイケル ・ VanNieuwenhze (インディアナ大学)。この原稿の準備の間のフィードバックのためのブラウンの実験室のメンバーに感謝いたします。A. 根頭がんしゅ病菌の細胞増殖と分裂にブラウンの実験室の研究は、国立科学財団 (IOS1557806) によってサポートされます。

1. A. 根頭がんしゅ病菌系統の成長
<ol><li>
A. 根頭がんしゅ病菌菌株を培養
	<ol>
<li>滅菌木製スティックまたはピペットの先端を使用すると、必要なひずみの単一コロニー ATGN 成長媒体 (レシピの材料リスト参照) の 1 mL を接種します。 注: A. 根頭がんしゅ病菌の枯渇株、ATGN に 1 mM IPTG 重要な蛋白質の生合成を維持するために誘導因子としてします。</li>
		<li>225 rpm で振とうしながら 28 ° c ATGN で一晩A. 根頭がんしゅ病菌系統を成長します。</li>
		<li>600 セルの光学密度を測定 nm (外径600) 分光光度計を使用しています。外径600に細胞培養を希釈 = ~0.2、外径 φ600まで成長し続ける = ~0.6 に達する。枯渇の緊張のため外径 φ600まで誘導成長し続ける = ~0.6 に達する。</li>
		<li>外径600 A. 根頭がんしゅ病菌の野生型と変異体の系統を使用してターゲット固有の染色や微速度顕微鏡観察 (セクション 2 および 3.1 参照) の ~0.6 を =。枯渇株をウォッシュ アウト インデューサ (セクション 1.2 を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A. 根頭がんしゅ病菌タンパク質枯渇系統の特性評価用インデューサの除去
	<ol>
<li>指数文化の 1 mL にペレット (外径600 = ~0.4-0.6) 室温でデスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。</li>
		<li>洗浄し、上清を除去し新鮮なメディアの誘導なしでペレットを再懸濁し、(1.2.1) 上記のようにセルをペレットします。新鮮なメディアで 3 回の合計セルを洗浄してください。</li>
		<li>新鮮なメディアで最終的なペレットを再懸濁します、外径600細胞を集中 = ターゲット特定の染料 (セクション 2 および図 4 bD) または (セクション 3.2 と図 4 a) 微速度顕微鏡観察と即時の汚損のための ~0.8.また、成長しているメディアの染色と細胞のイメージングの前に誘導なし細胞でに時間の必要な量のセルを使い果たす前。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ターゲット固有A. 根頭がんしゅ病菌の細胞の染色
<ol><li>
蛍光の d-アミノ酸酸細胞壁のラベリング 注: FDAAs は、 A. 根頭がんしゅ病菌ペプチドグリカンに容易に組み込まれている、非毒性の蛍光の d-アミノ酸酸です。この単純なラベリング手順は生きているセル6のパターニング成長をプローブします。4 FDAAs の合成のためのプロトコルは、使用可能な38です。<ol>
<li>指数文化を 500 μ l 添加ペレット (外径600 = ~0.4-0.6) デスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。新鮮なメディアの 100 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>5 mM に FDAA 洗浄し細胞を集中して、暗闇の中で 2 分間インキュベートの 5 μ L を追加します。 注意: 制限 FDAA ライトへの露出。潜伏の時は、株の成長率によって異なります。通常、インキュベーション時間は 2 倍時間6の 5-10% をする必要があります。</li>
		<li>遠心分離によって細胞をペレットし、3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞ペレットを洗浄します。</li>
		<li>〜 50 μ L の PBS でペレットを再懸濁します。 注: 再懸濁用 PBS のボリュームは、ペレット サイズに基づいて異なる場合があります。</li>
		<li>0.8-1 適用 agarose パッドと落射蛍光顕微鏡すぐに (を参照してくださいセクション 3.1 と 3.2) を使用してイメージするセルの μ L。<ol>
<li>冷たい 70% エタノールとセルを固定することによってさらにラベル定款または、停止します。冷たい 70% エタノール 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、氷で 15 分間インキュベートします。</li>
			<li>遠心分離によって細胞を収集し、後でイメージングのため PBS の小さなボリュームで再懸濁します。48 時間以内に 4 ° C およびイメージで細胞を懸濁液を格納します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA 染色 DAPI やオレンジ色の汚れ 注: DNA を観察する構造、細胞は DAPI またはオレンジ (死んだ細胞染色) が付いています。オレンジは側の透過物、古典的な「死んだ細胞染色」として記述されているがあると生きている細胞の DNA10をイメージングを有効にする、細菌の細胞の成長には影響しません。A. 根頭がんしゅ病菌のオレンジ ラベル作品は生きている細胞でよく、微速度顕微鏡観察 (図 3) に適しています。対照的に、DAPI 染色性細胞イメージングに必要な紫外線の (紫外線) 光の露出は光毒性 (図 3)、したがって DAPI 染色即時イメージングまたは固定セルを汚すのための生きた細胞を染色に最も適しています。<ol>
<li>DAPI は細胞の染色<ol>
<li>指数文化の 1 mL にペレット (外径600 = ~0.4-0.6) デスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。</li>
			<li>必要に応じて前の染色にセルを修正する 70% 冷たいエタノール 1 mL に再細胞ペレット懸を濁します。10-15 分 2.2.1.1 記載として遠心分離によって細胞収集のため氷の上を孵化させなさい。</li>
			<li>DAPI 原液 (1 mg/mL; 参照材料表) の 1 μ L を含む PBS の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。ピペットで穏やかに混合し、暗闇の中で 5 分間インキュベートします。</li>
			<li>5 分間 7,000 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、過剰な DAPI を削除する PBS の 1 mL で再懸濁します。セルを洗浄してさらに 2 回、50 μ L の PBS またはメディアにペレットを再懸濁します。</li>
			<li>0.8-1 適用 agarose パッドとすぐに落射蛍光顕微鏡を用いた画像のセルの μ L。3.1 と 3.2 のセクションを参照してください。 注: このプロトコルは染色体のダイナミクス (図 3) を観察する微速度顕微鏡観察に最適ではありません。オレンジ染色 (2.2.2 を参照) の代替として使用してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>生きているセルのオレンジ色染色</li>
		<li>指数文化の 1 mL にペレット (外径600 = ~0.4-0.6) デスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。1 mL のオレンジ原液 1 μ L を含む PBS で細胞ペレットを再懸濁します (マテリアル リストを参照してください)。ピペットで穏やかに混合し、暗闇の中で 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>遠心分離によって細胞をペレットし、過剰なオレンジを削除する PBS の 1 mL で再懸濁します。セルを洗浄してさらに 2 回、50 μ L の PBS でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>0.8-1 適用 agarose パッドとすぐに落射蛍光顕微鏡を用いた画像のセルの μ L。3.1 と 3.2 のセクションを参照してください。 注: このプロトコルは生きているセルでうまく動作し、染色体のダイナミクス (図 3) を観察する微速度顕微鏡観察に適しています。すぐに画像に便利ではない、冷たい 70% エタノール (セクション 2.2.1.2 参照) でセルを修正可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膜のラベリング 注: 親脂性の styryl の蛍光染料 4 64 使用されています広範囲の細菌の細胞膜を観察します。多くの細菌とは対照的 4 64 標識A. 根頭がんしゅ病菌の細胞は均一に、ラベル付けはしないが頻繁ではなく「馬蹄形」のパターン14,15を展示。驚くことに、古いポールのラベルは強烈なに対し、成長極はほぼ汚れを欠いているです。したがって、4 64 はセル成長パターンとA. 根頭がんしゅ病菌における膜構造物の可視化を実現。 にします。<ol>
<li>指数段階の細胞培養の 1 mL 中 8 μ g/mL の最終的な集中に FM 4-64 を追加し、暗闇の中で 5 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>7,000 x g でのデスクトップ、遠心分離機で 5 分間遠心分離による標識細胞のペレットし、1 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。セルを洗浄して余分な染料を削除する 3 回の合計。</li>
		<li>PBS の小さいボリュームをすぐにイメージする agarose パッド上のスポットで細胞を再懸濁します。(セクション 3.1 と 3.2 参照) 注意: セルをすぐにでイメージして特徴的なラベリング パターンを観察する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. A. 根頭がんしゅ病菌の細胞のイメージング
<ol><li>
アガロース パッド準備 注:図 1には、動画像 (パネル) と微速度顕微鏡観察のために準備する典型的な agarose パッドの模式図 (パネル B) が含まれています。必要に応じて通常 Agarose パッドで用意します。<ol>
<li>3.1.1 ガイドとカット、22 mm × 22 mm 角研究室のフィルム エッジの周りのメスを実行して (材料のリストを参照してください) として観察を使用してください。</li>
		<li>2 ~ 5 を残して研究所フィルムの中心の正方形をカット mm 罫線 agarose パッド用ガスケットとして使用します。中央の切り欠きを破棄します。</li>
		<li>ガラス スライド (75 mm × 25 mm) (材料のリストを参照)、アンモニア、アルコール フリーのクリーナーできれいにフィルムのガスケットを配置熱ガラス (図 1 aの上部のイメージ) にフィルムが溶けて少しまでとします。検査フィルムを溶かす、70 ° c の熱ブロック セットの端を使用して、または炎の上を軽く溶かします。</li>
		<li>~0.075 g アガロースを混合することによってアガロース溶液を準備 (材料のリストを参照) を 5 mL の小さなフラスコ内のメディア。熱ソリューション ミックス agarose を溶解するまで、ソリューションを定期的な旋回と電子レンジでは明らかです。55-70 ° C でアガロース溶液を維持し、48 時間以内複数 agarose パッドの建設のため使用します。</li>
		<li>ガスケットの中心に 1.2 〜 1.5% の agarose を含むピペット メディア。 注: メディアのボリュームは 50-60 μ L ですがガスケットのサイズによって異なります。冷たいスライドにメディアがあまりにも速く固まるアガロースを引き起こす可能性が追加すると、このようにスライドに保管されるべき暖かい表面。ヒート ブロックのエッジを設定する 70 ° C の作品も。水アガロースまたはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などのバッファーに格納された agarose のソリューションは、継続的な細胞増殖が必要ではないアプリケーションのアガロースを含むメディアの代わりに使用できます。インデューサ枯渇系統をイメージングすることができます提示またはメディアには存在しません。インデューサの不在は枯渇の表現型を明らかにするのに対し、インデューサの存在をコントロールとして使用できます。</li>
		<li>場所ガスケット上 coverslip agarose を均等に分散します。</li>
		<li>アガロース パッドや細胞懸濁液の表面に適用されたときのプールでしわだらけの表面になるので、回避がオーバードライ agarose パッドの ~ 2 分を固めるにクールなレベルの表面にスライドを配置します。</li>
		<li>アガロース パッド coverslip を慎重にスライドさせます。 注意: この手順を急いでしないでください。アガロース パッドは簡単に引き裂くことができるし、不均一な agarose パッド イメージングを困難にすることができます。</li>
		<li>許可空気に agarose パッドに 1-2 分乾燥室温でパッドの表面の乾燥を待ちます。メスを使用すると、空気のポケット (中央の画像、図 1 a); を作成する agarose の小さなストリップを削除します。空気のポケットは、〜 2 × 7-10 mm とA. 根頭がんしゅ病菌細胞エアポケット (図 1) に近い最高の成長する傾向があります。 注: 固定セルのまたは成長の監視されていない条件下ではイメージング、空気のポケットの必要はありません。</li>
		<li>スポット 0.8 1 アガロース パッドと新しい coverslip カバー上のセルの μ L。Coverslip をアガロース タッチパッドの表面細胞に分散する agarose のパッドの上にそっと置きます。</li>
		<li>溶かされた VALAP を使用してカバーガラスのエッジをシール (レシピの材料表を参照してください。図 1 a下の画像)。すべてのエッジや、カバーガラスのコーナーに沿ってシール可能性イメージ投射の間の細胞の漂流につながる agarose のパッドの乾燥します。注: coverslip のシーリングは、長期のタイムラプス イメージング用のみ必要です。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> 図 1: Agarose パッド準備します。(A) agarose パッドの準備のプロトコルのシーケンスをイメージします。画像 1 は、実験映画のガスケットでスライドです。画像 2 でアガロース パッドと空気のポケットを視覚化します。最後に、画像 3 は、coverglass の下のセルに完全な agarose パッドを示し、VALAP で密封します。微速度顕微鏡観察用アガロース パッドの (B) の回路図を提供しています。アガロース パッドの特長は、回路図にラベル付けされます。(C) 空気のポケットは、アガロース パッドにA. 根頭がんしゅ病菌の生育を推進しました。20 時間 agarose パッド上に成長した野生型A. 根頭がんしゅ病菌細胞の画像が表示されます。画像は、空気のポケットからはますます遠い位置で撮影されました。上の各画像のイメージの最も近い端から空気のポケットまでの距離が表示されます。スケール バー = 10 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="2"><li>
イメージング 注: 微分干渉コントラスト、位相コントラストや落射蛍光イメージング ハードウェア ベースのオート フォーカス、自動ステージ、標準フィルター、LED 光源、60 X オイルの液浸を搭載した倒立顕微鏡を実行です。位相コントラストまたは差動干渉の対照 (DIC) の目的 (1.4 NA) と 1 K 電子乗算電荷結合素子 (EMCCD) カメラです。顕微鏡は、恒温室内に置くべき。また、暖かいステージまたは商工会議所は、イメージング中に一貫した温度を維持するために使用できます。<ol>
<li>落射蛍光顕微鏡 注: 生細胞の蛍光イメージングのため必要があるイメージの買収の数を制限し、退色、光毒性を最小限に抑えるための露出時間を最適化するには各色素のイメージングは、十分な蛍光検出を提供していますが、退色または光毒性につながるしない最適な露出時間を見つけることをお勧めします。図 2-4、200 ms の露光時間はすべての蛍光画像に使用されていました。時間経過のシーケンスは、図 3に示すように、画像は 3 時間 10 分毎に買収されました。<ol>
<li>目的目標にイマージョン オイルを置き、スライド ホルダーに逆スライドをステージに配置します。フォーカシングのノブを使用すると、セルにフォーカスをもたらします。</li>
			<li>段階 (または DIC) 画像と必要な蛍光フィルターを取得します。 注:図 2図 3、および図 4で使用される汚れの最大励起と放射の波長は次のとおり: 羽田 (405/460)、灘 (450/555)、多田 (555/570) 4-64 (515/640)、DAPI (360/460)、オレンジ (547/570)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>微速度顕微鏡観察 注: 微速度顕微鏡観察時に次の機能がコンピューター制御: x、y、および z の位置、シャッター、および蛍光フィルター。ハードウェア ベースのオート フォーカス システムは、タイムラプス イメージング中にフォーカスを維持するために最適です。また、ソフトウェアによるオート フォーカス ループを使用できます。<ol>
<li>目的目標にイマージョン オイルを置き、スライド ホルダーに逆スライドをステージに配置します。フォーカシングのノブを使用すると、セルにフォーカスをもたらします。</li>
			<li>必要に応じて: 取得複数の (x, y) 位置。ランダムに agarose パッドの空気のポケット近くに細胞の 10 個のフィールドを選択します。</li>
			<li>適切な時間間隔で位相または DIC のイメージに時間のシーケンス取得を設置しました。 注:図 4に示す時間経過のシーケンス、DIC 画像は 30 ms 露出 14 時間 10 分毎に買収されました。微速度顕微鏡観察における蛍光イメージングを使用している場合は、退色と光毒性を最小限に取得間隔と露出時間を調整します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルには、一連a. 根頭がんしゅ病菌野生型、変異体、および枯渇系統の調査のためのプロシージャにはが含まれています。それはすべてのプロトコル セクションに記載されている手順が成長媒体、温度、および成長率を考慮して追加の変更とその他の細菌の緊張のために容易に適応することができますは注目に値するです。
ターゲット固有の染料の使用は、細菌細胞の細胞周期イベントの詳細な評価を提供するための貴重なツールです。ここでは、蛍光 d アミノの酸を用いたペプチドグリカン挿入パターンが観察された脂質ドメインは 4-64 で視覚化した、ユーグレナグラシリス DAPI またはオレンジでラベル付けされました。各プロトコルは、洗浄のプロトコルの最適化と成長や形態、DMSO 処理が損なわれないことを確認後使用の他の細菌に合わせることができます。重要な考慮事項には、多重ラベリング研究を有効にするまたは自動蛍光を避けるために適切な fluorophore の選択、ラベルの混入のためのインキュベーション時間洗浄ステップのバッファーの選択が含まれます。たとえば、脂溶性の赤色蛍光膜汚れ (4-6...

細菌の細胞周期の進行には、膜と細胞壁の生合成、DNA 複製と分離、細胞分裂など多くのプロセスの調整が必要です。細菌の細胞生物学の複雑さを完全に理解するには、これらの重要なイベントを研究する必要があります。しかし、これはこれらの経路の主要なコンポーネントは、突然変異誘発時にセル実行可能性が侵害されたので以外の些細なタスクであります。ターゲット固有の染料と相まって落射蛍光顕微鏡は、野生型と変異細菌株のこれらの重要なプロセスを調査する強力なアプローチです。
ペプチドグリカン固有染料など蛍光抗生物質 (バンコマイシン フロリダ州、bocillin FL) 蛍光 d アミノの酸 (たとえば、7-hydroxycoumarin-3-カルボン酸-3-アミノ-d-アラニン、波田; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-アラニン、灘。tetramethylrhodamine-3-アミノ-d-アラニン;多田)。グラム陽性菌のペプチドグリカン生合成のサイトを調査する抗生物質類縁体蛍光の致死濃度の使用はペプチドグリカン挿入パターン1,2を明らかにするための効果的な戦略をされています。 3,4。外膜は一般的に蛍光を使用できないように関門を提供します蛍光バンコマイシンのラベリングは、固定のグラム陰性細菌5の挿入パターン、ペプチドグリカンに洞察力を得るために使用されています、一方生細胞におけるペプチドグリカン生合成用プローブとしての抗生物質。対照的に、蛍光 d アミノの酸または双直交官能と d-アミノ酸の短いパルスは共有生活細菌細胞6、7の広い範囲で最近のペプチドグリカンの挿入の領域をラベルします。合成 d-アミノ酸と観察されているペプチドグリカン挿入のパターンは、点状、中隔 (大腸菌と枯草) 極と中隔 (アグロバクテリウムとリステリア菌)、中隔のみ (黄色ブドウ球菌)、および根尖 (放線菌 venezuelae)6,7。これらの観察は、細菌が細胞壁の生合成の多様なパターンを示すことと成長パターンを検査するためのプローブとして合成 d-アミノ酸の利用は多くの細菌で貴重な戦略を示します。
細菌の染色体にラベルを付ける染料は、デオキシリボ核酸 (DNA) 特定のマイナーな溝バインダー (4, 6-diamidino-2-phenylindole;DAPI) と親和性の高いシアニン色素 (緑とオレンジ; 材料のリストを参照してください)。生きているセルの DAPI 染色、細菌生存率9を示すために使用されます環境試料8から細菌の列挙に役立ちます DAPI 染色固定セルの。対照的に、シアニン色素膜非透過性の「死んだ」細胞の非実行可能なセル9を列挙する汚れとオレンジと緑が頻繁に記述されているようです。驚くことに、これらの試薬はセル成長の間に細菌の核様体の形態を調査する際、DAPI、オレンジと緑すべてあることを示した膜側の透過物、生きているセル10のラベル付けが可能。住んでいる大腸菌の細胞、細胞質から自動蛍光によるびまん性表示され DAPI は DNA の染色、紫外線 (UV) の DAPI 染色性細胞の反復暴露は核構造10を摂動します。染色の大腸菌や枯草オレンジと明らかにこの色素が膜側の透過物です、染色体分配10 や DNA の複製、細胞の増殖に影響を与えることがなく生きている細胞内の DNA に結合する長期的な蛍光を提供します.これらの観察は、DNA のシアニン色素を多くの細菌の細胞の成長中に核様体の形態を監視する使用ことができることをお勧めします。
Phospholipid-specific stryl N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) フェニルなど染料) hexatrienyl) ピリジニウム臭化 (4-64; 材料リストを参照) は陽イオン性化合物、負荷電に優先的に関連付けるリン脂質カルジオリピンおよびホスファチジルグリセロール11など。4 64 を使用して別の細菌の膜をラベルするときは、明確なパターンが観察されます。大腸菌4-64 極、外側壁に沿ってバンドの濃縮し、後半の pre-divisional の部門サイト細胞12。枯草菌、4-64 の分類、脂質スパイラル13の可視化が可能です。アグロバクテリウムで 4 64 外膜をラベルし、成長ポールが14,15をラベリングを欠いている、特徴的な「馬蹄形」パターンで観察する.これらの観察は、これらの細菌が細胞の非対称性に寄与する脂質ドメインの存在による異種の脂質分布を示すことを示します。びまん性ラベリングの存在など 4 64 ラベリング パターンの変化、鉱物または小胞、陥入、または膜収縮が有益であろう分布または脂質の生合成に影響を与える突然変異体を特徴付けること。
細胞を染色、を超えて、不可欠なプロセスに参加しているタンパク質の機能を決定することは必要です。削除必須遺伝子と表現型の結果を研究することが可能ではないために、重要なタンパク質の解析は技術的に挑戦的です。したがって、タンパク質を破壊する方法が浮上しています。たとえば、そのネイティブのプロモーターではなく誘導性プロモーターの制御下に必須な遺伝子を置くことができます。誘導性プロモーターなどの小さな分子に敏感であります。16イソプロピル β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, アラビノース22、バニリン酸17,23, 亜鉛します。キシロース23、従ってターゲット遺伝子のトランスクリプションを停止するためにおよび興味の蛋白質がなくなると、誘導が削除されたとき。興味の本質的な蛋白質を破壊のための代替アプローチは、CRISPR 干渉25,26 標的遺伝子の転写を阻害する低分子と RNA の相互作用を用いる合成 riboswitches24を含んでいます。ブロックの転写標的遺伝子と化学肥料プロテアーゼによる分解の標的タンパク質をペプチド タグを使用する誘導タンパク分解27,28に。したがって、タンパク質枯渇中に時間の経過とともに細胞の顕微鏡像は、特性評価のための強力なアプローチ、枯渇系統は、細胞生存率を失う前に特性の短時間だけを提供します。確かに、生きている細菌の細胞の顕微鏡観察は、区画29分泌、細胞形状維持のメカニズムを含む基本的な生物学的プロセスへの洞察を得るために研究者を可能にしました。
A. 根頭がんしゅ病菌細菌植物病原体30は、自然遺伝エンジニア31,32。したがって、機構、病原性に関連する宿主-病原体相互作用33,34,35など分泌36、ホスト変換30,31, 37広く検討されています。A. 根頭がんしゅ病菌による病気を防ぐため、植物形質転換を高める戦略を設計するには、 A. 根頭がんしゅ病菌の生存に不可欠なプロセスをよりよく理解する必要があります。ターゲット固有の染料を使用し、最近A. 根頭がんしゅ病菌18タンパク質枯渇戦略の不可欠なプロセスを調査するための手段を提供します。
ここでは、 A. 根頭がんしゅ病菌の野生型、変異体、および蛋白質の枯渇系統の顕微解析のための詳しいプロトコルが提供されます。最初の 2 つのプロトコルはセルを準備し、ターゲット固有の染料でそれらにラベルを付ける方法を説明します。第 3 のプロトコルでは、細菌の細胞 (図 2, , 図 3図 4) をイメージングとアガロース パッド (図 1) を準備するためのステップバイ ステップの指示を提供します。これらのプロトコルは、別のメディア条件、成長率、酸素の要件、および細胞構造を考慮して追加適応を持つ他の細菌に適した可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B、Currier TC、Gordon MP、Chilton MD、Nester EW.1975. Agrobacterium tumefaciens の病原性に必要なプラスミド。J Bacteriol 123:255-264。</td></tr><tr><td>アグロバクテリウム・ツメファシエンスC58&Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA & デルタ;ctrA</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W、Daniel JJ、Howell M、Sulaiman A、Brown PJB。2016. 人工 attTn7 部位への Mini-Tn7 挿入により、植物病原体 Agrobacterium tumefaciens のエッセンテール マスター レギュレーター CtrA の除去が可能になります。Appl Environ Microbiol.82:5015-5025.</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>メディアコンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATGN最小媒体</td><td></td><td></td><td>滅菌した水1 Lに、20X Buffer50 mL、20X Salts50 mL、40%グルコース12.5 mLを加えます。プレートの場合は、15 gのバクト寒天を1 Lの水とオートクレーブに加えます。55°Cまで冷却。Cを選択し、50 ml 20X Buffer、50 ml 20X Salts、12.5 ml 40% glucose</td></tr>を加えます。<tr><td>20X ATバッファー</td><td></td><td></td><td>214 g/L KH2PO4を水に加え、水酸化ナトリウムでpHを7.0に調整します。オートクレーブ。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT塩</td><td></td><td></td><td>40 g / L(NH4)2SO4、3.2g / L MgSO4&bull;7H2O、0.2 g/L CaCl2&bull;2H2O、および0.024 g/L MnSO4&bull;H2Oを水に。オートクレーブ。</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull;2H2O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull;H2O</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>D16</td><td>水に40%のストックを準備します。フィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>プレートを準備するときは、1 Lの水に15 gを加えます。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Optional 培地添加剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>100 mg / mlの水溶液として調製し、滅菌をろ過します。最終濃度200&マイクロで使用します。g / mlです。</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>1 Mの水溶液として調製し、ろ過滅菌します。誘導の必要に応じて、最終濃度1 mMで使用してください。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>顕微鏡 材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm。</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー</td>ガラス<td>フィッシャーブランド</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm。スパークルガラスクリーナーで清掃します。</td></tr><tr><td>スパークルガラスクリーナー</td><td>ホームデポ</td><td>203261385</td><td>アンモニアとアルコールフリー。</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>水、PBS、または培地に最終濃度1〜1.5%まで加えます。電子レンジで溶かし、70°C</td></tr>の<tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td>に<td>10倍の溶液BP399500置き、滅菌水で1倍に希釈します。</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ビーミス</td><td>PM-999</td><td>アガロースパッド調製のガスケットとして使用されるラボ用フィルム。</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>円錐形のチューブに等量のラノリン、パラフィンワックス、ワセリンを加えます。70°Cのヒートチューブ。Cドライ、ビーズまたはウォーターバスを溶かして混合します。溶かしたままVALAPを塗布します。</td></tr><tr><td>ラノリンバター</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>ターゲット (株)</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックスクラ</td><td>フティキャンドル</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ターゲット特異的染料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP231-1</td><td>必要に応じて染料の原液を希釈するために使用します。</td></tr><tr><td>FDAA(NADA、HADA、TADA)FDA</td><td></td><td></td> <td>は、Mike VanNieuwenhze (インディアナ大学) との契約を通じて合成または取得できます。100 mMの原液をDMSOで調製します。最終濃度5 mMで使用してください。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62247</td><td>DMSOに1 mg / mlのストック溶液を調製します。最終濃度1 &microで使用します。g / mlです。</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>DMSOのストック濃度は5 mMです。最終濃度5μMで使用してください。</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>DMSOに8 mg / mlのストック溶液を調製します。最終濃度8μで使用します。g / mlです。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic Thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>EMCDDカメラ</td><td></td><td></td>を搭載した落射蛍光顕微鏡 <td>Nikon Eclipse TiEとQImaging Rolera em-c2 1K Electron-Multipliing Charge-Coupled-Device(EMCCD)カメラが使用されています。</td></tr></tbody></table>

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

DNA 複製と分離、タンパク質合成、細胞壁の生合成と細胞分裂などのコア細胞プロセスは、細菌の生存に不可欠なタンパク質の機能に依存します。ターゲット固有の染料のシリーズよりプローブがこれらのプロセスを理解するように使用できます。膜構造の観察、脂質マイクロ ドメインの可視化および膜鉱物の検出を有効脂溶性染料で染色します。蛍光 d-アミノ酸酸ペプチドグリカン生合成のサイトを調査する (FDAAs) の使用は、細胞壁や細胞成長パターンの作成の潜在的な欠陥を示すことができます。最後に、核酸の汚れは、DNA の複製または染色体の分離の可能な欠陥を指定できます。シアニン DNA は、細胞ラベルの汚れ、微速度顕微鏡観察細胞増殖時核様体の形態のリアルタイム観測を有効にするために適しています。セルの分類のためのプロトコルは、膜構造、細胞壁の生合成、または染色体の欠陥を識別するために蛋白質の枯渇変異に適用できます。さらに、微速度顕微鏡観察は重要な蛋白質が削除され、タンパク質の機能に追加の洞察力を提供することができる形態学的変化の監視に使用できます。たとえば、重要な細胞分裂蛋白質の枯渇結果を細線または分岐、細胞成長タンパク質の枯渇が短いまたは円形になる細胞を引き起こす可能性があります一方。ここでは、細胞の成長、ターゲット固有のラベリングおよび微速度顕微鏡観察のためのプロトコルは、細菌植物病原菌アグロバクテリウムを提供しています。一緒に、ターゲット固有の染料と微速度顕微鏡観察に不可欠なプロセスの特性を有効にA. 根頭がんしゅ病菌。最後に、他の細菌に不可欠なプロセスを調査する提供するプロトコルを容易に変更できます。

ターゲット固有の野生型のラベル付けA. 根頭がんしゅ病菌の細胞 その細胞の形態を説明するためには、洗浄の手順または (蛍光塗料を希釈するもの) 1 %dmso による治療によっては影響されません、セルでセルを洗浄後文化 (図 2 a、一番左のパネル) から直接イメージしました1.2 (図 2 a、左のパネル)、または 10 分間 1 %dmso と細胞の培養と細胞 (図 2 a、右側のパネル) を洗浄後に遠心分離。これらのイメージは、形態は洗濯や DMSO の存在によって影響を受けないことを示しています。さらに、細胞の成長は洗濯や成長曲線解析 (データは示されていない) に基づく dmso によって影響されません。さらに、冷たいエタノールA. 根頭がんしゅ病菌</...

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

この顕微鏡ベースのアプローチの全体的な目標は、細菌細胞の成長中の中心的なプロセスを観察することです。この方法により、細菌細胞の増殖と分裂において重要なプロセスがどのように調整されているかなど、細菌学における重要な問題に取り組むことができます。この技術の主な利点は、蛍光試薬を使用して、生細胞内の細菌細胞の表面と構造を視覚化できることです。ここでは、この方法を使用して、Agrobacterium tumefaciensの重要なプロセスに関する洞察を提供します。ただし、このプロセスは、他の細菌の成長を研究するためにも採用できます。まず、滅菌済みの木製スティックまたはピペットチップを使用して、3ミリリットルのATGN Growth Mediumに、A.Tumifaciensの野生型または変異株の1つのコロニーを接種します。摂氏28度、225RPMで一晩で培養します。翌日、分光光度計を使用してOD600を測定します。次に、細胞培養物を約0.2のOD600に希釈し、0.6のOD600まで細胞を増殖させ続けます。1ミリリットルの指数関数的培養物を3本のマイクロフュージチューブに分注します。そして、デスクトップ遠心分離機で細胞を7, 000 x gで5分間ペレット化します。各細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、次に1マイクロリットルのDMSO Orangeストック溶液またはDAPIストック溶液のいずれかを添加します。ピペッティングで穏やかに混合し、再懸濁した細胞を暗所で5分間インキュベートします。7, 000 x gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、余分な試薬を除去するためにPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。次に、細胞をさらに2回洗浄し、ペレットを50マイクロリットルのPBSまたは培地に再懸濁します。同時タイムラプスイメージングを行うには、各処理で採取した10マイクロリットルの細胞を新しいマイクロチューブに組み合わせます。細胞イメージング用のアガロースパッドを調製するには、カバースリップをガイドとして使用し、端にメスを通して22 x 22ミリメートル四方の実験用フィルムをカットします。ラボフィルムの中心から正方形を切り取り、アガロースパッドのガスケットとして機能する約2〜5ミリメートルの境界線を残します。次に、中央の切り欠きを捨てます。フィルムガスケットをスライドガラスに置き、アンモニアとアルコールフリーのクリーナーで洗浄します。また、70°Cに設定されたヒートブロックまたは炎を使用して、フィルムがガラスにわずかに溶けるまでスライドを加熱します。次に、小さなフラスコに約0.075グラムのアガロースと5ミリリットルの培地を混合して、アガロース溶液を調製します。アガロースが溶解して溶液が透明になるまで、周期的に渦巻いて混合するマイクロ波で溶液を加熱します。アガロース溶液を摂氏55〜70度に保ち、48時間以内に複数のアガロースパッドの構築に使用します。温かいアガロース培地をガスケットの中央にピペットで移します。次に、ガスケットの上にカバースリップをかぶせて、アガロースを均等に分散させます。スライドを冷たく水平な面に置き、約2分間固化させます。次に、カバースリップをアガロースパッドから慎重にスライドさせて外し、パッドの表面が乾くまで、アガロースパッドを室温で1〜2分間風乾させます。アガロースパッドの適切な構造は、高品質の画像を取得するために重要です。不良なパッドでイメージを作成しようとしないでください。アガロースパッドが乾燥したり、波紋が開いたり、破れたりした場合は、怠惰にならず、代わりに新しいパッドを作るのが最善です。次に、メスを使用して、アガロースの小さなストリップを取り除き、約2 x 7〜10ミリメートルのエアポケットを作成します。A.Tumefacien細胞はエアポケットの近くで最もよく成長する傾向があります。アガロースパッド上に0.8〜1マイクロリットルの細胞をスポットします。次に、アガロースパッドの上部にカバースリップをそっと置き、パッドの表面全体に細胞を分散させます。長時間のタイムラプスイメージングの場合は、溶かしたValapを使用してカバースリップの端をシールします。カバースリップのすべての端と角に沿ってValapで密封してください。そうしないと、アガロースパッドのタイムラプスイメージング中にドリフトが発生する可能性があります。落射蛍光顕微鏡法を実施するには、目的の対物レンズに液浸油を敷き、逆スライドをステージ上のスライドホルダーに置きます。フォーカシングノブを使用して、細胞に焦点を合わせます。Phase、またはDICと蛍光で、蛍光画像に必要な蛍光フィルターを使用して画像を取得します。オプションで、アガロースパッドのエアポケットに近接する10個の細胞フィールドをランダムに選択することにより、複数のx、y位置を取得します。タイムシーケンス集録を、目的の時間間隔で同相(DIC)でイメージングするように設定します。ここに示すように、遠心分離による洗浄後、細胞を0.1%DMSOでインキュベートした後、培養から直接細胞をイメージングしたところ、DMSOだけでは細胞形態に影響を与えないことが示されました。OrangeおよびDAPIは、A.Tumefaciensの生細胞内のDNAを標識しました。分裂前後期の細胞では、オレンジ染色では2つの異なるヌクレオロイドが観察されますが、DNA標識はDAPI染色でより拡散しているように見えます。このタイムラプス実験では、非標識、DAPI標識、およびオレンジ標識の野生型A.Tumefaciensを同の割合で使用し、位相コントラスト顕微鏡でイメージングするとすべての細胞が増殖し、どちらの染色も細胞増殖を阻害しなかったことが示されました。細胞は、TRITCフィルターを使用した落射蛍光顕微鏡の位相コントラスト下でも増殖しました。しかし、DAPIフィルターで画像化すると、細胞は1時間以内に増殖を停止しました。同様の方法に従って、他の蛍光試薬を使用して細菌の細胞壁または膜を視覚化することもできます。さらに、これらの蛍光色素の多くを組み合わせて、細菌細胞表面の包括的な画像を提供することができます。生きた細菌の本質的なプロセスを可視化することは、条件付き変異体や非モデル細菌におけるこれらのプロセスを研究する可能性を開くため、エキサイティングです。これにより、多様な細菌種の研究を強化することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

出典: Brzozowski, R. S. ほか 細菌の細胞内タンパク質局在および細胞形態変化を調査するための生細胞蛍光顕微鏡法。 J. Vis. Exp.

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単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

学ぶ細菌細胞の成長における重要プロセスの蛍光顕微鏡観察法。Agrobacterium tumefaciensを用いて生細胞の表面構造を可視化し、細胞分裂の調節メカニズムを解明する。

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

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