微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

この顕微鏡ベースのアプローチの全体的な目標は、細菌細胞の成長中の中心的なプロセスを観察することです。この方法により、細菌細胞の増殖と分裂において重要なプロセスがどのように調整されているかなど、細菌学における重要な問題に取り組むことができます。この技術の主な利点は、蛍光試薬を使用して、生細胞内の細菌細胞の表面と構造を視覚化できることです。

ここでは、この方法を使用して、Agrobacterium tumefaciensの重要なプロセスに関する洞察を提供します。ただし、このプロセスは、他の細菌の成長を研究するためにも採用できます。まず、滅菌済みの木製スティックまたはピペットチップを使用して、3ミリリットルのATGN Growth Mediumに、A.Tumifaciensの野生型または変異株の1つのコロニーを接種します。

摂氏28度、225RPMで一晩で培養します。翌日、分光光度計を使用してOD600を測定します。次に、細胞培養物を約0.2のOD600に希釈し、0.6のOD600まで細胞を増殖させ続けます。

1ミリリットルの指数関数的培養物を3本のマイクロフュージチューブに分注します。そして、デスクトップ遠心分離機で細胞を7, 000 x gで5分間ペレット化します。各細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、次に1マイクロリットルのDMSO Orangeストック溶液またはDAPIストック溶液のいずれかを添加します。

ピペッティングで穏やかに混合し、再懸濁した細胞を暗所で5分間インキュベートします。7, 000 x gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、余分な試薬を除去するためにPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。次に、細胞をさらに2回洗浄し、ペレットを50マイクロリットルのPBSまたは培地に再懸濁します。

同時タイムラプスイメージングを行うには、各処理で採取した10マイクロリットルの細胞を新しいマイクロチューブに組み合わせます。細胞イメージング用のアガロースパッドを調製するには、カバースリップをガイドとして使用し、端にメスを通して22 x 22ミリメートル四方の実験用フィルムをカットします。ラボフィルムの中心から正方形を切り取り、アガロースパッドのガスケットとして機能する約2〜5ミリメートルの境界線を残します。

次に、中央の切り欠きを捨てます。フィルムガスケットをスライドガラスに置き、アンモニアとアルコールフリーのクリーナーで洗浄します。また、70°Cに設定されたヒートブロックまたは炎を使用して、フィルムがガラスにわずかに溶けるまでスライドを加熱します。

次に、小さなフラスコに約0.075グラムのアガロースと5ミリリットルの培地を混合して、アガロース溶液を調製します。アガロースが溶解して溶液が透明になるまで、周期的に渦巻いて混合するマイクロ波で溶液を加熱します。アガロース溶液を摂氏55〜70度に保ち、48時間以内に複数のアガロースパッドの構築に使用します。

温かいアガロース培地をガスケットの中央にピペットで移します。次に、ガスケットの上にカバースリップをかぶせて、アガロースを均等に分散させます。スライドを冷たく水平な面に置き、約2分間固化させます。

次に、カバースリップをアガロースパッドから慎重にスライドさせて外し、パッドの表面が乾くまで、アガロースパッドを室温で1〜2分間風乾させます。アガロースパッドの適切な構造は、高品質の画像を取得するために重要です。不良なパッドでイメージを作成しようとしないでください。

アガロースパッドが乾燥したり、波紋が開いたり、破れたりした場合は、怠惰にならず、代わりに新しいパッドを作るのが最善です。次に、メスを使用して、アガロースの小さなストリップを取り除き、約2 x 7〜10ミリメートルのエアポケットを作成します。A.Tumefacien細胞はエアポケットの近くで最もよく成長する傾向があります。

アガロースパッド上に0.8〜1マイクロリットルの細胞をスポットします。次に、アガロースパッドの上部にカバースリップをそっと置き、パッドの表面全体に細胞を分散させます。長時間のタイムラプスイメージングの場合は、溶かしたValapを使用してカバースリップの端をシールします。

カバースリップのすべての端と角に沿ってValapで密封してください。そうしないと、アガロースパッドのタイムラプスイメージング中にドリフトが発生する可能性があります。落射蛍光顕微鏡法を実施するには、目的の対物レンズに液浸油を敷き、逆スライドをステージ上のスライドホルダーに置きます。

フォーカシングノブを使用して、細胞に焦点を合わせます。Phase、またはDICと蛍光で、蛍光画像に必要な蛍光フィルターを使用して画像を取得します。オプションで、アガロースパッドのエアポケットに近接する10個の細胞フィールドをランダムに選択することにより、複数のx、y位置を取得します。

タイムシーケンス集録を、目的の時間間隔で同相(DIC)でイメージングするように設定します。ここに示すように、遠心分離による洗浄後、細胞を0.1%DMSOでインキュベートした後、培養から直接細胞をイメージングしたところ、DMSOだけでは細胞形態に影響を与えないことが示されました。OrangeおよびDAPIは、A.Tumefaciensの生細胞内のDNAを標識しました。

分裂前後期の細胞では、オレンジ染色では2つの異なるヌクレオロイドが観察されますが、DNA標識はDAPI染色でより拡散しているように見えます。このタイムラプス実験では、非標識、DAPI標識、およびオレンジ標識の野生型A.Tumefaciensを同の割合で使用し、位相コントラスト顕微鏡でイメージングするとすべての細胞が増殖し、どちらの染色も細胞増殖を阻害しなかったことが示されました。細胞は、TRITCフィルターを使用した落射蛍光顕微鏡の位相コントラスト下でも増殖しました。

しかし、DAPIフィルターで画像化すると、細胞は1時間以内に増殖を停止しました。同様の方法に従って、他の蛍光試薬を使用して細菌の細胞壁または膜を視覚化することもできます。さらに、これらの蛍光色素の多くを組み合わせて、細菌細胞表面の包括的な画像を提供することができます。

生きた細菌の本質的なプロセスを可視化することは、条件付き変異体や非モデル細菌におけるこれらのプロセスを研究する可能性を開くため、エキサイティングです。これにより、多様な細菌種の研究を強化することができます。