Name: クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法によるマウス骨格筋からの染色質調製プロトコル。機械的ホモジナイゼーションと核精製を用い、ChIPグレードの高品質染色質を得る手法です。筋萎縮症の遺伝子制御メカニズム解明に有用です。

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我々 は特に IGBMC 動物施設のスタッフのスタッフ IGBMC 高スループット シーケンス機能、「フランス Génomique」コンソーシアム (ANR10-INBS-09-08) のメンバー、IGBMC のすべての一般的なサービスをありがちましょう。この作品は、CNRS、INSERM、AFM、リーグ国立 contre le 癌からの補助金によって支えられた、フランスの国営ラベル ANR-10-アイデックス-0002-02、Labex INRT ANR-10-アイデックス-0001-02 Investissements d'Avenir プログラムの下で ANR を通じて基金とANR-AR2GR-16-CE11-009-01。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。S.J にミニステール デ期リーグ国立 contre le 癌と ANR-AR2GR-16-CE11-009-01、V.U によって支えられらデ ラ凝った。ID は 'デフランス labellisée' リーグのナシオナル contre le がんです。

マウスは、ケアおよび実験動物の使用に関する制度のガイドラインに従い、国立動物診療ガイドライン (欧州委員会指令 86/609/CEE; に従って保たれました。フランス語令 no.87 848)。フランス国民の倫理委員会で承認されたすべてのプロシージャ。
 1 です。 筋肉組織分離 頚部転位によって <ol><li>犠牲 1 つアダルト 6 に 8 週齢マウス。Sterlise 70% エタノールで洗浄によって肢細かい点はさみと鉗子を使用して後肢の筋肉 (大腿四頭筋腓腹筋、脛骨前方) を解剖と 。
	注: 1 つのマウスの組織の約 500 mg をもたらすべきである</li>。
	<li>1 mL の小型の同種の準備に冷たい低張性バッファーを含む 2 mL 試験管に筋肉をミンチ (&#60; 2-3 mm 3) を使用して個はさみの罰金し、5-10 分のための 4 ° C でベンチ トップ アジテーターに関する振動管を残す</li>
</ol> 2。組織溶解 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
<ol><li>14 mL 丸底チューブにホモジュネートを転送し、5 mL の冷たい低張性バッファー (EDTA 無料プロテアーゼ抑制剤のカクテルそして PMSF) で再懸濁します。
	<ol><li>Homogenise 14 mL の丸底チューブに 15-30 秒の緩い dounce (3 分以内 20 30 ストローク) または機械的組織ホモジナイザーを使用してみじん切りにした筋肉組織 。
		注: この段階では光学顕微鏡検査によって評価される換散の効率と追加の中断を行うことが必要な場合です</li>。
	</ol></li> <li>15 mL チューブに磨砕液を転送し、冷たい低張性バッファーを使用して 10 の mL にボリュームを埋めます。次のマウスに進む前に以下のように磨砕液を修正します</li>。
</ol> 3。固定 <ol><li>ホルムアルデヒドを最終濃度が 1% に加え、室温で 10 分間振る</li>。
	<li>固定と室温で 5-10 分間揺れを停止する各管で 0.125 M の最終的な集中にグリシンを追加します</li>。
</ol> 4。核の準備 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
<ol><li>Homogenise 固定ライセート使用緩い dounce (5 〜 10 ストローク).
	<ol><li>核および細胞残骸を取得する 15 mL チューブ 1,000 x g で 4 ° C で 5 分間遠心し転送します</li>。
	</ol></li> <li>上澄みを除去し、5 mL の新鮮な低張バッファーでペレットを再懸濁します。70 μ m 携帯こし器を通って 50 mL のチューブに液をフィルターします。再濾液を 40 μ m セル ストレーナー フィルターします</li>。
	<li>は、核のペレットを取得する 4 ° C で 5 分間 15 mL チューブ 1,000 × g で遠心分離し濾液を転送します 。
	注: この段階で核することができますがすぐに超音波処理、またはスナップ乾燥ペレットとして液体窒素で凍結し、-80 に格納されている ° C</li>
</ol> 5。超音波 <ol><li>核ペレット (機械と dounce の両方の均質化のため約 50 μ L) の容積を査定するパックされた核容積の 4 回に 3 まで超音波処理バッファーでそれを再懸濁し、超音波、超音波発生装置を使用しての 4 ° C で 10-15 分の。 
	注: クロマチン (6) 下記のとおりただちに分析または凍結して格納できます-80 で ° C</li>
</ol> 6。次の超音波クロマチンのフラグメント サイズを評価する 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
<ol><li>デ-架橋、クロマチンの 30 μ L を 1.5 mL の試験管に取る 5 M 20 μ L を追加し、塩化ナトリウム。500 μ L にボリュームを完了し、65 ° C で一晩インキュベートします。
	<ol><li>次の日、処理を 1 μ L, プロテイナーゼ K を (20 mg/mL 在庫)、42 ° C 実行フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出で 1 時間 0.5 M の EDTA の 10 μ L 2 M トリス pH 6.8, および 10 μ とナトリウムの acetat の 1 つのボリュームで DNA を沈殿させるe (3 M) と 1 時間-80 ° c または-20 で一晩 100% エタノールの 2 つの容積 ° C</li>
	</ol></li> <li>13,500 x g で 15 分間、上清をデカントでの遠心分離で DNA をペレットし冷たい 70% エタノールや 5 分上清をデカント、再び遠心分離で徹底的にペレットを洗浄し、ペレットを風乾します</li>。
	<li>は、TE バッファーの元のボリューム (30 μ L) でペレットを再懸濁します。260 nm/280 nm の吸光度によって分光光度計で DNA 濃度を測定します。クロマチンのフラグメントのサイズを評価するために電気泳動を行いピペットの 1.5% の agarose のゲルの別のレーンに DNA のサイズの梯子とともに DNA の 500-1,000 ng 。
	注: フラグメント サイズは 200-500 塩基対の間にする必要があり、対応するまたは悪い-断片化されていない DNA 検出の高分子量フラグメントはないはず。クロマチン ソリューション (手順 5) の長い時間再超音波し、再分析が最適なサイズになるまで上記のようことが必要な場合です</li>。
</ol> 7。クロマチン免疫沈降 (チップ) 注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください。
早かった 1 mL のエタノールで 50% スラリーによる <ol><li>蛋白質 G ブロック セファローズ ビーズ。ペレット、ベンチトップで 1 分間 400 × g で遠心分離によるビーズ遠心 400 x g で TE バッファー遠心の 1 mL で洗いし、ワシントンを繰り返す
	<ol><li>酵母 tRNA (在庫 10 mg/mL) の 2 回目の遠心分離、BSA (株式 20 mg/mL) の 25 μ L で希釈バッファーを内蔵の 1 mL に再停止と 20 μ L 後。4 回転 (40-60 rpm) によって、少なくとも 2 h 使用する前にビーズをブロック ° C</li>
		<li>クロマチン (手順 5) の希釈 50 μ g 8 〜 10 回チップ希釈バッファーを使用しています。ブロック ビーズ スラリーの 50 μ L を追加し、4 回転 (40-60 rpm) 2 時間インキュベート ° C. 遠心済みクリア クロマチンを取得して新鮮なチューブに移転 4 ° C で 400 x g で</li>。
	</ol></li> <li>免疫沈降、一次抗体 (例えば クロマチンの 10 μ g あたり 1-2 μ g) の適切な量を追加し、4 回転で一晩インキュベート ° C 
	注: 最適な抗体の量は製造業者によって推薦されるかもしれないまたは最適な濃縮が観察されるまでさまざまな量の抗体を持つチップ qPCR を実行することによって、経験的に決定できます。蛋白質 G セファローズ可能性があります使用される抗体のサブタイプによって蛋白質 A セファローズに置き換えることも</li>。
	<li>次の日ブロック ビーズを追加し、4 回転 (40-60 rpm) で 1 時間インキュベート ° C. 遠心ビーズをペレット、上清を除去し、チップを開始する 20-30 s の 400 x g で洗うです</li>。
	<li>チップの洗浄: バッファーが次の洗浄を実行: 低塩バッファーに一度し LiCl バッファーで 2 回、高の塩バッファーで 2 回、そして TE バッファーで 2 回。
	<ol><li>4 ° c (40-60 rpm) 回転で 10 分間各洗浄を行い、ベンチトップ遠心分離機で 20-30 s の 400 × g で遠心分離によって洗うたび間ビーズをペレットします</li>。
	</ol></li> <li>溶出、削除最後の洗浄と揺れながら室温で 15 分間 (新鮮な) 250 μ L 溶出バッファーのビードを再懸濁します</li>。
	<li>遠心分離機 x g と収集新鮮なチューブで溶出液 400 で。この 2 回のステップを実行して実行・ デ ・架橋溶出液 20 μ L NaCl 5 M と 1 μ L RNase A で一晩 (10 mg/mL)、扱うプロティナーゼ K のあり、フェノール/クロロホルム クロロホルム バキューム手順 6 のように行動します</li>。
	<li>TE バッファーの 50 μ L で再懸濁します、チップの品質をチェックする標準プロトコル 15 に従ってチップ qPCR の因数を使用します</li>。
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
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<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
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<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
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<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここでアダルト マウス骨格筋このクロマチンは筋線維核内転写因子結合と共有結合のヒストンの修正を検出チップ実験に適しているショーからクロマチンを準備するための新しいプロトコルについて述べる。このプロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。最初の dounce または機械的剪断によって実行することができます組織混乱です。機械的剪断はより速くより再現性の高い、したがって選択法。それにもかかわらず、適切な装置が利用できない場合混乱をまた実行 douncing、固定の手順に進む前に、顕微鏡下での換散の効率の評価を勧めによってできます。単離核の固定ではなく、全体組織ライセートの固定小さいボリュームで、短期間のより再現可能な超音波処理を許可しました。また、前述のトマスらによって選んだ中断前に組織を修正するのではなく、中断の後 lysates を修正するには10組織をあらかじめ固定均質化の減らされた効率で起因しました。機械的剪断に基づくこのプロトコルも提案など他のソリューション、コラゲナーゼの消化力、37 ° C8時解剖組織の長期培養...

クロマチン免疫沈降 (チップ) の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に結合し、転写を研究する選択の方法と様々 な組織における遺伝子発現のエピジェネティック制御高スループット シーケンス (チップ seq) となっています。細胞タイプ1。この技法は、ゲノムは共有結合性クロマチン修飾ヒストン バリアントの占有率、転写因子結合2,3プロファイリングできます。
培養細胞からチップを実行することが確立している哺乳類動物組織からチップのままより困難です。チップのクロマチンを準備、組織切片・細胞の種類ごとに最適化が必要ないくつかの重要な手順が含まれます。クロマチンは、培養細胞の細胞の溶解液や、原子核の次の浄化から用意できます。哺乳類ティッシュの場合効率的な換散、ホルムアルデヒド固定および核の精製は、クロマチンの最適な回復を確保するために重要です。また、その浄化の前後に核を修正するかどうかの選択は実験的に決定します。これらの障害にもかかわらず、肝臓、精巣、または脳4,5,6などの組織からチップに正常に行われています。骨格筋の場合このような物理的に抵抗力がある組織、構造タンパク質の含有量が高いと核の分離を表わすは特に困難です。この特異性を考えると、他の組織のために最適化されたプロトコルを与えない満足のいく結果骨格筋の。
ここで物理的に破壊組織、ホルムアルデヒド固定し核と超音波処理の分離を含むマウス骨格筋組織からチップ グレード クロマチンを分離するプロトコルについて述べる。様々 な転写因子や RNA ポリメラーゼ II、コバレントマテリアルのヒストンの修正7の qPCR チップとチップ seq を実行することによってこの組織からチップに適したクロマチンを準備するこの手法の有効性を示した.
この新しい技術が以前に報告されたプロトコル8時間、転写因子のゲノムのローカライゼーションの変更中に長いコラゲナーゼ消化手順を構成するよりもはるかに高速と遺伝子発現の変化が起こるかもしれない。速さを核隔離され、固定は、ここで説明する方法をより忠実にネイティブのゲノムの占有状態をキャプチャするクロマチンを準備する特に魅力的になります。また、筋肉組織からクロマチンの分離または蛋白質の抽出のための他の方法が記述されている8,9,10され選択した遺伝子、チップ seq チップ qPCR 実験用データは、それらを使用して報告されています。ここで報告メソッドは転写因子やヒストン変更チップ seq に適した、それゆえ必要があります 3/4 C や HiC クロマチン構造キャプチャ ・ アプリケーションに適しても。

<table><tbody><tr><td>T 25 デジタル ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル-EDTA フリー</td><td>ロシュ診断</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン G セファロース ビーズ</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド EMグレード</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミル アルコール 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td>sigma-aldrich chimie</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲンブルー</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP 抗体</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220焦点超音波処理装置</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他のアイテム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルーズダウンス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mlと50mlのファルコンチューブ14ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丸底チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mlと2mlエッペンドルフチューブ70</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu;m と 40 &mu;m細胞ストレーナー(コーニング)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

成体マウス骨格筋構造蛋白質の含有量が高い物理的に抵抗性組織からクロマチンの準備のための効率的かつ再現性のあるプロトコルについて述べる。大人のマウスから切り裂かれた四肢の筋肉物理的、機械的均質化またはミンチと細胞ライセートのホルムアルデヒド固定前に低張性バッファー内の douncing の組み合わせによって中断されます。固定の核は機械的均質化または douncing 細胞の残骸を削除する連続ろ過のさらなるサイクルによって精製しました。精製された核は、すぐに、後の段階で凍結後する超音波に処理できます。クロマチンが効率的に超音波処理および転写因子、RNA ポリメラーゼ II、および共有結合のヒストンの修正のプロファイルによって示されているように、クロマチン免疫沈降実験に適した取得します。このプロトコルにより作製したクロマチンを使用して検出されたバインディング イベントは、主に筋線維核クロマチン繊維関連の他の衛星と血管内皮細胞からの存在にもかかわらずで行われているものです。このプロトコルはそのため成体マウスの骨格筋における遺伝子発現制御の研究に適応です。

核を分離するには、18,000 と 22,000 の rpm (材料の表を参照) で、15 または 45 s のため解剖とみじん切りにした筋肉組織の力学的均質化を行った。すべての条件で核組織破片から分けることができるが、収率は低い速度 (図 1 aB) を使用して最適です。核は、3-5 分 (図 1 aと示されていないデータ) の douncing によってまた準備でしたが 15 ほどで核の最適な収穫が得られる、機械的均質化選択の方法である s、特に場合は、時間の重要な利得を許可します。複数のサンプルがなければならない (図 1 b) を処理します。使用してこのプロトコル 2.7 × 10 する組織 (1 マウスの組織に相当) の 500 mg から7核はクロマチンの 100 μ g を生成する分離できます...

クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

この手順の全体的な目標は、成体マウスの骨格筋からクロマチンを調製することです。この方法は、遺伝子調節と骨格筋線維の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウス骨格筋からChIPグレードのクロマチンを調製できることです。構造タンパク質を多く含む物理的に耐性のある組織。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、マウス骨格筋線維のDNA結合部位であるグルコ関節受容体の同定を必要とする、グルコ関節使用筋萎縮症の根底にある分子メカニズムを解明しようとしていたときでした。その手順を実演するのは、当研究室のポスドクであるShilpy Joshiです。この手順を開始するには、凍結または解剖したばかりの後肢の筋肉を回復します。その後、細かいはさみを使用して、1ミリリットルの氷冷低張緩衝液を含む2ミリリットルの試験管で筋肉をミンチし、小片を均質に調製します。その後、ベンチトップの攪拌機でチューブを4°Cで5〜10分間振ったままにします。次に、解剖した組織を、4ミリリットルの冷たい低張緩衝液を含む14ミリリットルの丸底チューブに移します。機械的な組織ホモジナイザーを使用して、15〜30秒間、ミンチ組織を均質化します。その後、ホモジネートを15ミリリットルのチューブに移します。冷たい低張緩衝液を添加して10ミリリットルのサンプルが得られ、ホモジネートを固定してから次のマウスに進みます。この手順では、ホルムアルデヒドをサンプルに加えて、最終濃度が1%になるようにします。その後、室温で10分間振とうします。次に、グリシンを添加して各チューブの最終濃度を0.125モルにし、固定を停止します。そして、室温で5〜10分間振とうします。その後、ルーズドウンスを使用して、固定ライセートを均質化します。その後、15ミリリットルのチューブに移し、1000gで摂氏4度で5分間遠心分離し、核と細胞の破片を得ます。5分後、上清を取り除き、ペレットを5ミリリットルの新鮮な低張緩衝液に再懸濁します。.ライセートを70μmのセルストレーナーでろ過し、50ミリリットルのチューブに入れます。ピペットチップを使用して、フィルターを1ミリリットルの冷たい低張緩衝液で洗浄します。その後、40マイクロメートルのセルストレーナーでろ液を再ろ過します。その後、濾液を15ミリリットルのチューブに移します。そして、1000gで摂氏4度で5分間遠心分離し、核ペレットを得ます。上清を捨てた後、1ミリリットルの低張緩衝液を使用して3つのペレットをプールし、1.5〜2ミリリットルのチューブに移します。.1000 gで5分間遠心分離します。次に、既知の量の液体を含むチューブと比較して核ペレットの体積を評価し、それを充填された核体積の最大3〜4倍まで超音波処理緩衝液に再懸濁します。その後、超音波処理器を使用して、懸濁液を摂氏

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。...

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。...

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

我々は、超遠心分離の必要性を排除した、架橋マウス骨格筋から高品質の核を単離するための濾過ベースのプロトコールを提示し、容易に適用することができる。本発明者らは、核から調製されたクロマチンが、クロマチン免疫沈降およびクロマチン免疫沈降配列決定研究に適していることを示す。...

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR...

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ)...

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。...

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&amp;RUN)。...

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&amp;RUN解析のための効率的なプロトコール

学ぶクロマチン免疫沈降法によるマウス骨格筋からの染色質調製プロトコル。機械的ホモジナイゼーションと核精製を用い、ChIPグレードの高品質染色質を得る手法です。筋萎縮症の遺伝子制御メカニズム解明に有用です。

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

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