クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

この手順の全体的な目標は、成体マウスの骨格筋からクロマチンを調製することです。この方法は、遺伝子調節と骨格筋線維の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウス骨格筋からChIPグレードのクロマチンを調製できることです。

構造タンパク質を多く含む物理的に耐性のある組織。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、マウス骨格筋線維のDNA結合部位であるグルコ関節受容体の同定を必要とする、グルコ関節使用筋萎縮症の根底にある分子メカニズムを解明しようとしていたときでした。その手順を実演するのは、当研究室のポスドクであるShilpy Joshiです。

この手順を開始するには、凍結または解剖したばかりの後肢の筋肉を回復します。その後、細かいはさみを使用して、1ミリリットルの氷冷低張緩衝液を含む2ミリリットルの試験管で筋肉をミンチし、小片を均質に調製します。その後、ベンチトップの攪拌機でチューブを4°Cで5〜10分間振ったままにします。

次に、解剖した組織を、4ミリリットルの冷たい低張緩衝液を含む14ミリリットルの丸底チューブに移します。機械的な組織ホモジナイザーを使用して、15〜30秒間、ミンチ組織を均質化します。その後、ホモジネートを15ミリリットルのチューブに移します。

冷たい低張緩衝液を添加して10ミリリットルのサンプルが得られ、ホモジネートを固定してから次のマウスに進みます。この手順では、ホルムアルデヒドをサンプルに加えて、最終濃度が1%になるようにします。その後、室温で10分間振とうします。

次に、グリシンを添加して各チューブの最終濃度を0.125モルにし、固定を停止します。そして、室温で5〜10分間振とうします。その後、ルーズドウンスを使用して、固定ライセートを均質化します。

その後、15ミリリットルのチューブに移し、1000gで摂氏4度で5分間遠心分離し、核と細胞の破片を得ます。5分後、上清を取り除き、ペレットを5ミリリットルの新鮮な低張緩衝液に再懸濁します。.ライセートを70μmのセルストレーナーでろ過し、50ミリリットルのチューブに入れます。

ピペットチップを使用して、フィルターを1ミリリットルの冷たい低張緩衝液で洗浄します。その後、40マイクロメートルのセルストレーナーでろ液を再ろ過します。その後、濾液を15ミリリットルのチューブに移します。

そして、1000gで摂氏4度で5分間遠心分離し、核ペレットを得ます。上清を捨てた後、1ミリリットルの低張緩衝液を使用して3つのペレットをプールし、1.5〜2ミリリットルのチューブに移します。.1000 gで5分間遠心分離します。

次に、既知の量の液体を含むチューブと比較して核ペレットの体積を評価し、それを充填された核体積の最大3〜4倍まで超音波処理緩衝液に再懸濁します。その後、超音波処理器を使用して、懸濁液を摂氏4度で10〜15分間超音波処理します。超音波処理したサンプルを遠心分離し、クロマチン上清を新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。

架橋を解除するには、1.5ミリリットルの試験管に30マイクロリットルのクロマチンを取り、20マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムと450マイクロリットルの水を追加します。容量を500マイクロリットルまで完成させ、摂氏65度で一晩インキュベートします。翌日、1マイクロリットルのプロテイナーゼK、10マイクロリットルのpH 6.8の2モルトリ、10マイクロリットルの0.5モルEDTAで摂氏42度で1時間治療を行います。

次に、通常のフェノール-クロロホルムクロロホルム抽出を行い、1容量の酢酸ナトリウムと2容量の100%エタノールでDNAをマイナス80°Cで1時間、またはマイナス20°Cで一晩沈殿させます。次に、13,500gで15分間遠心分離することによりDNAをペレット化する。上清をデカンタントし、ペレットを冷たい70%エタノールで十分に洗浄し、再度5分間遠心分離します。

次に、上清をデカントし、ペレットを風乾します。その後、ペレットを元の容量のトリスHCl EDTAバッファーに再懸濁します。分光光度計で260ナノメートル、280ナノメートルの吸収剤でDNA濃度を測定します。

続いて、500〜1000ナノグラムのDNAを、DNAサイズのはしごとともに1.5%アガロースゲルの別々のレーンにピペットで移します。また、電気泳動を行って、クロマチンのフラグメントサイズを評価します。最適化するために、均質化は 18, 000 RPM と 22, 000 RPM の 2 つの速度で 15 秒または 45 秒間行われました。

すべての条件で、核は組織破片から分離できましたが、収率は低速で最適でした。原子核は、3〜5分間ダウンスすることによっても調製できます。しかし、機械的な均質化は、わずか15秒で核の最適な収率を達成できるため、特に複数のサンプルを処理する必要がある場合に大幅な時間短縮を可能にするため、選択可能な方法です。

このプロトコルを使用すると、500ミリグラムの組織から最大2.7倍10〜7個の核を単離して、100マイクログラムのクロマチンを生成できます。この方法で調製したクロマチンは、ChIPシーケンシング実験においてクリーンで高品質な結果をもたらします。これは、筋肉発現デズモンド遺伝子座におけるヒストンH3およびRNAポリメラーゼ2のアセチル化K27の高レベルによって示されるように。

筋線維の特異性は、筋肉で発現していないPecam1およびVcam1遺伝子座でのシグナルが低いか存在しないことによって示されます。この手順を試行する際には、ホモジナイザープローブをサンプルに適切に浸して泡立ちを防ぎ、サンプル間でプローブを洗浄し、クロマチン断片化を最適化することが重要です。この方法で調製されたクロマチンは、ChIPのためにゲノム全体の転写因子占有率をマッピングするために成功裏に使用されており、クロマチン確認捕捉技術にも適しているはずです。

開発後、この技術は、マウスの骨格筋の遺伝子制御を探求するゲノミクス分野の研究への道を開きました。この手順は、ラットの筋肉や人間の患者の生検にも適用できます。このビデオを見れば、機械的均質化の使用方法と、その後のホルムアルデヒド固定核の精製方法、免疫沈降のための骨格筋からのクロマチン調製方法について十分に理解できるはずです。

ホルムアルデヒド、フェノール、クロロホルム、プロテイナーゼKの取り扱いには危険が伴うことを忘れないでください。手袋や眼鏡の着用などの予防策を講じる必要があります。これらの試薬を含む手順は、フードの下で実行する必要があります。