浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

この複合分析手法の全体的な目標は、細胞内の分泌小胞が細胞外浸透圧などの物理的な力にどのように反応するか、およびこれらのオルガネラの調整がエキソサイトーシスプロセスにどのように影響するかについての情報を提供することです。この方法は、分泌小胞が細胞外環境の変化や薬物治療にどのように直接反応するかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。このアプローチの主な利点は、生細胞の小胞含量に対する直接的な影響をモニターし、エキソサイトーシスの治療前と治療後のそれらのreh-chemical-ed放出の変化を区別することを知ることです。

平らなディスク電極表面を得るには、電極をマイクログラインダーのホルダーに置き、各炭素繊維電極を45度の角度で面取りします。その後、エキソサイトーシス測定のために電極を細胞の近くに配置するときに、ディスク電極表面を45度の角度で配置する方法の将来の参照のために、キャピラリーに印を付けます。単一細胞でアンペロメトリック記録を行うには、面取りしてテストしたばかりのカーボンファイバーディスク微小電極を、ポテンショスタットとともに使用されるヘッドステージの電極ホルダーに取り付けます。

使用する前に、各炭素繊維微小電極を試験溶液に入れ、サイクリックボルタンメトリーを使用して研究状態の電流を監視します。サイクリックボルタンメトリースキャンでは、100ミリボルト/秒で銀-塩化銀参照電極に対して負の0.2ボルトから正の0.8ボルトまでの三角形の電位波形を適用して、良好な反応速度を確保します。エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録には、培養クロム親和性細胞を入れたペトリ皿を等張バッファーに入れ、ファラデーケージ内の倒立顕微鏡で

顕微鏡の加熱ステージを使用して、細胞実験中を摂氏37度に保ちます。次に、低ノイズパッチクランプ装置を使用して、作用電極に正700ミリボルトの定電位を印加します。クロム親和性細胞のエキソサイトーシスを記録するには、10 キロヘルツでシグナルをデジタル化し、2 キロヘルツの内部ローパスベッセルフィルターを適用して記録されたシグナルをフィルタリングします。

楕円形のディスク電極は、セルの上に平らに配置し、ペトリ皿の表面と平行に配置する必要があることに注意してください。また、電極は実験当日に面取りを行い、電極表面をきれいに保ちます。細胞のエキソサイトーシスを刺激するには、5ミリモルの塩化バリウム溶液を充填したガラス製マイクロピペットを、細胞から少なくとも20マイクロメートルの距離に置きます。

次に、細胞の表面に5ミリモル塩化バリウム溶液の5秒間の注射パルスを印加して、細胞のエキソサイトーシスを刺激します。ステムピペットを溶液に入れ、アンペロメトリック電流過渡現象を約3分間記録しながら、バリウム注入パルスを印加することにより、細胞エキソサイトーシスを刺激します。等張性条件と高張性条件でのエキソサイトーシス応答を比較するには、細胞を高張緩衝液で10分間インキュベートします。

その後、バリウム注入パルスを印加してエキソサイトーシスを刺激し、3分間のアンペロメトリック記録を行います。細胞の可逆的応答のために、細胞をアイソトニック緩衝液中で10分間再度インキュベートします。バリウム注入パルスを適用して細胞を刺激し、エキソサイトーシス応答を3分間記録します。

小胞の定量的サイズ測定用の電極を作製するには、直径5マイクロメートルの炭素繊維電極を準備します。顕微鏡で、ガラスの先端から伸びている炭素繊維をメスで切断し、30〜100マイクロメートルだけが残るようにします。ブタン炎を使用して、炭素繊維電極の火炎エッチングされた先端を準備します。

電極先端を円筒形に均一にエッチングするには、円筒形の炭素繊維電極を回転させながら保持します。そして、ガラスから伸びる炭素繊維をブタン炎の青い端に、炭素の先端が赤い色になるまで置きます。火炎エッチング後、電極を顕微鏡下に置いて電極先端を評価します。

エッチングされた電極の先端サイズは、直径が約50〜100ナノメートルである必要があります。次に、円筒形のナノチップ微小電極をエポキシ溶液に3分間挿入し、続いて電極チップをアセトン溶液に15秒間浸します。これにより、エポキシは炭素繊維と絶縁ガスキャピラリー壁との間の電位ギャップスペースをシールすることができます。

アセトンはエッチングされた炭素繊維電極表面からエポキシを取り除きます。エポキシを硬化させるには、電極をオーブンで摂氏100度で一晩焼きます。使用する前に、サイクリックボルタンメトリーを使用して各炭素繊維微小電極の定常電流をテストしてください。

実験には、1.5〜2.5ナノアンペア程度のプラトー電流を示す電極のみを使用してください。細胞内アンペロメトリー測定では、細胞を顕微鏡下に置き、ポテンショスタットの同じ実験設定を使用します。細胞への重大な物理的損傷を防ぎます。

ナノチップの円筒形微小電極を、穏やかな機械的な力を加えて細胞に挿入します。マイクロマニピュレータを使用して、電極を細胞原形質膜を通って細胞細胞質に押し込むのにちょうど十分です。挿入後、細胞膜を円筒形電極の周囲に密閉した状態で、生細胞でアンペロメトリック記録をその場で開始します。

電極に加わった酸化電位では、小胞が電極表面に吸着し、確率的に破裂します。したがって、このプロセスを開始するためにいかなる種類の刺激も必要ありません。小胞の量子サイズに対する浸透圧効果を決定するには、実験条件を使用して等張バッファーおよび高張バッファーでインキュベートした細胞群から細胞内サイトメトリー測定値を収集します。

エキソサイトーシス活性に対する細胞外浸透圧の影響は、クロム親和性細胞が等張性、次に高張性、そして最後に等張性条件下でバリウム溶液で刺激された場合のエキソサイトーシスイベントの頻度として表されます。このデータは、浸透圧ストレスを受けている細胞でのエキソサイトーシス活性の阻害を示しており、細胞が等張環境に戻った後に部分的な回復を達成できることが示されています。対照実験は、等張条件のクロム親和性細胞で3回連続してバリウム刺激を行った後のエキソサイトーシスイベントの頻度を示しています。

これは、これらの実験で使用された時間枠内での複数のバリウム刺激が、連続的な細胞刺激によるエキソサイトーシス活性の低下を引き起こしていることを示しています。このビデオを見た後、分泌小胞とエキソサイトーシスプロセスが細胞外環境の変化によってどのように影響を受けるかを比較できるこれらの補完的な分析方法を実行する方法について十分に理解しているはずです。