Name: 浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ浸透圧ストレスが分泌小胞とエキソサイトーシスに及ぼす影響。クロマフィン細胞を用いた電気化学的手法と透過型電子顕微鏡法で、神経伝達物質放出の動態をリアルタイムに監視する手法を解説します。

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著者は、スウェーデン研究評議会 (349-2007-8680) 資金調達のため、Dalsjöfors コットツーク AB (Dalsjöfors、スウェーデン) ウシ副腎の寄付に感謝したいと思います。

1. 副腎から酵素消化によって牛クロム親和性細胞の培養
<ol><li>採集されたウシ副腎髄質細胞を分離するには、細胞 70% エタノール溶液を滅菌します。離れて脂肪と結合組織をメスを使用してトリミングします。血液を削除するには、37 ° c. に恒温されているロックのソリューション (塩化ナトリウム 154 mM、KCl 5.6 mM、NaHCO3 3.6 ミリメートル、ヒドロキシエチル piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) ph 7.4 5.6 mM) を使用して副腎静脈をすすいでください。</li>
	<li>組織を消化するため暖かい無菌ろ過 0.2% コラゲナーゼ P ソリューション副腎静脈注射器を使用しての約 2.5 mL を注入することにより各腺をふくらませ、37 ° C で 20 分間組織を孵化させなさい髄質の消化プロセスが完了したことを確認するために腺を調べます。組織には、ソフトでない緊張を感じるはずです。</li>
	<li>長手方向に腺を離れて切り取ることによる消化の延髄を収集します。メスを使用して髄質のティッシュをミンチします。鋼のふるい上組織懸濁液をフィルター処理し、コラゲナーゼ p. の活動を減らすために容積で約 50 mL にロックのソリューションで希釈</li>
	<li>室温で 10 分間遠心分離機で 300 x g で細胞のペレット 50 mL 滅菌試験管に収集しています。20 mL ロックのソリューションで得られたペレットを再停止し、チューブに滅菌 100 μ m ナイロン メッシュ ソリューションをフィルターします。</li>
	<li>滅菌 Percoll (1:1) とクロム親和性細胞懸濁液を混合し、室温で 20 分間 18,600 x g で細胞液を遠心分離します。密度勾配の最上層を収集し、ソリューションをチューブに 100 μ m ナイロン メッシュ フィルターします。</li>
	<li>Percoll を除外すると、再ロックのソリューションにペレットを中断する前にロックのソリューションと 300 x g で室温で 10 分間遠心する細胞懸濁液を希釈します。孤立した細胞懸濁液の推定の細胞密度は約 400 万セル/mL です。</li>
	<li>分泌と細胞内フローサイトメトリー測定電流記録、プレート髄質細胞コラーゲン IV の約 17.5 × 103セル/cm2の密度で 60 mm プラスチック製の食器をコーティングし、5% CO2の 37 ° C で細胞をインキュベート環境。細胞培養の 1-3 日以内電気化学の実験を実行します。</li>
	<li>TEM のイメージング実験、プレート 75 cm2細胞培養フラスコ フラスコあたり 700 万セルの密度でのクロム親和性細胞と 1 日 37 ° c 5% CO2環境で孵化させなさい。</li>
</ol>2. 単一のセル エキソサイトーシス アンペロメトリー実験24
<ol><li>これらの実験のための炭素繊維電極を作製するには、これらの実験で使用される頭の段階で電極ホルダーに適した外径のキャピラリーのガラスを取る。1.2 mm の外径と内径 0.69 mm のホウケイ酸ガラス管を使用します。<ol>
<li>水吸引チューブ毛細血管の先の 1 つに接続します。ホワイト ペーパー、可視化を強化する部分など、何かに 5 μ m 径のカーボン繊維を配置します。</li>
		<li>単一炭素繊維を識別し、毛細血管のオープン エンドの位置づけが炭素繊維の自由な端への近さの場所に炭素繊維を維持する指の 1 つの端の繊維を押しします。炭素繊維は、毛細血管の両端を通って突き出るようにそっとガラス管に炭素繊維を吸引します。吸引力を離れて移動します。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロ ピペットの引き手に炭素繊維と毛細血管を配置、2 つの独立したガラスのピペット チップにガラスの毛管を引き出します。2 枚のガラスのチップ間接続されている炭素繊維を切断するには、炭素繊維をカットして、2 つの炭素繊維電極はさみのペアを使用します。</li>
	<li>顕微鏡で繊維はメスを使用してガラス毛細管塗布から拡張してどこの端カーボン繊維の手動切断ができる厚い顕微鏡スライド上に炭素繊維を配置します。</li>
	<li>ガラス コーティング炭素繊維先端を残して、炭素繊維を切断した後 10 分間エポキシをプルアップし、炭素繊維と周囲のガラスの間の任意の可能なオープン スペースをシールするエポキシ ソリューションに電極先端部の数 mm を挿入します。電極の先端に形成からかさばるの接着剤の低下を防ぐためにエポキシ ソリューションからゆっくりと電極を持ち上げます。</li>
	<li>電極をアタッチできる両面粘着耐熱テープでホルダー (例えば、フラット棒) 電極を配置します。100 ° C のオーブンで一晩処理エポキシ電極を焼くヒント簡単に中断する場合は、サーフェスと接触する電極は電極をように常に安全に保存されて電極は固定されています、ヒントでは触れられることはリスクはホルダーを使用して。</li>
	<li>平らなディスク電極表面を得るためには、microgrinder のホルダーに電極を配置および 45 ° の天使に各炭素繊維電極をベベルします。べべリ ン グ後、永久的なマーカーを使用して、後で開口放出測定用細胞の近くに電極を配置するときに 45 ° の角度でディスク電極表面を見つける方法を知っているその表面毛細血管をマークします。 注: この手順はこれらの実験のように重要な楕円形ディスク電極はフラット ペトリ皿の表面に平行な表面のセルの上に配置する必要があります。また、面取り電極は、新鮮できれいな電極表面をことを確認するための実験と同じ日に行われます。</li>
	<li>使用前に循環ボルタンメトリーを用いる現在の定常状態を監視する (例えば、PBS バッファー (pH 7.4) の 0.1 mM ドーパミン) テスト ソリューションの各炭素繊維電極を配置します。サイクリックボルタンメトリー スキャン適用三角形の潜在的な波形-0.2 0.8 V に V から取得する良い反応速度データを確保するため 100 mV/秒で銀/塩化銀参照電極対が 5 μ m 径ディスクの理論的に計算される値と一致して炭素繊維電極25。</li>
	<li>エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録、倒立顕微鏡上にクロム親和性細胞をシャーレに配置します。録音、測定されている非常に小さな電流で誘導される電流中に電子ノイズを除去するためにファラデーケージとセットアップ顕微鏡をシールドすることが重要です。細胞実験中に 37 ° C の温度を維持するためにステージを加熱顕微鏡を使用します。</li>
	<li>低騒音パッチ クランプ計測器を使用して 700 の潜在的な定数を適用する作用電極からシャーレにも配置されている銀/塩化銀参照電極に対して作用電極で mV。記録クロム親和性細胞の開口放出、10 kHz の信号をデジタル化し、内部ローパス 2 kHz の記録された信号をフィルターでベッセル フィルターを適用します。</li>
	<li>アンペロ メトリック単一細胞記録を実行するには、電気化学測定装置で使用されるヘッド ステージの電極ホルダーに新鮮な面取り及びテスト炭素繊維ディスク電極をマウントします。<ol>
<li>優しく、フラット楕円形ディスク形状電極表面の方を向いて、細胞の頂端表面に電極を配置し、マニュピュレーターを使用して細胞膜と接触する電極を配置します。</li>
		<li>細胞膜上に配置する際に電極による細胞変形を監視することにより電極からセルまでの距離を調整し、セルが元のセル形状に近い形状を取り戻す距離に電極を慎重に撤回し.速度論的および定量的な記録に最適、シナプスの化学物質放出後シナプスの検出のための同じような条件である別の電極とセルの表面に 100 ナノメートルの薄い液膜を作成します。</li>
	</ol></li>
	<li>先端サイズ 2-3 μ m の直径、任意のソリューションに影響を与えるピペット チップからの漏れを防ぐために、セルから少なくとも 20 μ m の距離で 5 mM BaCl2液でいっぱいのガラス マイクロ ピペットの位置、開口放出する細胞を刺激する、実験し、5 mM 開口放出する細胞を刺激するために細胞表面の BaCl2ソリューションの 5 秒噴射パルスを適用します。</li>
	<li>エキソサイトーシス過程における浸透圧のリバーシブルの影響を研究する 310 mOsm/kg iso 浸透圧と調整することで高張バッファー等張緩衝液 (150 mM NaCl、KCl、1.2 mM MgCl2、5 mM グルコース 10 mM HEPES、5 ミリメートル pH 7.4) の準備、730 mOsm/kg に対応する、浸透圧と等張緩衝液の NaCl 濃度。</li>
	<li>張バッファー内セルを置き、約 3 分間開始エキソサイトーシス活動中に電流の過渡電流を記録しながらバリウム注入パルス印加による開口放出する細胞を刺激します。<ol>
<li>高張状態に等張状態で分泌応答を比較するには、高張緩衝液で 10 分間細胞をインキュベートし、その後バリウム注入パルス分泌を刺激し、電流記録の 3 分を実行するを適用します。</li>
		<li>細胞の可逆的反応、等張緩衝液で 10 分間再度セルを孵化させなさい、5 s を適用することで細胞を刺激するため、バリウム注入パルスし、細胞から開口放出の応答を記録する 3 分を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>同じ BaCl2刺激細胞に置かれた張バッファーの複数のバリウム刺激によって分泌活性に及ぼす影響を決定するための制御実験を実行から 3 回連続してエキソサイトーシス リリースのアンペロ メトリック記録と同じ時間プロトコルを使用して、異なる浸透圧で連続細胞培養実験のため。</li>
</ol>3. 細胞内電気化学 Cytometry24,26
<ol><li>小胞素量サイズ計測用電極を作製するには、のと同じ素材を使用し、セクション 2.1 と 2.2 アンペロ メトリック エキソサイトーシスの電極作製の説明によると炭素繊維電極を直径 5 μ m を準備を開始測定。</li>
	<li>顕微鏡で 30 から 100 μ m まで長さの炭素繊維はガラス先端から突き出してするのでガラスの先端から炭素繊維拡張カットにメスを使用します。</li>
	<li>炭素繊維電極の炎エッチング先端を準備、ブタン炎を使用します。均等にエッチングを達成するために円筒形電極チップ、それを回転させながら円筒形炭素繊維電極を保持して、炭素繊維から延びるガラス ブタン炎の青の端にカーボンの先端開発赤まで配置色。これがかかる未満 2 s。正常終了した場合は、(そのような先端の SEM のイメージは図 5Bに示すように) 直径 50 ~ 100 nm のエッチング電極先端サイズでこの結果します。炎は、エッチング、電極先端部を評価する顕微鏡下で電極を配置します。</li>
	<li>3 分、15 秒浸漬電極先端部のアセトン溶液に続いてエポキシ ソリューションに円筒形のナノ針状電極を挿入します。これにより中アセトン クリア エッチング炭素繊維電極表面をエポキシ樹脂炭素繊維と絶縁ガラス毛管壁の間の潜在的なギャップ空間を密封するエポキシです。エポキシを治すためには、100 ° C で一晩オーブンで電極を焼く</li>
	<li>2.7 のセクションで説明したように、各炭素繊維電極の定常電流のテストを使用する前に循環ボルタンメトリーを用いるします。実験、高原の周り現在の表示電極のみ使用 1.5 2.5 nA27。</li>
	<li>細胞間電流測定、2.8 で説明されているように、顕微鏡でセルを配置し、ポテンシオスタット 2.9 で説明したようの同じ実験的設定を使用します。</li>
	<li>細胞内電流測定を実行し、セルに重要な物理的な損傷を防ぐために、ナノチップ円筒電極をセルに追加することによって挿入します. 穏やかな機械力、細胞プラズマ電極をプッシュするのに十分で、膜とマニュピュレーターを使用してセルの細胞質に。</li>
	<li>挿入後との円筒電極封入細胞膜は、生細胞でその場でアンペロ メトリック録音を開始します。酸化電位電極に適用されている、小胞が電極表面に吸着し、確率的破裂します。 したがって、このプロセスを開始する刺激のあらゆる種類の必要はありません。</li>
	<li>浸透圧に及ぼす影響小胞素量サイズを判断するには、等張および高張バッファーのセクション 2.13 で前述の実験条件を使用してに培養されている細胞のグループから細胞のフローサイトメトリー測定を収集します。</li>
</ol>4 アンペロメトリー録音のデータの分析
<ol><li>分泌と細胞内小胞素量サイズ分析から記録された電流データを解析する、その動力学的時間トレース対記録電流の過渡電流の解析を可能にするソフトウェア プログラムを使用して、ピークのパラメーターと個々 の電流ピークの統合された合計の料金を確認できます。データ分析のためイゴール28データ解析プログラムの書き込まれた Sulzer ラボで開発されたソフトウェアを使いました。</li>
	<li>スパイク、アンペロ メトリックを分析するときは、3 回根意味正方形 (RMS) 標準偏差の各録音のノイズのピークのしきい値の制限を選択します。</li>
	<li>ガウス形状に従う、差し込みエキソサイトーシス イベントの結果、3 回のしきい値を持つガウス形スパイクを受け入れることができるスパイクをダブルクリックしないでください偽のスパイクを防ぐために手動でそれぞれの細胞の記録から電流スパイクを収集します。RMS ノイズよりも高い。</li>
	<li>単一電流あたりの合計料金でデータのピークし、ファラデー法を使用して収集 (N = QnF) エキソサイトーシスまたは N はモルの単一細胞内の小胞破裂イベントごとに検出したカテコールアミン神経伝達物質のモルの量を計算するにはQ 電極表面でのレドックスの反作用を通過して神経伝達物質各スパイク、n 中に検出された合計の料金を = = 電子酸化還元反応で転送の数 (n = カテコールアミンの 2) と Faraday´s の定数 F = 96485 C/mol。</li>
	<li>最初にセルごとにイベントごとに検出した平均の料金を計算することによって収集されたデータの統計分析を実行します。[セル間の差異、セル間の平均料金の計算し、分散が等しくないと仮定するとセル間スチューデントの t 検定を使用します。この調査は、統計分析のための MATLAB プログラムを使用しました。</li>
</ol>5. TEM 画像小胞サイズ分析
<ol><li>異なる浸透圧条件下での細胞の電子顕微鏡イメージングを実行するには、セルの化学固定の前に 5% CO2環境で 37 ° C で 10 分間のアイソトニックまたは高張バッファー内セル孵化させなさい最初。</li>
	<li>Karnovsky 固定法29を使用してセル固定を実行します。このメソッドを使用して、0.01% アジ化ナトリウム、1% ホルムアルデヒドおよび 4 ° C でサンプルを格納できる 1.25% グルタルアルデヒド溶液とセルを孵化させなさい</li>
	<li>固定後、0.15 M ナトリウム cacodylate バッファーを持つセルを洗浄します。</li>
	<li>細胞を染色するには、サンプルは固定の記事し、透過電子顕微鏡イメージング用の準備、4 ° c、暗闇の中で常温 0.5% ウラニル酢酸溶液で 1 h 2 h 1% オスミウム四酸化ソリューションで細胞をインキュベートします。</li>
	<li>最終的な固定の手順でまず 100% エタノールでセルを洗浄によって細胞を脱水してアセトンでセルをすすいでください。</li>
	<li>エポキシ樹脂の細胞サンプルを埋め込むとその後 30-40 分間 4,000 x g で遠心分離を行うし、60 ° C で 48 時間培養 15 h の 40 ° C で重合するセルのサンプルを許可します。</li>
	<li>イメージングの準備で、セルのサンプルのセクションに埋め込まれた寒天 100 樹脂スライスに、厚みは 60 nm、ウルトラミクロトームを使用します。</li>
	<li>20 続いて 4 分 4% ウラニル acetate/25% エタノール溶液セルを対象水で洗浄の s。レイノルズ鉛クエン酸 3 分、20 の順でセルを洗浄して水で洗浄の s。</li>
	<li>細胞試料の透過電子顕微鏡イメージングを実行します。実験では、120 で運行されており透過型電子顕微鏡を用いて kV。</li>
	<li>細胞の細胞内小胞の人口を表示するセル超微細構造を示すセル セクションの各記録された画像から最初各 TEM 像で記録されたスケール バーに関してピクセルで画像のピクセル サイズを調整します。アイソトニックまたは高張の条件にさらされる細胞の各画像で小胞のサイズを決定するのにには、イメージング ソフトウェアを使用します。実験の結果, 画像解析ソフトウェア ImageJ を使用しました。それは、細胞の電子顕微鏡画像からの細胞の微細構造の画像解析、細胞の断面の厚さに基づいてこれらの測定のサイズ調整する必要がありますとみなされ、以前 Almers´s ラボ30によって記述されている注目に値するです。</li>
</ol>

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我々 はここで、プロトコルと分泌小胞や浸透圧などの物理的な力に分泌小胞の影響のより良い理解を得るために開口放出のプロセスを分析する 3 つの補完的な分析手法を組み合わせることの利点を提示します。分泌細胞の開口放出プロセス。これらのメソッドは、エキソサイトーシス活動、彼らのネイティブ環境で小胞の素量サイズを決定するため使用すると、細胞内の電気化学的フローサイトメトリーを記録するための確立された方法である炭素繊維電極電流と透過電子顕微鏡画像解析分泌小胞のボリュームを監視します。この作品は、クロム親和性細胞を等張および高張細胞外の環境にさらされている単一の小胞のエキソサイトーシス イベントのアンペロメトリー録音から定量的なデータを収集することにより確認したその浸透衝撃を大幅に削減、量の神経伝達物質をエキソサイトーシス時リリースし、これらの細胞が可逆的に回復、場合に元の数量をリリース等張の環境 (図 3) に戻されます。
アンペロ メトリック録音は対時間エキソサイトーシス イベントの頻度の情報を提供し、したがって、細胞浸透圧の異な...

副腎髄質の細胞は、神経伝達物質分子を血流に放出神経内分泌のセルです。これはドッキングを含む細胞プロセスとエキソサイトーシスと呼ばれるプロセスの細胞外空間に小胞からコンテンツのリリースで、その結果神経伝達物質で満たされた小胞の融合により発生します。クロム親和性細胞内伝達物質 (アドレナリン、ノルアドレナリン)、積極的に大きい密中心の小胞 (LDCVs) に膜タンパク質によって運ばれ、高濃度 (~0.5-1 M)1,2に格納されます。クロモグラニン蛋白質 (~ 169 mg/mL)3,4,5 から成る小の密度の高い核蛋白質のマトリックスへのカテコールアミン分子の親和性、LDCVs の中の神経伝達物質の蓄積は、します。 ,6、および ATP (125-300 mM)7Ca2 +などの小胞にカテコールアミンの読み込みとストレージの主要なコンポーネントを含む小カクテル ソリューション (ソリューション 〜 40 mM で 50-100 μ M が行き、たんぱく)8、9Mg2 + (5 mM)、アスコルビン酸 (10-30 mM)10、および ~5.511,12の pH。にもかかわらず、ベシクル内理論の溶質濃度を合計 750 mM 以上まで、LDCVs は細胞細胞質 (310 mOsm/kg)13iso 浸透圧条件を維持します。小成分の組成はのみ読み込みと、カテコールアミン、溶質の集計ストレージの密度の高い核蛋白質のマトリックスに必要ではありません。これが激減する小胞の浸透圧が大幅に低下し、エキソサイトーシス5,6時にリリースされる量カテコールアミンに影響を与えることができます。
高細胞外浸透圧分泌活性を阻害してシングルから分泌される神経伝達物質の数が減るに電流記録によるエキソサイトーシス過程に及ぼす細胞外の浸透圧の研究が報告されています。小胞の区画4,14,15,16,17,18,19。これらの観察の説明は、高分子の細胞細胞質阻害小胞融合イベントの数に影響を与える膜生物物理学的特性の変化の可能な強化に推測しています。エキソサイトーシス時解放の神経伝達物質。これらの考えは、高い細胞外浸透圧ストレスがトリガー エキソサイトーシス14,の前段階で小胞のコンパートメントに格納されている神経伝達物質の分子の数を定義する小胞素量サイズを与えないことと見なされます15,17,19,20,21. 単一細胞における分泌リリースのアンペロ メトリック測定、炭素繊維ディスク電極は実験的にシナプス構成を模倣したセットアップを作成する細胞表面と連絡を密に配置されます場所、アンペロ メトリック電極は、シナプス後の検出器 (図 1)22,23として機能します。開口放出する細胞を刺激することによって細胞膜と融合し、細胞外スペースに一部またはにおける小胞の内容を解放する神経伝達物質で満たされた小胞を引き起こすことができる 1 つ。酸化還元電位は 700 mV vs 銀/塩化銀参照電極を適用することによって神経伝達物質 (例えばカテコールアミン) ゲルロボット場合電気化学電極の表面でこれらの神経伝達物質の分子を検出できます。.その結果、電流スパイクのシリーズは、個々 のエキソサイトーシス イベントの検出をマークします。アンペロ メトリックの記録で時間トレース対電流から各単一電流スパイクの下の領域はエキソサイトーシス イベントごとに検出した電荷を表し、リリース、ファラデー方程式を用いた神経伝達物質のモルに変換することができます。したがって、アンペロ メトリック録音単一開口放出イベントから追放された量の神経伝達物質の定量的情報を提供、エキソサイトーシス イベントの頻度に関する報告書が分泌小胞に関する定性的情報はありません。小胞の融合および神経伝達物質のリリース前にコンテンツが開始されました。
したがって、セルにどのように分泌小胞のより良い理解を得るため細胞質に応答細胞外浸透圧ストレス、開口放出を受けるセルを発生する前にこの情報を豊かにする他の補完的な手法を使用できます。例えば、化学固定後細胞の小胞の大きさを測定するため、調べるため浸透圧ストレス小胞のボリュームを変更する場合、透過型電子顕微鏡 (TEM) を画像解析を使用できます。浸透圧ストレス小胞素量サイズに影響を与える場合を調べると、細胞の電気化学的フローサイトメトリーと呼ばれる最近開発されたアンペロ メトリック手法を小胞の分泌小胞神経伝達物質コンテンツの定量化のため適用できるのまだ26生きた細胞の細胞質に存在するときの本来の状態。細胞内電気化学フローサイトメトリー法でナノ針状円筒炭素繊維電極優しく 700 mV の電位をこの電極に適用することによってと生きた細胞の細胞質に挿入されます (対銀/塩化銀参照電極)、衝突、吸着、電極表面で破裂その後確率的とに対してその内容を解放単一の小胞からの酸化還元電流スパイクの検出によって小胞のカテコールアミンの量を定量化することができます、電極表面26。したがって、時間トレース対現在の電流に各単一の小胞の連動イベント過渡電流に可能性があり、各電流スパイクの領域を統合することにより小胞素量サイズは Faraday´s 法を使用して計算することができます。
したがって、細胞の電気化学的フローサイトメトリーで記録された小胞素量サイズ分析と共に電子顕微鏡イメージングを用いた小胞サイズ測定から得られる定量的な情報をリンクすることにより小胞神経伝達物質濃度ことも決定されます。これは細胞がさまざまな浸透圧条件にさらされる小胞のキャラクタリゼーションをことができます、どのように小胞の開口放出する前の段階で細胞外の浸透圧ストレス応答可能性がありますに良いビューを提供します。これらの測定値から相対変化に関する定量的な情報を比較することを示す、細胞外の高浸透圧の存在下での小胞が縮小し、素量サイズ調整からこれらの方法を組み合わせて結果を示しています。縮小中、小胞は、その内容と定数神経伝達物質濃度24を維持するためにサイズを調整します。したがって、このような理解、浸透圧ストレスにさらされた細胞の伝達物質の放出は、観測への接続です。これらのプロトコルで細胞外浸透圧に対応するネイティブ環境でどのように分泌小胞のキャラクタリゼーションと分泌に及ぼすこの応答を許可するこれらの 3 つ補完手法の使用について述べるプロセス。エキソサイトーシス24の高浸透圧の影響について私たちの前の観察、に加えて高浸透圧刺激と髄質で複数のバリウム刺激の効果の後細胞回復を記述する追加の実験を提案します。セルです。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼP</td><td>ロシュ、スウェーデン</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&micro;M ナイロンメッシュ</td><td>フィッシャー Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV コーティング 60 mm プラスチック皿</td><td>VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス キャピラリー</td><td>サッター機器 (株), ノヴァト, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット プーラー</td><td>ナリッシング, 日本</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ溶液(AおよびB)</td><td>エポキシ技術、ビレリカ、マサチューセッツ州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベベラー</td><td>ナリッシング株式会社</td><td>EG-400</td><td></td></tr>倒<tr><td>立顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプ機器</td><td>分子デバイス、カリフォルニア州サニーベール</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュ</td><td>レーターBurleigh Instrument Inc.、米国</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>ブタンフレーム</td><td>マルチフレームAB、H&auml;スウェーデン</td><td></td><td></td>、セルホルム</tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

分泌細胞は分泌活動と単一の開口放出イベントで小胞から解放の神経伝達物質の量を減らすことによってこの物理的なストレスに応答する高浸透圧刺激を受ける細胞のアンペロメトリー記録。浸透圧ストレス応答の細胞縮小し、仮定した細胞の細胞内分泌小胞を受けません追放の神経伝達物質の減少膜生物物理学的特性の変化のため、それが示唆されています。細胞外浸透圧ストレス。エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録は、瞬間、小胞は細胞膜と融合が、小胞の融合が発生する前に小胞のコンテンツに情報を提供しませんが細胞からリリースが何を監視します。したがって、あるアンペロメトリーを組み合わせることで細胞の開口放出を発生する前に、分泌小胞を特徴付けることができる他の補完的な分析方法と記録、どのように分泌小胞を調べるための広範な概要を提供していますと、高浸透圧刺激による開口放出プロセスを受けます。ここで分泌小胞サイズや神経伝達物質の変化を特徴付けるアンペロメトリーを利用した細胞内電気化学フローサイトメトリーと透過電子顕微鏡 (TEM) イメージング記録を補完するを使用する方法について述べるクロム親和性細胞浸透圧ストレスへの暴露の前後分泌活動に関連して。すべての 3 つの分析方法を用いた実験から得られる定量的な情報をリンクすることによって結論は以前に行われたサイズで縮小する小胞素量サイズを減らすことによって分泌小胞が細胞外浸透圧ストレスに応答します。一定の小胞神経伝達物質濃度を維持します。したがって、これはなぜ小胞、浸透圧ストレス応答削減量神経伝達物質分泌のリリース時に発表に関するいくつかの明確化を提供します。アンペロ メトリック録音をここで示すときに置かれた細胞は、等張性の環境に戻されます、高浸透圧刺激神経伝達物質を充てん後、これは可逆過程とその小胞。

我々 はここに一緒に 2 つの電気化学的方法、炭素繊維アンペロメトリーと細胞内電気化学フローサイトメトリー電子顕微鏡イメージングを組み合わせることの効果をほのめかしているより広範なビューを得る情報を提供方法のプロトコルを記述します。分泌小胞のエキソサイトーシス過程の細胞外浸透圧。分泌活動の大幅な削減実験 (図 1に示すように) 設定を使用して単一のクロム親和性細胞の開口放出リリースの代表的なアンペロ メトリック録音を比較すると、細胞が浸透圧にさらされたときに表示されました。(図 2 a)24アイソトニック状態の細胞と比較して強調します。合計の料金は、スパイクだった異なる細胞に単一の小胞のエキソサイトーシス イベントから追放された分子の数を計算するために使用を現在それぞれの個々 の電流によって検出されたこれらの録音から Faraday´s 法を使用して、浸透圧条件。比較では、現在平均電流の小さい面積で図 2 bに表...

浸透圧ストレスは、エキソサイトーシスとこの処理中に解放の神経伝達物質の量に影響します。透過型電子顕微鏡と共に電気化学的方法を組み合わせることを使用エキソサイトーシス活動、小胞素量サイズ、および神経伝達物質解放の量に細胞外の浸透圧の影響を検討することができる方法を紹介します。中に分泌します。

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

この複合分析手法の全体的な目標は、細胞内の分泌小胞が細胞外浸透圧などの物理的な力にどのように反応するか、およびこれらのオルガネラの調整がエキソサイトーシスプロセスにどのように影響するかについての情報を提供することです。この方法は、分泌小胞が細胞外環境の変化や薬物治療にどのように直接反応するかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。このアプローチの主な利点は、生細胞の小胞含量に対する直接的な影響をモニターし、エキソサイトーシスの治療前と治療後のそれらのreh-chemical-ed放出の変化を区別することを知ることです。平らなディスク電極表面を得るには、電極をマイクログラインダーのホルダーに置き、各炭素繊維電極を45度の角度で面取りします。その後、エキソサイトーシス測定のために電極を細胞の近くに配置するときに、ディスク電極表面を45度の角度で配置する方法の将来の参照のために、キャピラリーに印を付けます。単一細胞でアンペロメトリック記録を行うには、面取りしてテストしたばかりのカーボンファイバーディスク微小電極を、ポテンショスタットとともに使用されるヘッドステージの電極ホルダーに取り付けます。使用する前に、各炭素繊維微小電極を試験溶液に入れ、サイクリックボルタンメトリーを使用して研究状態の電流を監視します。サイクリックボルタンメトリースキャンでは、100ミリボルト/秒で銀-塩化銀参照電極に対して負の0.2ボルトから正の0.8ボルトまでの三角形の電位波形を適用して、良好な反応速度を確保します。エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録には、培養クロム親和性細胞を入れたペトリ皿を等張バッファーに入れ、ファラデーケージ内の倒立顕微鏡で静置します。顕微鏡の加熱ステージを使用して、細胞実験中を摂氏37度に保ちます。次に、低ノイズパッチクランプ装置を使用して、作用電極に正700ミリボルトの定電位を印加します。クロム親和性細胞のエキソサイトーシスを記録するには、10 キロヘルツでシグナルをデジタル化し、2 キロヘルツの内部ローパスベッセルフィルターを適用して記録されたシグナルをフィルタリングします。楕円形のディスク電極は、セルの上に平らに配置し、ペトリ皿の表面と平行に配置する必要があることに注意してください。また、電極は実験当日に面取りを行い、電極表面をきれいに保ちます。細胞のエキソサイトーシスを刺激するには、5ミリモルの塩化バリウム溶液を充填したガラス製マイクロピペットを、細胞から少なくとも20マイクロメートルの距離に置きます。次に、細胞の表面に5ミリモル塩化バリウム溶液の5秒間の注射パルスを印加して、細胞のエキソサイトーシスを刺激します。ステムピペットを溶液に入れ、アンペロメトリック電流過渡現象を約3分間記録しながら、バリウム注入パルスを印加することにより、細胞エキソサイトーシスを刺激します。等張性条件と高張性条件でのエキソサイトーシス応答を比較するには、細胞を高張緩衝液で10分間インキュベートします。その後、バリウム注入パルスを印加してエキソサイトーシスを刺激し、3分間のアンペロメトリック記録を行います。細胞の可逆的応答のために、細胞をアイソトニック緩衝液中で10分間再度インキュベートします。バリウム注入パルスを適用して細胞を刺激し、エキソサイトーシス応答を3分間記録します。小胞の定量的サイズ測定用の電極を作製するには、直径5マイクロメートルの炭素繊維電極を準備します。顕微鏡で、ガラスの先端から伸びている炭素繊維をメスで切断し、30〜100マイクロメートルだけが残るようにします。ブタン炎を使用して、炭素繊維電極の火炎エッチングされた先端を準備します。電極先端を円筒形に均一にエッチングするには、円筒形の炭素繊維電極を回転させながら保持します。そして、ガラスから伸びる炭素繊維をブタン炎の青い端に、炭素の先端が赤い色になるまで置きます。火炎エッチング後、電極を顕微鏡下に置いて電極先端を評価します。エッチングされた電極の先端サイズは、直径が約50〜100ナノメートルである必要があります。次に、円筒形のナノチップ微小電極をエポキシ溶液に3分間挿入し、続いて電極チップをアセトン溶液に15秒間浸します。これにより、エポキシは炭素繊維と絶縁ガスキャピラリー壁との間の電位ギャップスペースをシールすることができます。アセトンはエッチングされた炭素繊維電極表面からエポキシを取り除きます。エポキシを硬化させるには、電極をオーブンで摂氏100度で一晩焼きます。使用する前に、サイクリックボルタンメトリーを使用して各炭素繊維微小電極の定常電流をテストしてください。実験には、1.5〜2.5ナノアンペア程度のプラトー電流を示す電極のみを使用してください。細胞内アンペロメトリー測定では、細胞を顕微鏡下に置き、ポテンショスタットの同じ実験設定を使用します。細胞への重大な物理的損傷を防ぎます。ナノチップの円筒形微小電極を、穏やかな機械的な力を加えて細胞に挿入します。マイクロマニピュレータを使用して、電極を細胞原形質膜を通って細胞細胞質に押し込むのにちょうど十分です。挿入後、細胞膜を円筒形電極の周囲に密閉した状態で、生細胞でアンペロメトリック記録をその場で開始します。電極に加わった酸化電位では、小胞が電極表面に吸着し、確率的に破裂します。したがって、このプロセスを開始するためにいかなる種類の刺激も必要ありません。小胞の量子サイズに対する浸透圧効果を決定するには、実験条件を使用して等張バッファーおよび高張バッファーでインキュベートした細胞群から細胞内サイトメトリー測定値を収集します。エキソサイトーシス活性に対する細胞外浸透圧の影響は、クロム親和性細胞が等張性、次に高張性、そして最後に等張性条件下でバリウム溶液で刺激された場合のエキソサイトーシスイベントの頻度として表されます。このデータは、浸透圧ストレスを受けている細胞でのエキソサイトーシス活性の阻害を示しており、細胞が等張環境に戻った後に部分的な回復を達成できることが示されています。対照実験は、等張条件のクロム親和性細胞で3回連続してバリウム刺激を行った後のエキソサイトーシスイベントの頻度を示しています。これは、これらの実験で使用された時間枠内での複数のバリウム刺激が、連続的な細胞刺激によるエキソサイトーシス活性の低下を引き起こしていることを示しています。このビデオを見た後、分泌小胞とエキソサイトーシスプロセスが細胞外環境の変化によってどのように影響を受けるかを比較できるこれらの補完的な分析方法を実行する方法について十分に理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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