細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

全体的な目標は、実験的変更が細胞伸長レパートリーに及ぼす影響と、それが癌の細胞接着機能にどのように関連しているかを判断することです。この方法は、細胞膜伸長レパートリーが細胞接着、運動性、浸潤などの細胞挙動を調節する上で重要な役割を特定するのに役立ちます。この手法の主な利点は、実行が比較的簡単で、さまざまな実験条件に簡単に適応できることです。

この技術の意味は、接着能力および浸潤性能力における腫瘍細胞の変化に関連する細胞伸長レパートリーの変化を正確に定量化するのに役立つため、局所進行性または転移性がんの治療または診断にまで及びます。また、細胞の伸長形成や正常な生理学的プロセスに重要な役割を果たすことが知られているイオンチャネル制御などの他のシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションと記録は、細胞伸長ステップのカウントが時々その外観の微妙な点のために習得するのが難しいため、非常に重要です。

イメージングの前日に、血球計算盤を使用して、摂氏37度および5%の二酸化炭素インキュベーターで増殖したSW 13、SW Neo、およびSW DKK3細胞をカウントします。滅菌ガラスカバースリップを3つの6ウェルプレートの個々のウェルに配置します。各細胞株に別々のプレートを使用し、ウェルあたり5, 000細胞の密度で3つの細胞株をこれらの6つのウェルプレートにプレートします。

細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに一晩置きます。翌日、各井戸から成長培地を吸引します。次に、1ミリリットルの温かいPBSで細胞を洗浄します。

その後、3.7%のホルムアルデヒドを1ミリリットルずつ各ウェルに加え、細胞を固定します。細胞を固定液に10分間放置します。固定が完了したら、ホルムアルデヒドを吸引します。

0.05%のクリスタルバイオレットを各ウェルに1ミリリットル加えて、細胞を30分間染色します。次に、ウェルごとに1ミリリットルの脱イオン水で細胞を3回洗浄して、余分な汚れを取り除きます。次に、ラベルを貼ったスライドガラス上に透明な埋込試薬を一滴垂らします。

次に、先端の細い鉗子を使用して、カバーガラスをそっと取り出し、下向きにして封入試薬の上に置きます。染色したすべてのカバースリップをスライドに取り付けた後、光学顕微鏡で、各カバースリップから重なり合っていないセルの20のランダムなビューを選択します。各視野について400倍の強度の顕微鏡写真を撮影します。

次に、20個の代表的なセルのそれぞれで拡張タイプの数を観察してカウントします。定義とテキストプロトコルを使用して、膜伸長をfilopodia、lobopodia、またはlamellipodiaとして分類します。細胞伸長タイプを最初にカウントするときは、参照画像をレビューできるようにしておくと役立つ場合があります。

可能であれば、実験サンプルに対して盲検的にカウントすることで、客観性を高めることができます。調べた3つの細胞株のそれぞれの細胞あたりの各タイプの平均エクステンション数を決定します。一方向の分散分析を使用して、異なる細胞タイプ間の細胞膜伸長の平均パーセンテージの違いが統計的に有意であることをテストします。

アッセイの前日に、血球計算盤を使用して、SW 13、SW Neo、SW DKK3細胞をカウントします。ウェルあたり100, 000セルの密度でこれらの細胞を、テストされる6つの指定された時点ごとに1つのプレートを使用して6つのウェルプレートにプレートします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに一晩置きます。

翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、温かいPBSで細胞を一度洗います。次に、0.5ミリリットルの単一強度非酵素的細胞解離溶液を各ウェルに加えます。プレートを静かに渦巻かせて、加えた溶液を均一に広げます。

プレートを溶液と所定の時間インキュベートします。各時点の終わりに指定されたプレートを吸引します。各吸引の直後に、1ミリリットルの温かいPBSで細胞を洗浄します。

次に、プレートを軽くたたいて、ゆるく付着した細胞を取り除きます。断続的なタッピングとともに洗浄をさらに2回繰り返します。最後に、残っているPBSを吸引し、プレートに残った細胞を1ミリリットルの3.7%ホルムアルデヒドで固定します。

固定が完了したら、ホルムアルデヒドを吸引します。次に、0.05%のクリスタルバイオレットを1ミリリットルずつ各ウェルに加え、細胞を染色します。染色が完了したら、ウェルごとに1ミリリットルの脱イオン水で細胞を3回洗浄して、余分な汚れを取り除きます。

100倍の倍率の光学顕微鏡を使用して、各プレートの各ウェルに残っている付着細胞をカウントします。次に、試験した3つの細胞株について、異なる時点で剥離したままの細胞の割合を決定します。二元配置分散分析を使用すると、3つの細胞株間の差と細胞剥離率の検定は統計的に有意です。

クリスタルバイオレット染色コントロールSW 13およびSW Neo細胞は、主に糸状仮足およびラメリポディアを形成しました。対照的に、DKK3を発現する細胞は、ラメリポディアがほぼ完全に存在せず、フィロポディアがほとんどない、より多くのロボポディアを形成しました。また、DKK3発現細胞と対照細胞株の極性の違いにも注意してください。

グラフは、試験した3つの細胞株における異なる細胞伸長の割合を示しています。DKK3発現細胞におけるロボポディアの割合が有意に高いことに注意してください。折れ線グラフは、X軸に示されている時点における解離溶液による処理後にプレートに付着したままの細胞の割合を示しています。

10分までのすべての時点で、DKK3発現細胞は対照細胞と比較して有意に高い細胞接着強度を示しました。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、実験のセットアップに応じて1〜2日で実行できます。この手順を実行する際には、細胞伸長形態の変化が接着能力にどのように影響するかを評価することを忘れないようにすることが重要です。

このビデオを見れば、がん細胞の接着特性の変化に関連して細胞の伸長を正確に定量化する方法を十分に理解できるはずです。頑張って、見てくれてありがとう。