Name: ヒト以外の霊長類コモンマーモ (用いた) で内耳に薬の管理術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶコモンマーモセットの内耳への薬物投与法。後鼓室開窓術を用いて聴力損失を最小限に抑えながら、聴覚機能評価と難聴治療法の開発に向けた非ヒト霊長類モデルの応用を探索する。

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仕事は日本政府文部科学省科研費 (24592560, 15 H 04991、15 K 15624) から m. f. と m. f. に武田科学財団、東京慈恵会医科大学戦略的な優先順位付け研究基金 H.J.O. の補助金によってサポートされて

すべての実験手順は、東京慈恵会医科大学、東京都で行われました。機関動物ケアおよび使用委員会東京慈恵会医科大学の動物取り扱いと実験プロシージャを承認 (承認なし: 26-060)、慈恵で実験動物の使用のための機関のガイドラインに沿って行われ、大学: 日本学術会議 (2006 年) で動物実験の適切な実施のためのガイドラインに同意します。ケアと実験動物の使用 (資源研究所の実験動物、1996) のガイドの推奨事項に従って動物のケアを行った。
1. 術前検査
<ol><li>少なくとも 1 ヶ月個々 の解剖学的構造の識別を容易にするため手術の前に動物 (コモンマーモ セット) の頭蓋の計算された断層レントゲン写真撮影 (CT) スキャンを取る。</li>
	<li>聴力検査手術の前に、少なくとも 1 ヶ月を実行します。 注: ここでは、聴覚の状態を評価するために、ABR を使用しました。簡単に言えば、肯定的な電極は、頂点と刺激耳背下部参照否定的な電極で皮下置かれました。接地電極は首の背の部分に皮下配置されました。17,18 Abr をトーン バーストと誘発した (1.0 ms トーン バースト 0.1 ms の上昇と持続時間と立下り時間)。音圧レベルは最大振幅から 10 dB ステップで、減った。各音のレベルで 512 応答を (交互刺激の極性) を平均しました。ABR 閾値はであらゆる波を検出できる最小の音圧レベル (SPL) として定義されました。</li>
</ol>2. 麻酔
<ol><li>全身麻酔下で手術前に、の晩から高速の動物。</li>
	<li>顔にマスク換気または低速誘導 (図 1 a) の誘導の商工会議所で 4% イソフルランと 5-6 mL/分で周囲の空気を管理します。動物はつま先のピンチなどの痛みを伴う刺激に応答しないことを確認します。</li>
	<li>Anesthestize コモンマーモ セット メデトミジン 0.04 mg/kg, ミダゾラム (0.4 mg/kg)、およびブトルファノール (0.4 mg/kg) の組み合わせ (大腿筋) に筋肉注射をします。</li>
	<li>アンピシリン (0.08 mg/g) を皮下注入術前抗生物質として皮膚切開前 30 分以上。</li>
	<li>上部で、その頭を仰臥位でマーモセットを置き、頭と首を拡張します。ナイロン糸をテーブルに上顎を修復良いビューを取得する舌を引くか、喉頭鏡を使用して、また、喉頭蓋、喉頭のエントリを視覚化 (図 1 b)。</li>
	<li>喉頭蓋は喉頭の表面に沿って気管内チューブを挿入します。 注: 16 ゲージの静脈のカテーテルを使用することがまたは 6 フランス語ゲージ栄養チューブの気管内チューブ (図 1)。</li>
	<li>気管に配置されて正しくいることを確認するために気管内チューブから EtCO2を確認してください。チューブが配置されている呼吸ガスの動きをチェックした後、テープでマーモセットの顔に気管内チューブを固定します。</li>
	<li>操作中に 1-3% イソフルランの麻酔を維持します。</li>
	<li>操作中に SpO2EtCO2体温、直腸の温度を監視します。体温の低下を防ぐために暖房のマットですべての手順を実行します。</li>
</ol>3. 術前準備
<ol><li>仰臥位でセットを準備し、頭を非手術側 (図 2 a) に 30-45 度の角度に傾斜します。</li>
	<li>手術側の後耳介領域を剃る。</li>
	<li>アルコール、ポビドン ヨード、後耳介や外耳道の両方の外科的領域を消毒します。</li>
	<li>マーモセット (図 2 b) に円形孔を有する手術用覆布シートを配置します。</li>
</ol>4. 手術
<ol><li>1% 塩酸リドカインを注入 (1: 100,000 エピネフリン 0.1 から 0.2 で mL) 皮下に皮膚切開部位。第 15 円形の刃を持つ、耳介後部の皮膚切開を行います。</li>
	<li>止血、1:5,000 希釈エピネフリンに浸したガーゼを使用して出血領域に圧力を適用します。バイポーラ熱傷も効果的です (図 2)。</li>
	<li>だからその耳介軟骨 (c) の後耳介領域の軟部組織に開くし、後耳介筋 (m) を認識することができます。外耳道骨軟骨 (図 3 a) の奥深くに表示すべきを公開します。</li>
	<li>鼓膜の深さを確認するため後方の外耳道の最深部で骨と皮の付着として認識されることができます鼓膜の縁の骨の一部を公開します。 注: この手順は、どのように深い中耳腔の外側の部分である (図 3 a) を認識することが出来ます。</li>
	<li>側頭骨から分離、尾の側面に向かって後耳介筋 (胸鎖乳突筋、頭板状筋、顎二腹筋の後部の腹) の皮をむきます。側頭骨 (図 3Bのアスタリスク) の外側表面は、公開します。</li>
	<li>1.0 mm ダイヤモンド bur. (図 3) と外耳道の後ろに約 5 mm の穴を作る。掘削サイトに応じてドリル回転数 1,000-8,000 rpm を使用します。 注: 低速の半規管や顔面神経の近くの繊細な操作に適しています。掘削サイト熱損傷を防止するために適切に生理食塩水を点滴します。</li>
	<li>ドリルで穴を拡大し、水平半規管 (HSC) では、(図 3 D) の乳様突起の空洞に向かって隆起の位置を確認します。</li>
	<li>垂直部分実行 HSC の前方顔面神経の位置を確認します。ドリルし、顔面神経と鼓索神経との間の三角形の面積の中心に位置している顔の凹部の明確なビューを取得する、存在する場合、すべての骨の隔壁を削除します。</li>
	<li>顔面神経と、鼓膜の垂直部分の間にドリルで小さな穴を作り 1,000 rpm で 0.6 mm 径ダイヤモンド バールとリム (図 4 aのアスタリスク)。</li>
	<li>薄くなった骨をピンクの線と見ることができる顔面神経を損傷しないように後部運河の壁と平行、バールに移動します。神経は白い線構造 (図 4 b) として公開する直前に、掘削を停止します。</li>
	<li>丸い窓のニッチが穴 (図 4) を視覚化できることを確認します。その後、25 ゲージまたは細い針でニッチに薬を管理します。丸い窓のニッチ市場で薬を保持するためにニッチ (図 4) 粘性ソリューションを配置します。</li>
	<li>その止血がしっかりと確認した後 6-0 吸収スレッドを使用して簡単な縫合と層 (表皮層と真皮層) を閉じる制御します。</li>
	<li>手術の傷口にガーゼを修正し、包帯を貼る。</li>
</ol>5. 術後のケア
<ol><li>メデトミジンを敵に回した大腿筋に筋肉内塩酸アチパメゾール (0.15 mg/kg) を管理します。</li>
	<li>自発呼吸の開始、気管内チューブを削除します。</li>
	<li>30% O2覚醒を完了するために麻酔が切れるまで 29 度を記録、集中治療室における共通のセットを維持します。</li>
	<li>眼振など前庭機能障害を示唆する所見がないことを確認し、飼育ケージに動物を返します。</li>
</ol>

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</ol>

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蝸牛の血流の量が非常に小さい 1/1,000,000 人間の総心臓出力の順番になっていると推定される、一般的な循環19 から内耳を隔てる血蝸牛バリアの存在によってアクセスを制限 ,20。これらの理由から、薬物や内耳へのウイルスのベクトルの管理は直接管理ではなく、全身投与ではなく、良好です。マウス、モルモット実験で様々 なアプローチが報告されているトランス後耳介による丸窓や腹側アプローチ、cochleostomy、内リンパ嚢配信、および半規管に近づく21, 22,23,24,25,26。
<p class="jove_con...

難聴 (SNHL) は、損傷や、蝸牛の欠乏から主に発生します。SNHL の一般的な原因は、高齢化 (例えば老人性難聴)、遺伝的欠陥、耳毒性薬物1感染症、騒音への暴露。世界保健機関 (WHO) は、以上 3 億 6000 万人、世界の人口の 5.3% を表すが損失2を聞いて苦しむ推定されます。1 で 2,500 新生児に 900 の 1 が中等度、重度と先天性重度の永続的な難聴、および 65 歳以上の約 3 つの大人はある程度聴力損失3とも推定されます。ただし、これらの患者の難聴の効果的な治療はありません。
聴覚研究はネズミやモルモット モデルを使用して実行されて長いが、難聴の新しい治療法として遺伝子治療や再生療法などさまざまな方法が提案されています。しかし、人間および齧歯動物聴覚システムの面で大きな差がある、人間のアプリケーションに動物モデルを変換する非常に困難であります。コモンマーモ (C. 用いた)、アマゾンから発信された新しい世界猿いくつかの理由のための様々 な基礎調査研究魅力的な非ひと霊長類モデルとなっています。まず、その解剖学と生理学よりこれらの齧歯動物ではなく人間に似ています。第二に、基本的な生物学的疾患、神経回路網、動作、およびゲノムを含むこの種についてはよく特徴付けられます。聴覚とボーカルの処理、周期、ピッチの表現、コモンマーモ セットの聴覚音声相互作用の皮質コーディングもされている報告4,5,6,7,8,9,10. 最近の組織学的研究で研究者 20 の難聴遺伝子と共通のマーモセットの蝸牛における陰イオン交換器の特徴的な発現パターンを識別・発見 5 進行性難聴と 3 つの原因である遺伝子陰イオン交換器、齧歯動物11,12の異なる発現パターンを持っていた。これらのプロファイルは、共通のマーモセットが聴覚研究の強力なツールであることを信じる私たちを導きます。
実験動物としてコモンマーモの最も顕著な属性は次のとおりです。
<ul><li>小さなボディサイズと簡単に処理に比べていくつかの種の古い世界のサル: アダルト マーモセット 300 から 400 グラムの重量を量る、ラットに似ている、高さ約 60 cm。</li>
	<li>高度生殖霊長類: マーモセット 18 ヶ月の頃に性的に成熟を達成してクマの年 2 回、毎年 4 に 6 の子孫を生産することができます。</li>
	<li>遺伝の修正が利用可能な: 佐々木 Eらは、トランスジェニック13とノックアウト14霊長類のマーモセットを用いた神経疾患 (例えばパーキンソンに関与する遺伝の修正の作成に成功病やアルツハイマー病)。</li>
	<li>胚性幹 (ES) 細胞と多能性幹 (iPS) 細胞の両方は、確立された15,16をされています。むしろげっ歯類に比べてするマーモセットの同じ番号を維持することは困難であるが、幹細胞や iPS 細胞の可用性は、生体内のアッセイに必要な数を削減するの in vitroアッセイを提供します。</li>
</ul>難聴とその潜在的な療法の分野でより良い橋渡し研究を容易にするために、CT と MRI、全身麻酔と聴性脳幹反応 (Abr) を使用して聴力検査を用いたイメージングの研究プロトコルを設立しました。これらの実験システムが齧歯動物の研究と臨床試験の間のギャップを埋めるために不可欠な概念研究前臨床証拠を取得するより多くの機会を提供します。ここでは、丸い窓の膜をコモンマーモの内耳に薬を管理する手術法を報告します。伝導性の聴力損失を引き起こす可能性があります鼓膜を操作することがなく丸い窓周りの明確なビューを取得するには、便利ですアプローチに乳様突起の空洞から。臨床的に、このアプローチに呼ばれます「後部鼓膜」の確立し、蝸牛注入と真珠手術に用い。その後鼓膜聴力損失を引き起こすことがなく薬の正確な管理を実行することができます考えています。

<table><tbody><tr><td>コモンマーモセット</td><td>クレアジャパン</td><td>EDM:C.マーモセット(Jic)</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ファイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メデトミジン</td><td>ゼノアQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミダゾラム</td><td>アステラス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブトルファノール</td><td>明治製菓</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>明治製菓</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リドカイン塩酸塩</td><td>アストラゼネカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;6-0 吸収糸</td><td>エチコン</td><td>RD-1</td><td></td></tr><tr><td>アチパメゾール塩酸塩</td><td>ゼノアック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>和光</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>サージウェーブ</td><td>モリタ</td><td>TR-900-OR</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤバー 006</td><td>モリタ</td><td>14070057</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤバー 010</td><td>モリタ</td><td>14070081</td><td></td></tr><tr><td>集中治療室</td><td>Menix</td><td>P-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト以外の霊長類コモンマーモ (用いた) で内耳に薬の管理術

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

研究を聞いて長いによって促進されています齧歯動物モデルがいくつかの疾患では、ことはできませんですが、人間の症状が締めくくっています。コモンマーモ (用いた) が小さい、ハンドル簡単新しい世界猿と齧歯動物の比較よりも中耳の耳小骨連鎖と人間、内耳を含む頭骨のような解剖学を持っています。ここでは、一般的なマーモセットの内耳への薬物送達の蝸牛の丸い窓のニッチに再現可能な安全かつ合理的な手術アプローチを報告する.後部鼓膜、鼓膜伝導性の聴力損失を引き起こす可能性のある操作を避けるために人間の外科で臨床的に使用されるプロシージャを採用しました。この手術は、任意の重要な聴力損失には至らなかった。外側半規管、顔面神経の垂直部分を慎重に検討する必要がありますが、このアプローチは共通マーモセットの大きな嚢胞構造のために可能だった。この手術方法では、前臨床トランスレーショナルリサーチの概念実証を得ることに非常に重要なは、聴覚の損失、薬剤の安全で正確な管理を実行することが出来ます。

手術部位感染、血管の損傷や中耳の操作で発生する前庭障害と出血など合併症なく後部鼓膜を行った。7 歳コモンマーモの右の耳の後部の鼓膜を行い丸い窓のニッチに 1 μ L のリン酸緩衝生理食塩水を投与します。Abr は、前に、(図 5A B) 術後後 2 ヶ月を測定しました。波形と Abr のしきい値が以前研究17,18に匹敵して手術 (図 5C) 前後にこれらのパラメーターに変化はないです。したがって、我々 はその後の鼓膜は共通のマーモセットの丸い窓のニッチに薬の管理のための安全で有用なプロシージャを締結しました。
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丸い窓の膜を介してヒト以外の霊長類コモンマーモ (用いた) の内耳に薬を管理する手術法を報告する.

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

この外科的処置の全体的な目標は、難聴を誘発することなく内耳に安全に投与することにより、非ヒト霊長類のコモンマーモセットの聴覚機能に対する特定の薬物の影響を評価することです。この方法は、マスターキャビティを開く方法や薬物をどこに送達するかなど、インナーイヤーの薬物送達に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、霊長類の内耳治療の効率を評価するために重要な、合併症を伴わずに内耳をプラスできることです。この技術の意味は、マーモセットの聴覚系が人間の聴覚系と非常に似ているため、人間の難聴の潜在的な治療法の研究にまで及びます。この方法の習得は非常に重要であり、姿勢と解剖学を学ぶのは難しく、顔のノブや耳小骨チェーンを損傷することなく、狭いスペースに小さな窓を作成する必要があります。つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認し、頭と首を伸ばした状態で動物を加熱マットの上で仰臥位に置きます。上顎をナイロン糸でテーブルに固定し、タンを引き出します。喉頭蓋の喉頭表面に沿って気管内チューブを挿入します。気管内チューブの二酸化炭素レベルを確認して、チューブが気管内に適切に配置されていることを確認し、チューブを動物の顔に固定します。頭を非手術側に向かって30〜45度の角度に傾け、動物の手術側の耳介後領域を剃ります次に、耳介後領域と外耳道をポビドンヨードで消毒し、手術領域に丸い開口部のある外科用ドレープシートで動物を覆います。皮膚を開く前に、切開部位に1%の塩酸リドカインを皮下注射します。.次に、手術用顕微鏡と15番の丸い形のブレードを使用して、耳介後皮膚に切開を行い、1〜5,000希釈エピネフリンに浸したガーゼで出血領域に圧力をかけます。耳介後領域の軟部組織を開き、耳介軟骨と耳介後筋を特定できるようにし、軟骨の奥深くにある外耳道骨を露出させます。鼓膜の深さを確認するために、鼓膜縁の骨部分を露出させ、耳介後筋を尾側に向かって剥がして、筋肉を側頭骨から分離します。側頭骨の外側面を露出させ、1ミリメートルのダイヤモンドバリを使用して、外耳道の約5ミリメートル後ろに穴を開けます。さらにドリルで穴を開けて、必要に応じて穴を広げ、乳様突起腔に向かって膨らむ水平半規管を見つけます。次に、必要に応じて骨中隔をドリルで穴を開けて取り除き、顔面神経と索状の鼓膜の間の三角形の領域の中心にある顔面陥凹をはっきりと見ることができます。直径0.6ミリメートルのダイヤモンドバリを1, 000 rpmで使用して、顔面神経の垂直部分の間に小さな穴を開けます。神経が白い線構造として露出する直前に穴あけを止め、丸い窓のニッチがホールドを通して視覚化できることを確認します。25ゲージ以下の細い針を使用して、目的の薬物をニッチに送達し、適切なミスキュー溶液でニッチを覆って、薬物が保持されるようにします。止血が

a-surgical-procedure-for-administration-drugs-to-inner-ear-non-human

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、聴覚と前庭機能へのダメージを最小限に抑えながら、半規管を介してマウスの内耳に局所的に薬物を送達する術であるカロストミーを紹介しています。この方法により、ウイルスベクター、医薬品、および低分子をマウスの内耳に接種することができます。...

成体マウスの内耳への局所薬物送達のためのカナロストミー

&gt;jove_content&lt;ここでは、内耳への局所的な薬物送達のための2つのマイクロサージェリーアプローチについて説明し、聴覚パラメータ、蝸牛細胞構造、および炎症マーカーの発現への影響の観点から比較します。...

マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy対 Transtympanicインジェクション

この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための信頼性の高い方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。...

新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ

ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy...

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

人工内耳装用の動物モデルは、電気刺激で永久的な難聴の治療の技術基盤の知識を進めることができます。本研究は、急性耳をつんざくと聴性脳幹反応と機能性の評価と同様に、マウスで電極アレイの人工内耳の手術のプロトコルを示します。...

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

コモンマーモ継続的に、一時的な後頭極、前頭極からの皮質のほぼ全体の外側面をカバーするため全体皮質シェットランドシープドッグ...

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

ここでは、マカク脳の大きな皮質領域にわたって光遺伝学的発現を達成するための効率的かつ簡素化されたアプローチとして、皮質へのウイルスベクターの磁気共鳴(MR)誘導対流増強送達(CED)を示す。...

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

この研究は、一般的なマーモセットにおけるマイクロ電極アレイの立体的、神経外科的移植を行うプロトコルを提示する。この方法は、特に自由に振る舞う動物における電気生理学的記録を可能にするが、この種における他の同様の神経外科的介入(例えば、薬物投与のためのカニューレまたは脳刺激のための電極)に容易に適応することができる。...

共通マーモセットにおけるマイクロ電極アレイの移植のための立体外科手術(カリスリックス・ジャカス)

特注のマイクロドライブにより、リニアシリコンアレイで皮質記録部位をサブミリメートルでターゲティングすることができます。...

コモンマーモセットにおける層状皮質活動の電気生理学

言語の進化を研究するためには、ヒトの脳のメカニズムとヒト以外の霊長類の脳のメカニズムを比較することが重要です。私たちは、覚醒状態の動物の脳波を非侵襲的に測定する方法を開発しました。これにより、人間と動物に害を与えることなく、長期的に人間と動物の脳波データを直接比較することができます。...

覚醒したマーモセットにおける脳波測定 同種の発声を聞く 

学ぶコモンマーモセットの内耳への薬物投与法。後鼓室開窓術を用いて聴力損失を最小限に抑えながら、聴覚機能評価と難聴治療法の開発に向けた非ヒト霊長類モデルの応用を探索する。

ヒト以外の霊長類コモンマーモ (用いた) で内耳に薬の管理術

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