キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出
November 15th, 2017
このプロトコルでは、操作が簡単です、1 つのテストで複数の核酸の視覚的検出に適用することができます小さなに使えるカセットの製作について説明します。このアプローチでキャピラリー配列は遺伝子組み換えターゲットの多重化・高能率化の検出に使われました。
この手順の全体的な目標は、操作が簡単な単一のテストで複数の核酸を視覚的に検出するために適用できる、小さくてすぐに使用できるカセットを製造することです。この方法は、遺伝子組み換え生物やGMO検出など、マルチプレックス核酸検出分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。毛細血管を清掃するには、ラボユニフォーム、安全ゴーグル、化学防護手袋を着用してください。
ビーカーに毛細血管を入れます。30ミリリットルのアセトンで毛細血管を5分間洗浄し、有機物を取り除きます。次に、脱イオン水で毛細血管を洗います。
次に、ビーカーに約10ミリリットルの過酸化水素を注いでピラニア溶液を準備します。次に、過熱を防ぐためにゆっくりと振とうしながら過酸化水素に30ミリリットルの硫酸を加えます。溶液が少なくとも30分間、毛細血管を完全に覆っていることを確認してください。
その後、ピラニア溶液を大量の水で洗い流します。キャピラリーをエタノールと脱イオン水でそれぞれ5分間洗浄します。乾燥オーブンで毛細血管を乾燥させます。
次に、PDMSベース試薬とギアリング試薬を50ミリリットルのチューブ内で1対1の比率で秤量します。通常、5グラムのエラストマーベースと5グラムのエラストマー硬化剤を混合します。混合物をガラス棒で約5分間十分に攪拌します。
PDMSを入れたビーカーを真空ベルジャーに入れて30分間脱気します。次に、PDMSをステンレス鋼金型のシリンダーにゆっくりと注ぎます。PDMSを摂氏60度の乾燥オーブンで3時間硬化させます。
PDMSを硬化させた後、円筒形で金型を引き出して金型を取り出します。メスで金型の縁を切り取って、PDMSをシリンダーから取り外します。PDMSをエタノールと脱イオン水で3回洗浄します。
次に、PDMSサポートを窒素で乾燥させます。PDMSサポートの下面を疎水性にするには、PDMSサポートを超疎水性コーティングに1秒間浸します。その後、室温で10分間乾燥させます。
次に、洗浄した4mmキャピラリーをPDMSサポートの穴に挿入し、キャピラリーのゼロポイント5mmをPDMSサポートの上面の外側に残します。毛細血管の端が同じレベルにあることを確認してください。毛細血管の外面とPDMSサポートの上面を疎水性にするには、PDMSサポートの表面の上に15マイクロリットルの超疎水性コーティングを追加します。
超疎水性改質キャピラリーアレイを風乾します。次に、予め設計された順序に従って、1セットのプライマー固定混合物のプライマー固定混合物を1点6マイクロリットル追加して、キャピラリーアレイの対応する1つのキャピラリーを充填する。アレイを標準的な平底96ウェルプレートの透明ウェルに固定し、アレイを摂氏60度で少なくとも2時間乾燥させます。
カセットを組み立てるには、固定されたアレイの上部にローディングアダプターを配置します。アダプターの皿が10本の毛細血管すべての露出部分をちょうど覆っていることを確認してください。LAMP反応混合物を調製するには、テキストプロトコルに従って混合物に試薬を添加し、か焼を加えた後5秒間反応混合物をボルテックスします。
Bstポリメラーゼを添加した後、チューブを20回静かに反転させます。環境中に存在する微量DNAは、LAMP混合物を渡す前に、塩酸1リットルあたり1モルで早期に洗浄することで除去できます。LAMP反応混合物の20マイクロリットルを標準の100マイクロリットルのチップで吸引します。
ローディングアダプターのインレットに先端を挿入してロックします。反応混合物をアダプターの皿に静かに注入します。反応混合物は迅速に皿を満たし、その後、毛細管力によって自動的に毛細管を装填します。
アダプターをロックチップで取り外し、PCR適合の透明シールフィルムでウェルをシールします。次に、キャピラリーアレイをインキュベーターで摂氏63度のインキュベーターで1時間インキュベートします。蛍光発光の画像を取得するには、UV懐中電灯を使用して解離したか焼を励起し、蛍光を発します。
キャピラリーアレイの上部から、デジタルカメラまたはスマートフォンで画像をキャプチャします。画像を撮るときは、カメラが毛細血管の領域にできるだけズームインして、高品質で鮮明な画像を取得するようにしてください。次に、画像解析ソフトウェアで画像を開きます。
次に、画像、金型、グレースケール、はいと画像、金型、16ビット、はいを選択します。ファイル、名前を付けて保存、形式、TIFFを選択して、画像を16ビットTIFF形式に変換します。蛍光強度の値を抽出するには、マイクロアレイ解析ソフトウェアを開きます。
16ビットTIFF形式の画像をソフトウェアのインターフェースにドラッグし、波長532ナノメートルと緑色の色を選択して画像を表示します。次に、キャピラリーからの蛍光シグナルを特定するための新しいブロックを作成します。ツール、新しいブロックを選択し、列と行の数をブロックと機能のインターフェイスに 1 対 1 と 2 対 5 として個別に配置します。
右クリックしてフィーチャ モデルを選択します。次に、毛細血管の蛍光領域に合うように位置と直径を調整します。[解析]を選択して、蛍光強度の値を抽出します。
最後に、ファイルを選択し、設定を名前を付けて保存して、ブロックのドキュメントを保存します。次に、選択、ファイル、蛍光強度結果を保存するように結果を保存します。ここに示されているのは、キャピラリーアレイのレイアウトです。
キャピラリー1〜8、LAMPプライマーセットが接頭辞として付けられています。キャピラリー9と10は2を表し、プライマーコントロールはありません。ここに示されているのは、遺伝子組み換えトウモロコシMON863を検出するための蛍光写真で、緑色は正のLAMP増幅を表しています。
増幅が成功し、予想されるキャピラリー1、6、7、8でのみ提示され、ブランクキャピラリー間の汚染はありません。この蛍光写真は、GMOミックスの検出用です。緑色は正のLAMP増幅を示しました。
増幅の成功は、予想されるキャピラリー1、4、5、6、7、および8でのみ示され、ブランクキャピラリー間の汚染はありませんでした。ここに示されている蛍光写真は、非遺伝子組み換えトウモロコシの検出用であり、緑色は正のLAMP増幅を示しています。成功した増幅は、予想されるキャピラリー8でのみ示され、ブランクキャピラリー間の汚染はありませんでした。
この検出手順を習得すれば、適切に実行すれば1ポイント5時間で完了します。このビデオを見れば、複数の核酸検出を行うためのキャピラリーベースのカセットの作製方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、単一で使いやすいテストで複数の核酸を視覚的に検出するための小型の、すぐに使用できるカセットの製造について説明しています。この方法は、毛細管アレイを使用して多重検出を行うために、遺伝子組み換え生物（GMO）の検出に特に有用です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- バイオテクノロジー
- 分子生物学
- 遺伝子工学
背景
- 複数の核酸の検出は様々な分野で重要です。
- 遺伝子組み換え生物（GMO）は食品安全性において重大な課題をもたらします。
- 迅速な分析のための効率的な検出方法が必要です。
- 毛細管アレイは多重検出能力を高めることができます。
研究の目的
- 核酸検出用のユーザーフレンドリーなカセットを開発すること。
- GMO検出の効率を向上させること。
- 多重核酸検出の研究を促進すること。
使用した方法
- 核酸検出用の小型カセットの製造。
- 多重検出のための毛細管アレイの使用。
- アセトンと脱イオン水で毛細管を洗浄すること。
- 使いやすさのための視覚的検出方法。
主要な結果
- このカセットは複数の核酸を同時に検出することを可能にします。
- 毛細管アレイは検出プロセスの効率を高めます。
- この方法は簡単でユーザーフレンドリーです。
- GMO検出や他の分野での応用の可能性。
結論
- このプロトコルは核酸検出への新しいアプローチを提供します。
- 開発されたカセットは多重検出に効果的です。
- 将来の研究では、バイオテクノロジーでの応用を拡大することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
