キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

この手順の全体的な目標は、操作が簡単な単一のテストで複数の核酸を視覚的に検出するために適用できる、小さくてすぐに使用できるカセットを製造することです。この方法は、遺伝子組み換え生物やGMO検出など、マルチプレックス核酸検出分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。毛細血管を清掃するには、ラボユニフォーム、安全ゴーグル、化学防護手袋を着用してください。

ビーカーに毛細血管を入れます。30ミリリットルのアセトンで毛細血管を5分間洗浄し、有機物を取り除きます。次に、脱イオン水で毛細血管を洗います。

次に、ビーカーに約10ミリリットルの過酸化水素を注いでピラニア溶液を準備します。次に、過熱を防ぐためにゆっくりと振とうしながら過酸化水素に30ミリリットルの硫酸を加えます。溶液が少なくとも30分間、毛細血管を完全に覆っていることを確認してください。

その後、ピラニア溶液を大量の水で洗い流します。キャピラリーをエタノールと脱イオン水でそれぞれ5分間洗浄します。乾燥オーブンで毛細血管を乾燥させます。

次に、PDMSベース試薬とギアリング試薬を50ミリリットルのチューブ内で1対1の比率で秤量します。通常、5グラムのエラストマーベースと5グラムのエラストマー硬化剤を混合します。混合物をガラス棒で約5分間十分に攪拌します。

PDMSを入れたビーカーを真空ベルジャーに入れて30分間脱気します。次に、PDMSをステンレス鋼金型のシリンダーにゆっくりと注ぎます。PDMSを摂氏60度の乾燥オーブンで3時間硬化させます。

PDMSを硬化させた後、円筒形で金型を引き出して金型を取り出します。メスで金型の縁を切り取って、PDMSをシリンダーから取り外します。PDMSをエタノールと脱イオン水で3回洗浄します。

次に、PDMSサポートを窒素で乾燥させます。PDMSサポートの下面を疎水性にするには、PDMSサポートを超疎水性コーティングに1秒間浸します。その後、室温で10分間乾燥させます。

次に、洗浄した4mmキャピラリーをPDMSサポートの穴に挿入し、キャピラリーのゼロポイント5mmをPDMSサポートの上面の外側に残します。毛細血管の端が同じレベルにあることを確認してください。毛細血管の外面とPDMSサポートの上面を疎水性にするには、PDMSサポートの表面の上に15マイクロリットルの超疎水性コーティングを追加します。

超疎水性改質キャピラリーアレイを風乾します。次に、予め設計された順序に従って、1セットのプライマー固定混合物のプライマー固定混合物を1点6マイクロリットル追加して、キャピラリーアレイの対応する1つのキャピラリーを充填する。アレイを標準的な平底96ウェルプレートの透明ウェルに固定し、アレイを摂氏60度で少なくとも2時間乾燥させます。

カセットを組み立てるには、固定されたアレイの上部にローディングアダプターを配置します。アダプターの皿が10本の毛細血管すべての露出部分をちょうど覆っていることを確認してください。LAMP反応混合物を調製するには、テキストプロトコルに従って混合物に試薬を添加し、か焼を加えた後5秒間反応混合物をボルテックスします。

Bstポリメラーゼを添加した後、チューブを20回静かに反転させます。環境中に存在する微量DNAは、LAMP混合物を渡す前に、塩酸1リットルあたり1モルで早期に洗浄することで除去できます。LAMP反応混合物の20マイクロリットルを標準の100マイクロリットルのチップで吸引します。

ローディングアダプターのインレットに先端を挿入してロックします。反応混合物をアダプターの皿に静かに注入します。反応混合物は迅速に皿を満たし、その後、毛細管力によって自動的に毛細管を装填します。

アダプターをロックチップで取り外し、PCR適合の透明シールフィルムでウェルをシールします。次に、キャピラリーアレイをインキュベーターで摂氏63度のインキュベーターで1時間インキュベートします。蛍光発光の画像を取得するには、UV懐中電灯を使用して解離したか焼を励起し、蛍光を発します。

キャピラリーアレイの上部から、デジタルカメラまたはスマートフォンで画像をキャプチャします。画像を撮るときは、カメラが毛細血管の領域にできるだけズームインして、高品質で鮮明な画像を取得するようにしてください。次に、画像解析ソフトウェアで画像を開きます。

次に、画像、金型、グレースケール、はいと画像、金型、16ビット、はいを選択します。ファイル、名前を付けて保存、形式、TIFFを選択して、画像を16ビットTIFF形式に変換します。蛍光強度の値を抽出するには、マイクロアレイ解析ソフトウェアを開きます。

16ビットTIFF形式の画像をソフトウェアのインターフェースにドラッグし、波長532ナノメートルと緑色の色を選択して画像を表示します。次に、キャピラリーからの蛍光シグナルを特定するための新しいブロックを作成します。ツール、新しいブロックを選択し、列と行の数をブロックと機能のインターフェイスに 1 対 1 と 2 対 5 として個別に配置します。

右クリックしてフィーチャ モデルを選択します。次に、毛細血管の蛍光領域に合うように位置と直径を調整します。[解析]を選択して、蛍光強度の値を抽出します。

最後に、ファイルを選択し、設定を名前を付けて保存して、ブロックのドキュメントを保存します。次に、選択、ファイル、蛍光強度結果を保存するように結果を保存します。ここに示されているのは、キャピラリーアレイのレイアウトです。

キャピラリー1〜8、LAMPプライマーセットが接頭辞として付けられています。キャピラリー9と10は2を表し、プライマーコントロールはありません。ここに示されているのは、遺伝子組み換えトウモロコシMON863を検出するための蛍光写真で、緑色は正のLAMP増幅を表しています。

増幅が成功し、予想されるキャピラリー1、6、7、8でのみ提示され、ブランクキャピラリー間の汚染はありません。この蛍光写真は、GMOミックスの検出用です。緑色は正のLAMP増幅を示しました。

増幅の成功は、予想されるキャピラリー1、4、5、6、7、および8でのみ示され、ブランクキャピラリー間の汚染はありませんでした。ここに示されている蛍光写真は、非遺伝子組み換えトウモロコシの検出用であり、緑色は正のLAMP増幅を示しています。成功した増幅は、予想されるキャピラリー8でのみ示され、ブランクキャピラリー間の汚染はありませんでした。

この検出手順を習得すれば、適切に実行すれば1ポイント5時間で完了します。このビデオを見れば、複数の核酸検出を行うためのキャピラリーベースのカセットの作製方法について十分に理解できるはずです。