Name: 骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶクリックケミストリーによるBMP2変異体のサイト向け固定法。骨欠損治療における副作用を低減し、低用量で骨形成を促進するスカフォールド製造技術を確立する方法です。

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著者は、プラスミド ピロリジル tRNA のエンコーディングを提供して pRSFduet pyrtRNAsynth 対応するアミノアシル tRNA 合成酵素のエンコーディングを提供するため博士 M. Rubini (コンスタンツ、ドイツ) をありがとうございます。

1. BMP2 のバリアントの BMP2 K3Plk の生産
<ol><li>クローニングの BMP2-K3Plk PCR を使用してサイト指示された突然変異誘発によって12<ol>
<li>人間の成熟した BMP2 を増幅 (hmBMP2) p25N hmBMP2 ベクトルから (材料の表を参照してください) 前方のプライマー (5' 3' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC) で逆プライマー (5' 3' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT) 導入、黄色停止コドン (タグ) BMP2´s 成熟した部分の最初のリジンの位置にあります。前方のプライマー (10 pmol/μ L)、逆プライマー (10 pmol/μ L)、p25N hmBMP2 (10 ng/μ L) の 1 μ L の 1.5 μ L の 1.5 μ、10 μ M dNTP 原液 1.5 μ 33.5 μ L H2O、10 μ L の PCR 反応混合物の PCR の反作用を実行します。、、1 μ L の DNA ポリメラーゼ (材料表参照) サーマルサイクラー (変性 95 ° C、5 分で 1 分、1 分、72 ° c 1 分、伸長、72 ° C 10 分で最後の拡張のための 60 ° C で熱処理の 95 ° C で変性の 30 サイクル) で。</li>
		<li>製造元の推奨事項に従う、市販のキットを使用して PCR の製品の浄化 (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 45 分の 37 ° C で制限の酵素 NdeI と PCR の製品を消化 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。5 分ダイジェスト 37 ° C H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 1 時間で制限の酵素病原と PCR の製品のために 65 ° C で酵素を熱不活性 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。熱-5 分で 80 ° C で酵素を不活性化します。</li>
		<li>H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA の使用時間は 2 時間 45 分の 37 ° C で NdeI と pET11a pyrtRNA のベクトルを消化 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。熱-不活性化 65 ° c 5 分ダイジェスト 1 h H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 37 ° C で病原と pET11a pyrtRNA のベクトルの (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。5 分で 80 ° C で熱不活化します。</li>
		<li>未消化のベクトルから消化のベクトルを分離し、(0.8% アガロース、100 V で 60 分間) の電気泳動のゲルの agarose によって消化の残党。100 を使用して 2 時間 (RT) 室温で消化 pET11a pyrtRNA バックボーンを持つ消化 BMP2 K3TAG 挿入を縛る pET11a pyrtRNA バックボーンと 34.5 の ng BMP2 K3TAG 挿入 (モル比 1:3) の ng。反応混合物は、DNA のバックボーンと挿入、リガーゼ バッファー 2 μ、1 μ L の DNA リガーゼと H2O 20 μ L の総ボリュームに含まれます。</li>
		<li>BL21(DE3) 細菌 pSRF デュエット pyrtRNAsynth ・ pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 共同変換を実行します。<ol>
<li>50 を追加、微生物のそれぞれのプラスミッドの ng は氷の 30 分間、50 の 42 ° C で熱ショックに混合物を配置 s、5 分間氷の上置いて、混合物で 500 μ L のホストゲノム スープ (LB) 培地を追加、60 分 300 rpm で振る。</li>
			<li>予め温めておいたカナマイシン (50 μ g/mL) に細菌の混合物の 100 μ L を広める/アンピシリン (100 μ g/mL) プレートと 37 ° C で一晩インキュベート</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>BMP2 K3Plk の発現と精製13,14<ol>
<li>カナマイシンの 50 μ g/mL と 37 ° C でアンピシリンの 100 μ g/mL の LB 培地 50 mL で一晩単一コロニーを伝達します。</li>
		<li>素晴らしいスープ (TB) 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリン、100 μ g/mL と 800 mL に一晩文化 1:20 を希釈し、0.7 の OD600に到達するまで、37 ° C で成長します。10 mM の最終的な集中にプロパルギル L-リジンを追加します。イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (誘導) 前に文化から 100 μ L のサンプルを収集します。</li>
		<li>最終濃度 1 mM の IPTG の添加により遺伝子の発現を誘導します。180 rpm で軌道シェーカーの 16 h の 37 ° C で文化を育てます。文化から 100 μ L のサンプルを収集します。</li>
		<li>遠心分離機の 9000 x g で 30 分間破棄で全体の文化の上澄みと 1: 1000 (v/v) 2-メルカプトエタノール (たて追加) と TBSE バッファー (トリス、150 mM の NaCl、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 10 mM) の 30 mL の細菌のペレットを再懸濁します。 注意: ハンドル 2-メルカプトエタノール ヒューム フードの下で。皮膚および眼との接触を避けます。蒸気やミストの吸入を避けます。ヒューム フードの下 2-メルカプトエタノールを含むバッファーをすべての再懸濁の手順を実行します。</li>
		<li>空遠心ビーカーの重さし、空のビーカーにペレットを再懸濁を転送します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットとビーカーの重量を量る。ペレットの重量を計算する空のビーカーの重さを引きます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。短期的に-20 ° c または長期的には-80 ° C でペレットを凍結します。プロトコルを再開する時に解凍室温ペレット</li>
		<li>STE バッファー (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM 塩化ナトリウム; 1 mM EDTA、375 mM ショ糖 1: 1000 (v/v) 2-メルカプトエタノール (たて追加)) にペレットを再懸濁します。ペレットのすべての 10 g を 200 mL の STE バッファーを使用します。</li>
		<li>氷 (10 分 40 秒パルス、20 s ブレーキ 30% 振幅) の懸濁液を超音波照射します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。超音波処理、遠心分離手順を 4 回繰り返します。</li>
		<li>TBS バッファー (10 mM トリス、150 mM の NaCl) 100 mL にペレットを再懸濁します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。</li>
		<li>新しく追加された 80 U/mL のヌクレアーゼ (例えばBenzonase) とヌクレアーゼ バッファー (100 mM トリス、1 mM EDTA、3 mM MgCl2) にペレットを再懸濁します 10 mL/g のペレットを使用しています。一晩攪拌板 (30 rpm) で RT の懸濁液を孵化させなさい。</li>
		<li>トリトンのバッファーを追加 (60 ミリメートルの EDTA、1.5 M の NaCl、6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) フェニル - ポリエチレング リコール) 懸濁液を。追加するトリトン バッファーのボリュームは、懸濁液の 0.5 のボリューム部分に対応しています。RT (攪拌なし) で 10 分間インキュベートします。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。</li>
		<li>TE バッファー (100 mM トリス、20 ミリメートルの EDTA) でペレットを再懸濁します 8 mL/g のペレットを使用しています。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。</li>
		<li>25 mM NaAc pH 5.0 の 4 mL/g と 1 mM ジチオトレイトール (DTT) (たて追加) と 6 M GuCl の 5 mL/g を追加することでペレットを再懸濁します。4 ° C で攪拌板 (30 rpm) で一晩懸濁液を孵化させなさい。</li>
		<li>20 分間 75,500 × g で遠心分離機します。上清には、単量体 BMP2 胞が含まれています。上澄みと集中、集中 3 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 膜を用いた 20 OD/mL にこの抽出細胞 (材料の表を参照) を収集します。</li>
		<li>(30 rpm) を攪拌しながら、濃縮モノマーを単一液滴の下のバッファー (2 M LiCl、トリス、50 mM 25 mM チャップス、5 ミリメートルの EDTA、1 mM のグルタチオンの二硫化物 (GSSG) 2 mM グルタチオン (GSH)) に追加します。暗闇の中で 120 h 室温で孵化させなさい。 注: この潜伏期間中に、ぜんぶを巻き戻し。この手順以降からソリューションには、折り畳まれた二量体の BMP2 K3Plk が含まれています。</li>
		<li>集光セル 10 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 膜を用いた透析解決集中された塩酸 Dialyze 1 mM 塩酸集中に対してソリューションを使用して 3.0 に溶液の pH を調整します。</li>
		<li>バッファー (20 mM NaAc、30% イソプロパノール) を追加することによってソリューションを平衡します。ソリューションの 30% のボリュームに対応するバッファー A のボリュームを追加します。15 分間 4700 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム15 150 mL のバッファー A. 負荷平衡する列にタンパク質溶液をイオン交換コラムを平衡させ。バッファー B (20 mM NaAc、30% イソプロパノール、2 M の NaCl) の線形グラデーションを使用して分数を溶出バッファー * 収集 2 mL 分画の 100 mL を使用しています。 注: は、合計列ボリュームに従って列にロードする前にタンパク質を集中します。最終的なタンパク質の量をする必要があります < 合計列ボリュームの 5%。</li>
		<li>SDS ポリアクリルアミドのゲル (12%) の電気泳動 (SDS-PAGE) 16と Coomassie ブリリアント ブルー染色17 (材料の表を参照) によって各画分の 20 μ L を分析します。 注: Coomassie ブリリアント ブルー染色 SDS ページのゲル番組分数ダイマー (26 kDa) とモノマー (13 kDa) を含有する画分を含みます。</li>
		<li>二量体を含む画分をプールします。一晩で 1 mM 塩酸 (5 リットルの容量) に対して 4 ° C 分数を含むダイマーのプールを dialyze します。遠心ろ過ユニットを集中 10 kDa を使用して最終製品を集中 (材料の表を参照してください)。(12%) SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と Coomassie ブリリアント ブルー染色により最終製品を分析します。 注: Coomassie ブリリアント ブルーのバンド染色 SDS ページのゲル 26 kDa で 1 つだけのバンドが表示されます。最終 BMP2 K3Plk 製品です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 銅 (I) の最適化-アルキン-アジ化環化付加反応 (CuAAC) 条件を触媒
<ol><li>及ぼすアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) および銅の (II) 硫酸塩 (CuSO 4 )野生型 BMP2 の (BMP2 WT)<ol>
<li>20 μ M をインキュベート CuSO4NaAsc の縦横比の異なる BMP2 WT。50 μ L のボリュームで 0.5 mM NaAsc と 0.5 mM CuSO4 (開始濃度) を使用します。CuSO4NaAsc の次の比率を続行: (1:1)、(1.7:1)、(10:1)、(20:1)、0.5 mm CuSO4濃度を一定に保つことと NaAsc の濃度を適宜調整すること。一晩室温 H2O 回転ミキサー (20 rpm) 上の反応を実行します。</li>
		<li>5 %2-メルカプトエタノールを含む読み込みバッファーを追加することによって縮小サンプルを準備し、6 分分析が減少し、SDS ポリアクリルアミドによる試料の非減少ゲル (12%) の電気泳動 (SDS-PAGE) および Coomassie ブリリアント ブルー染色の 95 ° C でサンプルをインキュベートします。SDS ページのゲルを染色 Coomasie 26 kDa と高分子量 (非還元条件) 13 kDa (減らされた条件) の範囲にバンドを示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
効果 Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) CuAAC 反応アミン (THPTA)
	<ol>
<li>20 μ M をインキュベート CuSO4THPTA の縦横比の異なる BMP2 K3Plk。5 mM NaAsc、および 200 μ M 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin (NaAsc と 3 アジドフェニル-7 hydroxycoumarin を一定に保つ) を使用します。濃度を開始として 50 μ M THPTA と CuSO4の 0.5 mM を使用します。CuSO4THPTA の異なる比率を使用: (7:1);(10:1);(12:1);(15:1);(20:1). 回転ミキサー (20 rpm) に常温 24 h の H2O の反応 (容量 50 μ L) を実行します。</li>
		<li>カップリング、時に 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin 蛍光色素になります。削減と非還元条件下でサンプルを準備し、SDS ページによってそれらを分析します。3 アジドフェニル 7 hydroxycoumarin の特定の波長で励起チャンネルの下でゲルを視覚化 (λabs = 404 nm; λem = 477 nm)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 共有カップリング法アジに BMP2 K3Plk 修飾アガロース ビーズ
<ol><li>20 μ L の反応バッファー (0.1 M HEPES pH 7.0、3.9 M 尿素 50 μ M CuSO4, 250 μ M THPTA、5 mM アスコルビン酸ナトリウム) で 500 μ L の総ボリュームでアジ化アクティブ アガロース ビーズと BMP2 K3Plk または BMP2 WT (ネガティブ コントロールとして使用) の 20 μ M をインキュベート、rotati の RT で 2 hng ミキサー (20 rpm)。5 mM EDTA (最終濃度) の追加によって反作用を停止します。</li>
	<li>回転ミキサー (20 rpm) で 15 分間室温でインキュベートします。遠心分離機のルート収集で 1 分の 20,000 × g でサンプル培養上清。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1,000 μ L で 4 M MgCl2、1,000 μ L で、2 回 3 回 3 回 HBS500バッファー (50 mM HEPES、500 mM の NaCl) の 1,000 μ L でビーズを含むペレットを洗浄します。すべての洗濯の段階で RT で 1 分の 20,000 × g で遠心分離し、培養上清を収集します。4 ° C で 1,000 μ L の PBS で結合ビーズを格納します。 注意: は、上清を除去しながらビーズ ペレットを不可します。</li>
</ol>4. 存在と固定化 BMP2 K3Plk を使用してテキサス赤の生物学的活性を検証するというラベルの付いた BMP 受容体私の外部ドメイン (BMPR IA EC )
<ol><li>インキュベート 50 μ L BMP2 K3Plk 修飾ビーズのテキサス赤の 1 μ m というラベルの付いた BMPR IAEC HBS500バッファー (50 mM HEPES、500 mM の NaCl) の 150 μ L で RT で、回転ミキサー (20 rpm) で 1 時間。</li>
	<li>破棄した上清で 1 分の 20,000 × g でビーズを遠心します。HBS500バッファーの 1000 μ L でビーズを洗浄します。追加の洗浄のステップを 3 回繰り返します。20,000 × g で遠心するそれぞれの後 RT で 1 分間洗浄のステップ。</li>
	<li>500 μ L の PBS のビードを再停止しなさい、カバー スライド ガラス上の 50 μ L をピペットします。561 または 594 nm 間顕微鏡のフィルターを設定します。テキサス赤-BMPR-IAECを検出-BMP2-K3Plk 修飾ビーズ蛍光顕微鏡と画像を使用します。</li>
</ol>5. アルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) の測定前に BMP2 K3Plk を生産とのカップリング反応の後の体外活性を証明する表現。
<ol><li>
アルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) アッセイ
	<ol>
<li>Promyoblastic C2C12 細胞 (ATCC CRL-172) でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 胎児の子牛血清 (FCS)、100 U/mL ペニシリン G 37 ° c で 5% CO2加湿雰囲気で 100 μ g/mL ストレプトマイシンとの文化.</li>
		<li>3 × 104細胞/ウェルの 96 ウェル マイクロ プレートへの密度で C2C12 細胞を播きます。セルの一晩を添付しましょう。培地を取り除き、0.5-200 の存在下で C2C12 細胞をインキュベート 100 μ L/ウェル DMEM (2% の FCS、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL ストレプトマイシン) の 37 ° c 5% CO2 72 h で加湿雰囲気で BMP2 WT の BMP2 K3Plk nM。</li>
		<li>培地を取り除き、pbs 100 μ L/ウェルの細胞を洗浄します。換散バッファーの 100 μ L/ウェルで 1 h の RT で細胞を溶解 (1 NP 40%、0.1 M のグリシン、pH 9.6、1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) の水平振動板 (220 rpm)。</li>
		<li>細胞ライセートに 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (たて追加) を 100 μ L/ウェル ALP バッファー (0.1 M のグリシン、pH 9.6、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2) を追加します。</li>
		<li>405 で吸収を測定色の開発が完了するまで ALP バッファー、および 5 分ごとの追加後マルチ プレート リーダーで nm。用量応答曲線とロジスティック モデルを用いた EC50 値生成 y = A2 + (1-2)/(1 + (x/0x)p)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アルカリホスファターゼ (ALP) の汚損
	<ol>
<li>Promyoblastic C2C12 細胞 (ATCC CRL-172) でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児の子牛血清 (FCS)、100 U/mL ペニシリン G 37 ° c で 5% CO2加湿雰囲気で 100 μ g/mL ストレプトマイシンとの文化.</li>
		<li>まあ 96 ウェル マイクロ プレートで/3 × 104セルの密度で C2C12 細胞を播きます。セルの一晩を添付しましょう。培地を取り除き、BMP2 K3Plk 結合ビーズの 20 μ L/ウェルを追加します。BMP2 K3Plk 結合ビーズは、PBS の懸濁液の 1000 μ L。</li>
		<li>DMEM で 0.4% 低融点アガロース溶液を準備します。電子レンジ (600 W 3 分間) で溶かすし、冷まします 37 ° c の水浴中に使用されるまで。</li>
		<li>各ウェル (カバー ビーズと細胞) に 0.4% 低融点アガロースの 20 μ L を追加します。2000 x g で 20 ° C で 5 分間遠心80 μ l 添加 DMEM (2% の FCS、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL ストレプトマイシン) し, 72 時間の 5% CO2で加湿雰囲気で 37 ° C で。</li>
		<li>凝固の 0.4% の agarose が外れないように注意しながら、中を削除します。ステップ 1 NBT の 100 μ L/ウェルを追加/BCIP (ニトロ ブルー テトラゾリウム塩、5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-トルイジン塩) 基板の解決。</li>
		<li>アルカリホスファターゼ染色直後に明らかになる紫染色顕微鏡を使用して分析します。明視野顕微鏡を使用し、写真を撮る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

遺伝子コドンの展開によってタグの蛋白質の変形が主主蛋白質シーケンスの任意の位置でさまざまな非天然アミノ酸類似の導入。BMP2 のような Bmp の場合一般的なタグのような (彼の) 6 ヒスチジンの札はできるだけ protein´s C ターミナル端タンパク質立体構造の中に埋もれた、こうして外からアクセスできないので N 末期に導入されました。他のポジションで導入されたタグのサイズは非常に高いその結果 BMP´s 活性を消し去る構造変化を引き起こす可能性があります。さらに、突然変異を導入することに BMP2 シーケンス リフォールディングの有効性に影響を与えることができるそして修飾タンパク質の等電点など他の蛋白質のパラメーターを変更することも。従って、確立された蛋白質の生産のプロトコルのすべての 1 つのステップは、変えられた蛋白質 variant´s の特性に合わせて適応する必要があります。BMP2 K3Plk の生産は確かに野生型 BMP2 の式に確立された方法の変更を必要です。異文化時代やプロパルギル-L-リジン (Plk) 濃度がテスト (データは示されていない) 式収量に達するために。リフォールディング、分離・精製の手順幸いな...

骨の組織工学・骨再生の究極の目標は、短所と非組合骨折の一般的な治療法の中に発生する制限を克服することです。自動または同種移植は、いくつかの欠点をもっていても現在の治療戦略として主に使用されます。理想的な骨移植が骨延長術における骨、骨移植片の osteointegration につながると同様、新鮮を誘発します。今日では、のみ自動移植は、理想的な骨移植のすべての特徴を提供するので、「ゴールド スタンダード」と見なされます。残念ながら、それはまた、長い手術時間や通常 (例えば、慢性的な痛み、血腫形成、感染症、化粧品の欠陥、等) の多くの合併症を伴う第 2 外傷サイトなど、重要な負の側面を提示します。同種移植は、一方、すべての一般的な側面1の準の特徴であります。代替骨移植技術は、骨、骨伝導、生体親和性と生体吸収性足場を生産する目的で、ここ数年で改善されています。以来、多くの生体材料はすべてのこれらの骨の特性を示さない、BMP2 と BMP7 は、主にさまざまな成長要因は特定足場2の骨の可能性を改善するためにされています。
必須条件としてこのような成長因子の配信システムは、細胞の動員と添付ファイル、セル成長および血管新生のような重要なイベントを促進するために時間をかけて量を制御リリースを提供する必要があります。ただし、bmp 形式だけでなく、他の骨の成長因子がされている一般的固定非共有結合3。わなに掛ける事と吸着技術の深刻な欠点生体内で骨増殖を誘導することによって周囲の組織に影響を与える一般的につながる初期バースト リリースによる蛋白質の超生理量の使用が必要炎症や腫れ、融解4。したがって、時間の長い期間のための配信サイトで成長因子の保持を共有結合固定化方法で実現できます。BMP2 を化学的に変更 (サクシニル化5、アセチル化6またはビオチン化7) 設計する8、または BMP2 派生オリゴペプチド9を設計されているし、限界を克服するために関連するには吸収。ただし、配置可能性がある細胞の受容体に固定化リガンドの結合を阻害するので、これらの構成体の生物活性は予測できません。前に示したとして活性リガンド-受容体複合体の形成に関与するすべての 4 受容体鎖が完全にすべての下流のシグナル伝達カスケード10をアクティブにするために固定化 BMP2 と対話が不可欠です。
生物活性、安定性、および固定化因子の生体利用率の点で限界の不均質製品結果の問題を克服するためには、共有サイト指示された方法で足場をバインドできる BMP バリアントを設計されています。このバリアントは、BMP2-K3Plk と呼ばれるには、遺伝子コドン拡張11によって導入された人工アミノ酸が装備されています。このバリアントは、その生物学的活性を維持しながら共有結合の結合戦略を使用して足場に正常にリンクされています。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step NBT/BCIP</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー34042</td><td>細胞に溶液を加える</td></tr><tr><td>3-アジド-7-ヒドロキシクマリン</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>クリック反応に使用される化学薬品</td></tr><tr><td>アガロース低融点</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>ALPアッセイ用アガロース&nbsp;</td></tr><tr><td>アジドアガロースビーズ</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>CLK-1038-2</td><td>反応用ビーズ</td></tr><tr><td>BamHI (Fast Digest enzyme)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FD0054</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>BMP受容体 IA (BMPR-IAEC)</td><td>--</td><td>--研究室</td><td>で製造</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>SDS PAGEのCoomassie Brilliant Blue染色に使用される化学物質</td></tr><tr><td>硫酸銅 (II) 無水物 (CuSO4)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td><td>クリック反応に使用される化学物質</td></tr><tr><td>DNAポリメラーゼおよび反応バッファー&nbsp;</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA HiFi PCRキット</td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」培地 (DMEM) GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>クリック反応を止めるために使用される化学薬品</td></tr><tr><td>イソプロピル &szlig;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2316.5</td><td>細菌誘導 (1mM 最終濃度)&nbsp;</td></tr><tr><td>NdeI (Fast Digest enzyme)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ER0581</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>NHS活性化 Texas Red</td><td>Life technologies</td><td>T6134</td><td>受容体P</td></tr><tr><td>-ニトロフェニルリン酸</td>結合 <td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>アルカリホスファターゼ</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2&nbsp;</td><td>--</td><td>--</td>プラス<td>ミドはWalter SebaldからJ. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA</td>に提供されました<td>-</td><td>--</td>ヴ<td>ュルツブルク大学薬剤学および生物薬学講座から提供</td></tr>されました <tr><td>プロパルギル-L-リジン(Plk)</td><td>--</td><td>--ヴ</td><td>ュルツブルク大学薬剤学および生物薬学講座より提供</td></tr>されました <tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td><td>-</td><td>---</td><td>ヴュルツブルク大学薬剤学および生物薬学講座</td></tr>提供 <tr><td>Qiagen ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ゲル精製</td></tr><tr><td>Qiagen PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR精製&nbsp;</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>クリック反応に使用される化学薬品</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ThermoScientific</td><td>EL0011</td><td>ライゲーション&nbsp;</td></tr><tr><td>トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)</td><td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>クリック反応に使用される化学薬品</td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100&nbsp;</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon濃縮細胞400ml&nbsp;</td><td>メルクKGaA</td><td>UFSC40001</td><td>濃縮ユニット</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15遠心フィルターユニット</td><td>メルクKGaA</td><td>UFC901024</td><td>濃縮遠心ユニット</td></tr><tr><td>&Auml;KTA前衛FPLC&</td><td>Auml;KTA</td><td>--</td><td>FPLC機</td></tr><tr><td>アバンティ J-26XP</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>393124</td><td>細菌培養用遠心分離機</td></tr><tr><td>バクテリアシェーキングインキュベーター</td><td>Infors HT</td><td></td><td>細菌培養用シェーキングインキュベーター</td></tr><tr><td>FluorChem Q system</td><td>proteinsimple</td><td>--</td><td>SDS-PAGE蛍光ミスクロスコープ用イメージング・解析システム</td></tr><tr><td></td><td>キーエンス</td><td>BZ-9000 (BIOREVO)</td><td></td></tr><tr><td>Fractogel&reg;EMD SO3- (M)</td><td>Merck KGaA</td><td>116882</td><td>イオン交換クロマトグラフィーカラム材料</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg;&nbsp;96ウェルプレート</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>細胞培養用96ウェルプレート(ALPアッセイ)</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td><td>--</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>75003624</td> Rotor for <td>Microcentrifuge for plate during ALP staining</td></tr><tr><td>Microcentrifuge - 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td>--</td><td>ALPアッセイデータの統計解析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Polysine Slides</td><td>ThermoScientific</td><td>10143265</td><td>microscope slides</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>●</td><td>アバンティJ-26XP遠心分離機</td></tr><tr><td>ローターJLA8.1</td><td>ベックマンコールター用ローター&nbsp;</td><td>●</td><td>アバンティJ-26XP遠心分離機</td></tr><tr><td>用ローターJA25.50</td><td>ベックマンコールター&nbsp;</td><td>--</td><td>Avanti J-26XP 遠心分離機</td></tr><tr><td>Tecan infinite M200 マルチプレートリーダー</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td> <td>用</td><td></td></tr>ローター <tr><td>Thermocycler - Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td> <td>-</td><td>-PCR</td></tr><tr><td>TxRed - 顕微鏡フィルター</td> 蛍光顕微鏡用<td>キーエンス</td><td></td><td>フィルター&nbsp;</td></tr><tr><td>限外ろ過再生セルロースディスク 3 kDa</td><td>メルク KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>アミコン濃縮セル 400ml</td></tr><tr><td>限外ろ過再生セルロースディスク 10 kDa</td><td>メルク KGaA</td><td>PLGC04310</td><td>アミコン濃縮セル 400ml</td></tr></tbody></table>

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

ヒーリング以外の長い骨欠損の治療のための別の治療戦略を集中的に検討しました。骨形成タンパク質 (Bmp) などの骨の成長因子との組み合わせで生体材料の利用につながっているいくつかの制限の現在の処置は現在使用。一般的な吸収またはカプセル化方法には、通常いくつかの深刻な副作用を誘発するいわゆる初期バースト リリース効果に終って BMP2 のスープラ生理量が必要。これらの問題を克服するための可能な戦略は、共有結合タンパク質を足場にカップルことでしょう。さらに、再現性のある製品の結果を保証するために、サイト固有の方法で結合を実行必要があります。したがって、我々 はコドン利用拡大 (BMP2 K3Plk) によって BMP2 タンパク質の成熟した部分に人工アミノ酸 (プロパルギル L-リジン) は導入された BMP2 バリアントを作成しました。BMP2 K3Plk 銅触媒アジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) を通して官能ビーズに結合されていました。体外結合 BMP2 K3Plk の生物学的活性が証明され、BMP2 K3Plk 修飾ビーズ貪食は、セルベースのアッセイで証明されました。C2C12 細胞と接触して機能性ビーズがビーズ ローカル制限近接でアルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) 発現を促すことができます。本手法での機能性足場を作り出すことがこのように、骨系統への分化をトリガーすることができます。さらに、BMP2 の低用量で結合 BMP2 のサイト向けの配向を制御のために十分です。この方法では、Bmp は要因がサイト指示されたカップリング技術を介して結合されている場合、そうではない適切な向きで細胞表面上の受容体に常に公開されます。製品の結果が非常に制御可能なしたがって、重要なサイズの修理のための適用性を向上、均質な特性を持つ素材の結果骨の欠陥。

この記事では官能基化市販アジ アガロース ビーズ (図 1) に共有 BMP2 変種は、BMP2-K3Plk 手法について述べる。作り出された BMP2 K3Plk バリアントの生理活性は、C2C12 細胞におけるアルカリホスファターゼ (ALP) 遺伝子発現の誘導によって検証されました。生体外でテストは野生型 BMP2 による同様の ALP 発現レベルを示しています (BMP2 WT) と BMP2 K3Plk (図 2)。
銅の (II) 硫酸塩 (CuSO4) とアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) の酸化還元反応では、構造の整合性に影響を与える可能性があります、したがって BMP2 K3Plk の生理活性に影響を与える活性酸素種を生成します。CuSO4と NaA...

骨形態形成タンパク質 2 (BMP2) をドープした生体材料は非組合骨折を癒すために新しい治療戦略として使用されています。因子の手に負えないリリースから生じる副作用を克服するためにサイトに新しい戦略を提案する-従って骨機能の向上と材料を作成する要因を直接固定します。

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

この研究の全体的な目標は、クリックケミストリーによる新しく設計されたBMP2バリアントの部位指向性および共有結合による骨形成足場の堅牢で再現性のある生産です。この方法は、長骨欠損の非治癒の治療に一般的に使用される技術に関連する問題を克服するのに役立ちます。吸収またはカプセル化の方法には、いくつかの重篤な副作用を引き起こす超生理学的量のBMP2が必要です。この手法の主な利点は、新しく設計されたBMP2バリアントを少量使用し、側面を向いた方法で足場に共有結合させることです。50ミリリットルのLB培地で、50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンと100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを摂氏37度で一晩繁殖させます。一晩の培養物を1〜20に希釈し、50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンとアンピシリン1ミリリットルあたり100マイクログラムを補充した800ミリリットルの素晴らしいブロス培地に希釈します。600ナノメートルの光学密度が0.7に達するまで、摂氏37度で培養物を成長させます。次に、プロポフォールL-リシンを最終濃度10ミリモルまで添加します。.IPTGを添加することにより、最終濃度が1ミリモルになるように遺伝子発現を誘導します。37°Cで180RPMのオービタルシェーカーで16時間培養します。インキュベーション後、全培養物を9, 000倍gで30分間遠心分離します。上清を捨て、細菌ペレットを30ミリリットルのTBSE緩衝液に再懸濁します。空の遠心分離機ビーカーの重量を量り、再懸濁したペレットを空のビーカーに移します。次に、再懸濁したペレットを6,360倍gで20分間遠心分離します。上清を捨て、ビーカーとペレットの重さを量ります。空のビーカーの重量を差し引いて、ペレットの重量を計算します。次に、ペレットをSTEバッファーに再懸濁します。ペレット10グラムごとに200ミリリットルのSTEバッファーを使用してください。懸濁液を氷上で超音波処理してから、6,360倍gで20分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットの重さを量ります。超音波処理と遠心分離のステップを4回繰り返した後、ペレットを100ミリリットルのTBS緩衝液に再懸濁します。6、360倍gで20分間遠心分離します。次に、上清を捨ててペレットの重さを量ります。ペレット1グラムあたり10ミリリットルを使用して、新たに添加したヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ緩衝液にペレットを再懸濁します。懸濁液を室温で30 RPMの撹拌プレート上で一晩インキュベートします。翌日、サスペンションにTriton Bufferを追加します。追加するTriton Bufferの容量は、懸濁液の0.5容量部分に相当します。室温で10分間インキュベートした後、懸濁液を6,360回gで20分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットの重さを量ります。次に、ペレット 1 グラムあたり 8 ミリリットルを使用して、ペレットを TE バッファーに再懸濁します。前回と同様に遠心分離した後、上清を捨て、ペレットの重量を量ります。次に、25ミリモルの酢酸ナトリウムPH5をグラムあたり4ミリリットル、および6モルの塩化グアニジンを1ミリリットルのDTTで1グラムあたり5ミリリットルを追加して、ペレットを再懸濁します。懸濁液を攪拌プレート上で摂氏4度で一晩インキュベートします。75.500回gで20分間遠心分離した後、上清には折り畳まれたモノマーBMP2タンパク質が含まれます。上清を収集し、濃縮セル内の分子量3キロトンのカットオフメンブレンを使用して、この抽出物を1ミリリットルあたりの光学密度20まで濃縮します。攪拌しながら、濃縮モノマーを1滴でRenaturation Bufferに加えます。次に、溶液を室温で暗所で120時間インキュベートします。1ミリモルの塩酸に対して溶液を透析する前に、濃塩酸を使用して溶液のpHを3.0に調整します。濃縮細胞内で10キロダルトンの分子量カットオフメンブレンを使用して透析溶液を濃縮します。次に、タンパク質溶液を平衡化したカラムにロードし、バッファーBの線形グラジエントを使用してフラクションを希釈し、2ミリリットルのフラクションを収集します。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くCoomassie Brilliant Blue染色により、各画分の20マイクロリットルを分析し、モノマーを含む画分と二量体を含む画分を決定します。次に、フラクションを含むプルダイマー。5リットルの1ミリモル塩酸に対して、摂氏4度で一晩分画を含む二量体のプールを透析します。10キロダルトンの濃縮遠心フィルターユニットを使用して製品を濃縮してから、SDS-PAGEおよびCoomassie Brilliant Blue染色で最終製品を分析します。ネガティブコントロールとして使用されるBMP2-K3PlkまたはBMP2-whileタイプの20マイクロモルと、反応バッファー中の20マイクロリットルのアジド活性化アガロースビーズを総容量500マイクロリットルで組み合わせます。20 RPMの回転混合物で室温で2時間インキュベートします。最終濃度の5ミリモルEDTAを添加して反応を停止します。溶液を室温で15分間、回転ミキサーで20 RPMでインキュベートします。次に、サンプルを室温で1分間20、000倍gで遠心分離し、上清を収集します。次に、ビーズを含むペレットを1, 000マイクロリットルのHBS 500バッファーで洗浄します。室温で1分間、20, 000倍gでサンプルを遠心分離し、上清を収集します。この洗浄手順をHBS 500バッファーでさらに2回、4モル塩化マグネシウムで3回、PBSで2回繰り返し、毎回上清を収集します。結合ビーズを摂氏4度のPBS1, 000マイクロリットルに保管します。テキストプロトコルに記載されているようにALPアッセイを実施します。ALP染色を行うには、前芽球性C2C12細胞をDMEMで、10%のウシ胎児血清と100単位/ミリリットルのペニシリンGおよびストレプトマイシンを37°Cで、5%二酸化炭素の加湿雰囲気で培養します。C2C12細胞をウェルあたり30, 000細胞の密度で96ウェルマイクロプレートに供給します。細胞を一晩接着させた後、培地を取り出し、PMB2-K3PLK結合ビーズのウェルあたり20マイクロリットルを追加します。次に、各ウェルに0.4%低融点アガロースを20マイクロリットル加えます。96ウェルマイクロプレートを2, 000倍gで20°Cで5分間遠心分離します。次に、同じ媒体を80マイクロリットル追加します。5%二酸化炭素の加湿雰囲気下で摂氏37度で72時間インキュベートします。インキュベーション後、固化した0.4%アガロースを剥がさないように注意しながら培地を取り出します。ワンステップMBT-BCIPサブストレート溶液のウェルあたり100マイクロリットルを追加します。パープル染色が明らかになった直後に、光学顕微鏡を使用してアルカリ性ホスファチデート染色を分析します。明視野顕微鏡を使用して写真を撮ります。新たに作製したBMP2-K3Plk変異体の生理活性は、C2C12細胞におけるアルカリホスファターゼ遺伝子発現の誘導によって検証されます。in vitro試験では、BMP2型またはBMP2-K3Plk型のいずれかによって誘導される同様のアルカリホスファターゼ遺伝子発現レベルが示されました。カバー触媒アジドアルキンシクロ付加を介してBMP2-K3Plkでコーティングされたビーズは、二標識されたBMP受容体1Aエコドメインとインキュベートすると蛍光を示しました。BMP受容体1AのBMP2-K3Plkへの結合は、カップリング後の生理活性の保持を確認する。BMP2-K3Plk官能基ビーズの生理活性は、ALP媒介染色によって証明されました。染色は、BMP2-K3Plk官能基ビーズと直接接触した細胞でのみ行われ、タンパク質が単に吸収されるだけでなく、実際にビーズと共有結合していることが確認されました。タンパク質が吸収された状態で放出されると、可溶性BMP2-K2Plkで処理したアルカリホスファターゼ染色で見られるように、より広い距離でより広範な染色が観察されたでしょう。このビデオを見れば、遺伝的拡大によって生物学的に活性なタンパク質を発現および生成する方法や、クリックケミストリー反応によって架空のタンパク質をマイクロスフェアに共有結合する方法について十分に理解できるはずです。遺伝的拡大によってタンパク質の分散を生じさせることで、原則として、一次タンパク質配列の任意の位置に人工アミノ酸を導入することができます。BMP2配列に変異を導入すると、リフォールディング効率に影響を与えることができ、タンパク質パラメータも変化する可能性があります。BMP2-K3Plkの製造には、BMP2タイプの発現のために確立された方法の変更が必要でした。作製したBMP2-K3Plkは、While型タンパク質と同等の生物活性を示しました。BMP2変異体をアジレ架空のアガロースビーズにクリックケミストリーによって共有結合するアプローチは、高効率で実現でき、その結果、架空のビーズが得られ、in vitroでの遺伝的分化が図れます。優れたラボラトリープラクティスに従った標準的な保護を確保する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。...

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ファージディスプレイライブラリーは、ターゲットの骨そのペプチド配列を同定するために使用された。目的は、間葉系細胞の分化に対するこれらのペプチドの効果を調査すると骨再生への影響を決定することでした。...

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我々は、表面上にBMP-2の効率的な固定化を達成するための方法を記載している。我々のアプローチは、その遊離アミン残基を介してBMP-2の共有結合を達成するために、自己組織化単分子膜の形成に基づく。この方法は、細胞膜でのシグナル伝達を研究するための便利なツールです。...

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

生物学的リガンドのマイクロスケールパターンで機能化された細胞培養基質は、組織工学の分野で非常に有用です。ここでは、複数のマイクロパターン化されたポリ(エチレングリコール)ブラシを使用して、生体リガンドの空間的に正確で部位特異的な固定化を可能にする直交化学を示す組織培養基質の汎用性の高い自動製造を実演します。...

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

設計されたマイクロチャネルを持つ骨のようなテンプレートを作成するための段階的な一般的なプロセスが提示されます。テンプレートの高い吸収能力と保持能力は、マイクロチャネルを介した毛細管現象によって実証されます。...

骨様テンプレートでのマイクロチャネルによって独特の毛細管現象は大骨欠損の回復のために細胞の動員を強化することができます

ヘパリンとプロタミンから製造された自己組織化高分子電解質複合体(PEC)をアルギン酸ビーズ上に堆積させ、骨形成成長因子の放出を閉じ込めて調節しました。この送達戦略により、脊椎固定術の用途でBMP-2の投与量を20倍に減らすことができます。この記事では、PECの利点と製造について説明します。...

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA...

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

ここでは、ラボオンチッププラットフォーム内で骨のリモデリングを分析するためのプロトコルを紹介します。3Dプリントされた機械的ローディング装置は、細胞マトリックスを変形させることによって骨細胞のメカノストランスダクションを誘導するプラットフォームと組み合わせることができます。このプラットフォームは、破骨細胞および骨芽細胞(吸収/形成)からの骨リモデリング機能の結果を定量化するためにも使用できます。...

骨造形メカノダクタ化を刺激し、骨改造の機能的成果を解析するためのラボオンチッププラットフォーム

このプロトコルは、ゼラチンベースの顆粒支持体にリン酸カルシウムインクを堆積させることによって骨様構造を作製する3D印刷技術を説明する。印刷された骨類似体は自由形態で寄託され、多相構築物用の生細胞マトリックス内で印刷物を直接採取したり架橋したりするための柔軟性を備えています。...

骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング

学ぶクリックケミストリーによるBMP2変異体のサイト向け固定法。骨欠損治療における副作用を低減し、低用量で骨形成を促進するスカフォールド製造技術を確立する方法です。

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

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