骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

この研究の全体的な目標は、クリックケミストリーによる新しく設計されたBMP2バリアントの部位指向性および共有結合による骨形成足場の堅牢で再現性のある生産です。この方法は、長骨欠損の非治癒の治療に一般的に使用される技術に関連する問題を克服するのに役立ちます。吸収またはカプセル化の方法には、いくつかの重篤な副作用を引き起こす超生理学的量のBMP2が必要です。

この手法の主な利点は、新しく設計されたBMP2バリアントを少量使用し、側面を向いた方法で足場に共有結合させることです。50ミリリットルのLB培地で、50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンと100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを摂氏37度で一晩繁殖させます。一晩の培養物を1〜20に希釈し、50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンとアンピシリン1ミリリットルあたり100マイクログラムを補充した800ミリリットルの素晴らしいブロス培地に希釈します。

600ナノメートルの光学密度が0.7に達するまで、摂氏37度で培養物を成長させます。次に、プロポフォールL-リシンを最終濃度10ミリモルまで添加します。.IPTGを添加することにより、最終濃度が1ミリモルになるように遺伝子発現を誘導します。

37°Cで180RPMのオービタルシェーカーで16時間培養します。インキュベーション後、全培養物を9, 000倍gで30分間遠心分離します。上清を捨て、細菌ペレットを30ミリリットルのTBSE緩衝液に再懸濁します。

空の遠心分離機ビーカーの重量を量り、再懸濁したペレットを空のビーカーに移します。次に、再懸濁したペレットを6,360倍gで20分間遠心分離します。上清を捨て、ビーカーとペレットの重さを量ります。

空のビーカーの重量を差し引いて、ペレットの重量を計算します。次に、ペレットをSTEバッファーに再懸濁します。ペレット10グラムごとに200ミリリットルのSTEバッファーを使用してください。

懸濁液を氷上で超音波処理してから、6,360倍gで20分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットの重さを量ります。超音波処理と遠心分離のステップを4回繰り返した後、ペレットを100ミリリットルのTBS緩衝液に再懸濁します。

6、360倍gで20分間遠心分離します。次に、上清を捨ててペレットの重さを量ります。ペレット1グラムあたり10ミリリットルを使用して、新たに添加したヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ緩衝液にペレットを再懸濁します。

懸濁液を室温で30 RPMの撹拌プレート上で一晩インキュベートします。翌日、サスペンションにTriton Bufferを追加します。追加するTriton Bufferの容量は、懸濁液の0.5容量部分に相当します。

室温で10分間インキュベートした後、懸濁液を6,360回gで20分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットの重さを量ります。次に、ペレット 1 グラムあたり 8 ミリリットルを使用して、ペレットを TE バッファーに再懸濁します。

前回と同様に遠心分離した後、上清を捨て、ペレットの重量を量ります。次に、25ミリモルの酢酸ナトリウムPH5をグラムあたり4ミリリットル、および6モルの塩化グアニジンを1ミリリットルのDTTで1グラムあたり5ミリリットルを追加して、ペレットを再懸濁します。懸濁液を攪拌プレート上で摂氏4度で一晩インキュベートします。

75.500回gで20分間遠心分離した後、上清には折り畳まれたモノマーBMP2タンパク質が含まれます。上清を収集し、濃縮セル内の分子量3キロトンのカットオフメンブレンを使用して、この抽出物を1ミリリットルあたりの光学密度20まで濃縮します。攪拌しながら、濃縮モノマーを1滴でRenaturation Bufferに加えます。

次に、溶液を室温で暗所で120時間インキュベートします。1ミリモルの塩酸に対して溶液を透析する前に、濃塩酸を使用して溶液のpHを3.0に調整します。濃縮細胞内で10キロダルトンの分子量カットオフメンブレンを使用して透析溶液を濃縮します。

次に、タンパク質溶液を平衡化したカラムにロードし、バッファーBの線形グラジエントを使用してフラクションを希釈し、2ミリリットルのフラクションを収集します。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くCoomassie Brilliant Blue染色により、各画分の20マイクロリットルを分析し、モノマーを含む画分と二量体を含む画分を決定します。次に、フラクションを含むプルダイマー。

5リットルの1ミリモル塩酸に対して、摂氏4度で一晩分画を含む二量体のプールを透析します。10キロダルトンの濃縮遠心フィルターユニットを使用して製品を濃縮してから、SDS-PAGEおよびCoomassie Brilliant Blue染色で最終製品を分析します。ネガティブコントロールとして使用されるBMP2-K3PlkまたはBMP2-whileタイプの20マイクロモルと、反応バッファー中の20マイクロリットルのアジド活性化アガロースビーズを総容量500マイクロリットルで組み合わせます。

20 RPMの回転混合物で室温で2時間インキュベートします。最終濃度の5ミリモルEDTAを添加して反応を停止します。溶液を室温で15分間、回転ミキサーで20 RPMでインキュベー

次に、サンプルを室温で1分間20、000倍gで遠心分離し、上清を収集します。次に、ビーズを含むペレットを1, 000マイクロリットルのHBS 500バッファーで洗浄します。室温で1分間、20, 000倍gでサンプルを遠心分離し、上清を収集します。

この洗浄手順をHBS 500バッファーでさらに2回、4モル塩化マグネシウムで3回、PBSで2回繰り返し、毎回上清を収集します。結合ビーズを摂氏4度のPBS1, 000マイクロリットルに保管します。テキストプロトコルに記載されているようにALPアッセイを実施します。

ALP染色を行うには、前芽球性C2C12細胞をDMEMで、10%のウシ胎児血清と100単位/ミリリットルのペニシリンGおよびストレプトマイシンを37°Cで、5%二酸化炭素の加湿雰囲気で培養します。C2C12細胞をウェルあたり30, 000細胞の密度で96ウェルマイクロプレートに供給します。細胞を一晩接着させた後、培地を取り出し、PMB2-K3PLK結合ビーズのウェルあたり20マイクロリットルを追加します。

次に、各ウェルに0.4%低融点アガロースを20マイクロリットル加えます。96ウェルマイクロプレートを2, 000倍gで20°Cで5分間遠心分離します。次に、同じ媒体を80マイクロリットル追加します。

%二酸化炭素の加湿雰囲気下で摂氏37度で72時間インキュベートします。インキュベーション後、固化した0.4%アガロースを剥がさないように注意しながら培地を取り出します。ワンステップMBT-BCIPサブストレート溶液のウェルあたり100マイクロリットルを追加します。

パープル染色が明らかになった直後に、光学顕微鏡を使用してアルカリ性ホスファチデート染色を分析します。明視野顕微鏡を使用して写真を撮ります。新たに作製したBMP2-K3Plk変異体の生理活性は、C2C12細胞におけるアルカリホスファターゼ遺伝子発現の誘導によって検証されます。

in vitro試験では、BMP2型またはBMP2-K3Plk型のいずれかによって誘導される同様のアルカリホスファターゼ遺伝子発現レベルが示されました。カバー触媒アジドアルキンシクロ付加を介してBMP2-K3Plkでコーティングされたビーズは、二標識されたBMP受容体1Aエコドメインとインキュベートすると蛍光を示しました。BMP受容体1AのBMP2-K3Plkへの結合は、カップリング後の生理活性の保持を確認する。

BMP2-K3Plk官能基ビーズの生理活性は、ALP媒介染色によって証明されました。染色は、BMP2-K3Plk官能基ビーズと直接接触した細胞でのみ行われ、タンパク質が単に吸収されるだけでなく、実際にビーズと共有結合していることが確認されました。タンパク質が吸収された状態で放出されると、可溶性BMP2-K2Plkで処理したアルカリホスファターゼ染色で見られるように、より広い距離でより広範な染色が観察されたでしょう。

このビデオを見れば、遺伝的拡大によって生物学的に活性なタンパク質を発現および生成する方法や、クリックケミストリー反応によって架空のタンパク質をマイクロスフェアに共有結合する方法について十分に理解できるはずです。遺伝的拡大によってタンパク質の分散を生じさせることで、原則として、一次タンパク質配列の任意の位置に人工アミノ酸を導入することができます。BMP2配列に変異を導入すると、リフォールディング効率に影響を与えることができ、タンパク質パラメータも変化する可能性があります。

BMP2-K3Plkの製造には、BMP2タイプの発現のために確立された方法の変更が必要でした。作製したBMP2-K3Plkは、While型タンパク質と同等の生物活性を示しました。BMP2変異体をアジレ架空のアガロースビーズにクリックケミストリーによって共有結合するアプローチは、高効率で実現でき、その結果、架空のビーズが得られ、in vitroでの遺伝的分化が図

優れたラボラトリープラクティスに従った標準的な保護を確保する必要があります。