体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ
2018年1月29日
ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。
この実験の全体的な目標は、SUMOO化できる、またはSUMO E3ライガスである目的のタンパク質を検証することです。この方法は、SUMO E3ライガスの同定など、SUMOO化分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、さまざまなSUMOアイソフォームに対するSUMO E3リガス特異性の研究に利用できることです。
その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるWan-Shan Youngです。タグK-bZIPを精製するには、まず10ミリリットルの細胞溶解物と50マイクロリットルの抗体タグ付き磁気ビーズを14ミリリットルのポリプロピレンチューブでインキュベートします。次に、サスペンションミキサーでチューブを摂氏4度で毎分50回転で3時間回転させます。
タンパク質が捕捉されたら、サンプルを800倍gで摂氏4度で30秒間遠心分離し、ビーズをペレット化します。1ミリリットルの上清を除くすべての上清を廃棄して、ビーズを再懸濁します。そして、溶解したビーズを1.5ミリリットルのチューブに移します。
捕捉したタンパク質を洗浄するには、ビーズの入ったチューブを磁気スタンドに置きます。ビーズがチューブの側壁に付着するまで約3秒待ってから、上清を取り除きます。ビーズを洗浄するには、1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの溶解緩衝液を追加します。
次に、チューブを10回反転させます。次に、1.5ミリリットルのチューブをマグネットスタンドに置き、ビーズが壁に付着したら上澄み液を取り除きます。ビーズを再度洗浄するには、1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を加え、10回反転させます。
次に、チューブを磁気スタンドに移し、ビーズが側壁に付着したら上清を取り除きます。抗体タグ付き磁気ビーズからK-bZIPタグ付きタンパク質を溶出するには、1.5ミリリットルのチューブ内のリン酸緩衝生理食塩水で希釈したオクタペプチド150マイクログラム/ミリリットルで100マイクロリットルを加えます。次に、サスペンションミキサーでチューブを毎分50回転で室温で10分間回転させます。
チューブを磁気スタンドに移します。次に、上清を含むK-bZIPを収集します。次に、精製したK-bZIPタグを解析するために、精製したタンパク質の1〜5マイクロリットルをSDSページに供し、続いてクマシーブルー染色を行います。
0.5、1、2 μgのウシ血清アルブミンを標準物質としてゲルにロードし、K-bZIP濃度を定量します。Image J.Nextで画像を処理しながら、精製したK-bZIPをリン酸緩衝生理食塩水で希釈します。マイクロリットルあたり100ナノグラムの最終濃度を達成するため。
そして、マイナス80°Cで小さなアリコートで保管してください。精製されたタグ付きK-bZIPのマイクロリットルあたり100ナノグラムの3マイクロリットルをin vitro SUMOylationマスターミックス反応で添加します。次に、マスターミックスの内容物を穏やかに混合し、摂氏30度で3時間インキュベートします。
次に、ローディングバッファー付きの20マイクロリットルの2X SDSページを追加して反応を停止します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱して、タンパク質を変性させます。次に、20マイクロリットルのサンプルを10%SDSページゲルにロードします。
そして、染料がゲルの底に達するまで、ゲルを80ボルトで約120分間泳がせます。エレクトロ麻痺が終わったら、ゲル装置を切断します。.そして、ゲルをセミドライ転写バッファーに5分間移します。
次に、PVDFメンブレンをメタノールで満たされた別の容器に1分間浸します。メタノールからPVDFメンブレンを取り出し、セミドライトランスファーバッファーに浸します。次に、メンブレンを5分間静かに攪拌します。
セミドライ電気泳動装置の安全カバーを取り外します。濾紙をあらかじめ濡らします。そして、プラチナアノードの底にゲルサンドイッチを準備します。
カソードプレートを安全カバーに固定した後、ブロットを15ボルトの定電流で90分間運転します。次に、セミドライ装置を切断した後、電源をオフにし、PVDFメンブレンを取り出します。次に、PVDFメンブレンをブロッキングバッファーでブロッキングバッファーで1時間、オービタルシェーカーで毎分30回転でブロックします。
次に、PVDFメンブレンを抗p53抗体およびブロッキングバッファーとハイブリダイズし、サスペンションミキサー上で摂氏4度、毎分30回転で12〜16時間ハイブリダイズします。次に、PVDFメンブレンを取り出し、トリス緩衝生理食塩水tween20で満たされた容器に移します。次に、PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水Tween 20にオービタルシェーカーで30分間、毎分45回転で浸します。
次に、PVDFメンブレンを、ブロッキングバッファーで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗ウサギ抗体とハイブリダイズし、室温で1分間30回転で懸濁液ミキサー上で1時間ハイブリダイズします。次に、PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水Tweenで20回3回洗浄します。洗浄後、PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水Tween 20に懸濁液ミキサーで毎分45回転で30分間浸します。
次に、トリス緩衝生理食塩水tween20をリン酸緩衝生理食塩水に交換します。PVDF膜を摂氏4度で最大12時間保存します。次に、増強化学発光基質試薬1と2を1対1の比率で混合します。
次に、リン酸緩衝生理食塩水からPVDF膜を剥がし、パンチポケットで短時間吸い取り、余分な水分を吸収します。すぐに400マイクロリットルの化学発光試薬を膜表面に加え、3〜5分待ちます。短時間ブロットして余分な化学発光試薬を排出し、メンブレンが完全に乾燥するのを防ぎます。
ルミネセントのイメージングシステムを使用して、ブロットを露光します。ここでは、免疫ブロット分析を行い、p53ターゲットをSUMOylateするために必要なUbc9酵素の濃度を示しました。このことは、Ubc9酵素の1/2および1/5の濃度で、SUMO 1およびSUMO 2ペプチドを用いたin vitro SUMO化アッセイにおいて、p53酵素を十分にSUMOylateできることを示しています。
SUMO化p53を分析するために、メンブレンを抗p53抗体でプローブしました。同様の免疫ブロット分析を行い、SUMO 1、SUMO 2、および SUMO 3 ペプチドを用いた in vitro SUMOylation アッセイで p53 標的を SUMOylate 化するためには、E1 濃度の半分と 1/10 濃度の Ubc9 酵素が必要であることを示しました。ここでは、メンブレンをCoomassieで染色して、精製されたK-bZIPタンパク質を示しました。
バキュロウイルス発現系を用いて、精製したK-bZIPをSDSページで解析し、ウシ血清アルブミンを標準試料として比較した。追加の免疫ブロット分析も行われ、K-bZIPの濃度を上げると、E1の半分の量とUbc9酵素の1/10の量の存在下でp53のSUMO化が触媒されることが示されました。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば4時間で完了します。
この手順を試みる際には、in vitro SUMOylation assay のすべての試薬を氷上に保管し、1 回の大きな希釈ではなく、一連の希釈を行うことを覚えておくことが重要です。この手順を見つける 過剰発現SUMOlygaseのような他の方法は、in vitroでSUMO化を確認するために実行できます。その開発後、この技術は、SUMO化の分野の研究者がより多くのSUMOlygaseを探求し、特異性の力を検証するための道を開きました。
このビデオを見れば、in vitroシミュレーションアッセイを使用してSUMO e3ライガスを同定する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
本研究では、新規のSUMO E3リガーゼを同定するために設計された、改変in vitro SUMO化プロトコルを提示します。この手法により、異なるSUMOアイソフォームに対するSUMO E3リガーゼの特異性を調査することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- タンパク質修飾
背景
- SUMO化は、翻訳後修飾プロセスの一つである。
- ユビキチンリガーゼと比較して、同定されているE3 SUMOリガーゼは少ない。
- SUMO E3リガーゼを同定することは、それらの生物学的役割を理解する上で極めて重要である。
- 本研究は、これらのリガーゼの同定手法を向上させることを目的としている。
研究の目的
- SUMO化されるタンパク質、またはSUMO E3リガーゼとして機能するタンパク質を検証する。
- SUMO化研究における重要な課題を解決する。
- SUMO E3リガーゼを同定するための手法を開発する。
使用した手法
- SUMO化のin vitro再構成アッセイ。
- 抗体標識磁気ビーズを用いたタグ付きK-bZIPの精製。
- 細胞溶解物と磁気ビーズのインキュベーション。
- 低温でのサスペンションミキサーによるチューブの回転。
主な結果
- 新規SUMO E3リガーゼの同定に成功したこと。
- 実験室環境における本プロトコルの有効性の実証。
- SUMOアイソフォームに対するSUMO E3リガーゼの特異性に関する知見。
- 今後のSUMO化研究における応用の可能性。
結論
- 改良されたプロトコルは、SUMO E3リガーゼの同定において有用なツールとなります。
- これにより、SUMO化メカニズムに関する今後の研究への道が開かれます。
- さらなる研究により、SUMO E3リガーゼの特異性について詳細を明らかにすることが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
SUMO E3リガーゼおよびそのアイソフォーム特異性を特定することは、初期創薬におけるターゲットバリデーションのリスクを低減させるために極めて重要です。このin vitro再構成アッセイは、SUMO依存性シグナル伝達経路のメカニズム解析を可能にし、治療仮説の検証における予測的な信頼性を裏付けます。本手法は、E3リガーゼ活性を評価するためのスケーラブルで標準化されたアプローチを提供し、リード化合物の同定およびポートフォリオの優先順位付けに関する意思決定に直接的に寄与します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： SUMO E3リガーゼの機能と基質特異性の解析を可能にし、疾患に関連するシグナル伝達メカニズムを解明する。
- 実用的価値： 精製した成分を用いて推定されるE3リガーゼを検証するための再構成系を提供し、細胞内の複雑性に起因する偽陽性を低減させる。
- 予測的価値： 定義された条件下でp53などの既知の基質に対する直接的な酵素活性を実証することにより、ターゲットのデリスキングを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： SUMOパラログ（SUMO1/2/3）におけるSUMO抱合の定量的リードアウトを生成し、リガーゼアイソフォームの選択性をプロファイルします。
- 運用の価値： 標準化された反応条件とコントロール（E1、Ubc9のタイトレーション）を使用することで、異なる研究室間やスクリーニングキャンペーンにおける再現性を確保します。
- 拡張性の価値： 96ウェル形式に対応しており、リガーゼライブラリーや変異体の中スループット評価が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：病理学的基質の修飾を検証することで、SUMO E3リガーゼ活性を疾患モデルにおける機能的な結果へと結びつけます。
- 運用の価値：活性の読み取りに組み合わせた構造誘導変異導入により、リガーゼドメインの構造・機能解析を可能にします。
- トランスレーショナル価値：前臨床システムにおいて標的のSUMO化状態を確認することで、バイオマーカーの開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、ターゲットの検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、細胞ベースまたは表現型スクリーニングに先立ち、メカニズムに対する直交的な生化学的確認を提供します。
- ディスカバリーバイオロジー： 腫瘍形成または神経変性の標的におけるSUMO化の直接的な調節を確認することで、治療仮説を検証します。
- スクリーニング： E3リガーゼ調節剤スクリーニングにおけるヒット確認に適した、定量的かつ酵素依存的なリードアウトを提供します。
- 分析： 免疫ブロットによるSUMO複合体形成を測定し、リガーゼの効力およびアイソフォーム選択性の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 臨床的に重要な基質のSUMO化を実証することで、疾患に関連するコンテキストにおける標的エンゲージメントを検証します。
- 企業内での再利用： 複数のプロジェクトや標的クラスにわたり、SUMO E3リガーゼを特性解析するための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： SUMO経路調節におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、標的選択の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値： E3リガーゼ活性評価を標準化し、ラボ間の再現性とデータの比較可能性を向上させます。
- 戦略的価値： リガーゼと基質の適合性の直接的な証拠を提供することで、Go/No-go判断の根拠とし、後期の脱落率を低減させます。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みのメカニズムデータに基づき、SUMO標的プログラムのリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- タンパク質精製、酵素反応速度論、および免疫ブロット検出に関する専門知識が必要です。
- 精製されたSUMOアイソフォーム、E1/E2酵素、および基質タンパク質へのアクセスに依存します。
- 一貫した活性測定を行うために、標準化された反応バッファーと温度制御が必要です。
- 非特異的なシグナルを避けるため、酵素および基質の濃度の最適化が含まれます。
- in vitro活性に限定されており、細胞内環境および調節メカニズムについては補完的な検証が必要です。
