Name: 体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ体外SUMO化アッセイを用いて、新規SUMO E3リガーゼを同定し、異なるSUMOアイソフォームへの特異性を調査する方法。この技術は生化学研究においてタンパク質修飾メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、省の科学と技術 (PCC にほとんど、105-2320-B-010-007-MY3)、国立衛生研究所 (NHRI - PCC に EX105-10215BC)、科学技術 (最も 105-2314-B-400-019 省からの助成金によって支えられました。HJK) して国立衛生研究所 (NHRI MG-105-SP-10、HJK に NHRI の MG-106 SP-10) から。この作品も、PCC に原稿出版物の国立陽明大学と部分的サポートされていました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の賠償の役割はなかった。

1. バキュロ ウイルス発現コンストラクトの調製
<ol><li>
相撲 E3 リガーゼ K bZIP 浄化デュアル式バキュロウイルスベクターへ K bZIP19の cDNA のクローニング (材料表参照) N 末端エピトープ タグ付き。(ベクトル-タグ-K-bZIP としてプロトコルを通して示される) オクタペプチド タグを使用して成功を収めています。 注: K bZIP ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のクローニングのための DNA のテンプレートは cDNA の逆ドキシサイクリン治療20TREx F3H3 K-Rta BCBL 1 細胞由来 RNA から転写です。<ol>
<li>サイトのクローンを作成私Cpoとデュアル発現ベクターにフルレングスの K bZIP cDNA19を転送します。Cpo私は PCR の製品や 3 h2137 ° C でデュアル発現ベクターの 1 μ g を消化します。</li>
		<li>分離・220.8% の agarose のゲルの電気泳動、次消化の DNA を抽出します。挿入 (K bZIP) を縛るし、製造元の指示に従って 30 分の 16 ° C T4 DNA リガーゼによるベクトル (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>5 μ L を追加 50 μ L に結紮 DNA の有能なエシェリヒア属大腸菌細胞」(参照材料表) 1.5 mL チューブ。30 分間氷の上に置きます。45 42 ° C の水浴に 1.5 mL チューブをインキュベーションして、s およびすぐにチューブを入れて 3 分間氷の上。</li>
		<li>チューブに 600 μ L まで媒体 (0.5% (w/v) 酵母エキス、2% (w/v) トリプトン、10 mM の NaCl、2.5 mM KCl、20 mM MgSO4、および 4% (w/v) グルコース) を追加し、37 ° C 1 時間インキュベートします。その後、600 x g で 3 分間室温でチューブを遠心分離機します。</li>
		<li>上清を除去、60 μ ルリア ベルターニカミラ培地でペレットを再懸濁します (LB; 1% (w/v) トリプトン 0.5% (w/v) 酵母エキス、85 mM の NaCl) と 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレート上に広がる。16 h23,2437 ° C で寒天版を孵化させなさい。</li>
		<li>1 植民地揺れ 250 rpm で 100 μ g/mL アンピシリンと 16 h の 37 ° C で培養を含む 5 mL の LB 培地に接種するを選択します。その後、製造元の指示に従ってプラスミド抽出キットによってベクトル タグ K bZIP プラスミドを抽出 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ベクトル タグ K bZIP の有能なエシェリヒア属大腸菌への変換によってタグ K bZIP をかくまっている組換えバクミドを生成する細胞"B"(材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>0.2 μ g ベクター-タグ-K-bZIP プラスミドと 100 μ L を混在させる有能なe.大腸菌細胞"B"1.5 mL チューブと置かれた氷 30 分インキュベート 45 42 ° C の水浴中管 s およびすぐにチューブを入れて 3 分間氷の上。</li>
		<li>チューブにまで中の 900 μ l 添加し 50 rpm で回転と 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。次に、媒体の 10 μ L を取る、50 μ G/ml カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ G/ml テトラサイクリン、100 μ g/mL ガラクトシダーゼの基質、40 μ g/mL イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG を含有 LB 寒天培地プレート上を広めるための S.O.C メディアの追加の 50 μ L を追加)、37 ° C で 48 h 用の版を孵化させなさいと</li>
		<li>50 μ G/ml カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 μ G/ml テトラサイクリンを含む 5 mL の LB 培地の白いコロニーを接種します。250 rpm の 16 h の揺れは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>タグ K bZIP をかくまっている DNA の組換えのバクミドを分離、定量化、および再濃度 1 μ g/μ L25で中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組換えバクミド 6 ウェル プレートのウェル 1 個で Sf9 細胞にタグ K bZIP を含んでいる DNA の 1 μ g を株でタグ K bZIP を表現する組換えバキュロを生成します。
	<ol>
<li>10% 牛胎児血清 (FBS) とそれぞれ 1% ゲンタマイシン 2 mL グレースの昆虫中種子 2 x 106 Sf9 細胞 (材料の表を参照してください) 6 ウェル プレートのよくし、27 ° C 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>Sf9 細胞 10 %fbs、ゲンタマイシン 1%、1% 洗剤 C 付属グレースの昆虫中のログ相培養を維持 (材料の表を参照) で 140 rpm で軌道懸濁液 27 ° C。検定とトリパン ブルー染色; を使用してセルをカウントします。細胞生存率は、95% を超える必要があります。継代培養の比が 1:3 すべての 2-3 日 (最小密度 ~0.5 x 106セル/mL) を使用してセルを維持します。</li>
		<li>2 μ L バクミド DNA を追加 (1 μ g/μ L) と 98 μ L は、2 mL チューブに血清メディア (材料の表を参照) を削減します。4 μ L のトランスフェクション試薬を加えます (材料表参照) チューブとよく混ぜる。15 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>各ウェルにこのトランスフェクション混合物 (104 μ L) を追加し、27 ° C 12-16 時間インキュベートします。</li>
		<li>穏やかな吸引と排出されるメディアを削除し、10 %fbs と 1% ゲンタマイシンに付属している新鮮な恵みの昆虫培地 2 mL に置き換えます。Sf9 細胞プレート表面に緩く付着し、穏やかな吸引を邪魔されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トランスフェクション後組換えバキュロ ウイルスを収集し、さらに実験のための高力価の在庫 (P1) を取得するバキュロ ウイルスを増幅します。
	<ol>
<li>無菌細胞リフターを使用してこすり、Sf9 細胞媒体を変更した後 72 時間は、1.5 mL チューブと 10 の渦でそれぞれ個々 の井戸から上清を収集 s。</li>
		<li>150 x g に 3 分の 4 ° C で遠心分離機の P0 バキュロ ウイルスと 1.5 mL チューブ (各管に 1 mL バキュロ ウイルス) の因数として上澄み。-80 ° C でストア</li>
		<li>10 mL グレースの昆虫中種子 1 x 107 Sf9 細胞 10 %fbs と 1% ゲンタマイシン 10 cm シャーレで付属し、27 ° C 1 時間で孵化させなさい。</li>
		<li>組換えバキュロ発現タグ-K bzip 型の増幅、シード Sf9 細胞に 0.5 mL P0 バキュロ ウイルスを追加し、, 48 h の 27 ° C で。</li>
		<li>1 ヶ月 15 mL チューブと 4 ° C でストアで P1 バキュロ ウイルス上清を収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. K bZIP の浄化
<ol><li>1.3.2 の手順の説明に従って 10 %fbs、ゲンタマイシン 1%、1% 洗剤 C 140 rpm で軌道懸濁液中の 27 ° c に付属しているグレースの昆虫中 Sf9 細胞のログ相培養を維持します。</li>
	<li>伝達の日、2 x 106セル/ml の密度と Sf9 細胞の 250 mL にバキュロ ウイルスを含む上清 (P1) の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>揺れ、140 rpm と軌道シェーカーで 27 ° C、72 時間 Sf9 細胞を孵化し、4 ° C で 15 分間 2,740 × g で遠心分離によって収集</li>
	<li>上清を除去し、10 mL の溶解バッファー (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M の NaCl、1% 洗剤 (材料の表を参照)、2% グリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル) 細胞ペレットを溶解、4 ° C で 30 分間懸濁液ミキサーを使用して 50 rpm で回転。</li>
	<li>遠心分離機にて細胞培養上清を収集するために 15 分間 15,000 × g。</li>
	<li>タグ K bZIP を浄化するために 14 mL ポリプロピレン チューブに抗体タグ磁気ビーズの 50 μ L と細胞溶解液 (10 mL) を孵化し、懸濁液ミキサーを使用しての 4 ° C で 3 時間 50 rpm で回転します。30 g 遠心 x 800 でビーズをペレット蛋白質のキャプチャ、次 4 ° C で s上澄みのほとんどを取り外し、再度約 1 mL、残気量のビーズを中断、洗濯用 1.5 mL チューブに。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズを含むチューブを配置することによってキャプチャされたタンパク質を洗浄し、磁気ビーズが完全に管の側に付着した後、上澄みを除去します。</li>
	<li>
換散バッファーのビード 4 回洗浄しなさい。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに 1 mL の溶解バッファーを追加し、10 回チューブを反転します。マグネット スタンドに 1.5 mL チューブを置き、2.7 で説明されているように、上清を除去します。</li>
		<li>別の 3 回前の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でビーズを一度洗ってください。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに 1 mL の PBS (137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 8 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4) を追加し、10 回チューブを反転します。</li>
		<li>マグネット スタンドに 1.5 mL チューブを入れ、上澄みを取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL チューブに PBS で希釈した 150 μ g/mL オクタペプチドの 100 μ L を追加することによって磁気ビーズの抗体タグからタグ K bZIP 蛋白質を溶出します。室温で懸濁液ミキサーで 50 rpm で 10 分間のチューブを回転させます。マグネット スタンドにチューブを配置し、きれいな 1.5 mL チューブに K bZIP 含む上清を収集します。</li>
	<li>SDS-PAGE ブルー26を染色の順で 1-5 μ L の精製タグ K bZIP 蛋白質を分析します。負荷 2 μ、1 μ g と同じウシ血清アルブミン (BSA) の 0.5 μ g のサンプルはゲルし ImageJ のような画像処理プログラムと定量化のためにそれを使用します。BSA の標準に比較して K bZIP 濃度を推定します。</li>
	<li>精製 K bZIP は、各 sumo 化アッセイに使用する準備が整いました。PBS で K bZIP を 100 ng/μ L と小さい因数-80 ° C でストアの最終濃度に希釈します。</li>
</ol>3. sumo 化アッセイ
<ol><li>各体外sumo 化反応のマスターの組合せに精製タグ K bzip 型の 100 ng/μ L の 3 μ L を追加します。マスター ミックスのコンポーネントを含む 1 μ L 蛋白質バッファー、sumo 化バッファー、0.5 μ L p53 蛋白 (0.5 mg/mL)、25 x 1 活性化酵素 E1 の nM (ストック濃度: 1 μ M), 50 nM E2 の酵素の活用 (ストック濃度: 10 μ M)、および 250 相撲ペプチド (相撲 1 の各 nM、相撲-2、または相撲-3;ストック濃度: 5 μ M) 17 μ L の最終巻に。</li>
	<li>軽く内容をミックスし、3 h は SDS ページの読み込みバッファー x 2 の 20 μ L の追加によって反作用を停止するため、30 ° C で反応を孵化させなさい (100 mM トリス塩酸 pH 6.8, ドデシル硫酸ナトリウム 4%、0.2% (w/v) ブロモフェノールの青、20% (v/v) グリセロール、200 mM β-メルカプトエタノール) と95 ° C、5 分でサンプルを変化させなさい。</li>
	<li>
SDS-PAGE のサンプルを分離、半乾燥電気泳動転送装置を使用して PVDF 膜に分けられた蛋白質を転送および抗 p53 抗体を用いたウエスタンブロット分析します。
	<ol>
<li>2.11、ステップのようにゲル装置を設定し、ゲルの井戸に 20 μ L のサンプルを読み込みます。</li>
		<li>(色素のバンドに達するゲルの底) まで約 120 分 80 V で電流定数 10% ゲルを実行します。電気泳動の終了後、電源をオフにします。</li>
		<li>ゲル装置、ゲル、ゲルを取るカセットを外し 5 分半乾燥の転送バッファー (48 mM トリス-HCl、39 mM グリシン、20% メタノール) にゲルをフロートします。</li>
		<li>別のコンテナーを取り出して 1 分のメタノールに PVDF 膜を浸漬します。メタノールの PVDF を取るし、半乾燥の転送バッファーに配置します。5 分間膜を振ちましょう。</li>
		<li>半乾燥電気泳動装置の安全カバーを取り外します。</li>
		<li>事前フィルター ペーパーをウェットし、準備下白金アノードにゲル サンドイッチを次のように: ろ紙、PVDF 膜、ゲル、及びフィルター ペーパー。</li>
		<li>、電源を 15 V 定数 90 分ターン現在でしみを実行して、安全な陰極板と安全カバーは、セミドライ装置を外し、PVDF 膜を取る。</li>
		<li>バッファーを妨げるブロック PVDF 膜 (TBST バッファーで 5%、無脂肪ミルク (137 mM NaCl2、20 mM トリス-HCl、0.1% 洗剤 B (材料の表を参照)、pH 7.6)) 軌道シェーカーで振って 30 rpm で 1 時間室温で。</li>
		<li>30 rpm 振動懸濁液ミキサーを使用して抗 p53 抗体希釈 (1:1, 000) 4 ° C で 12-16 h のブロック バッファーで PVDF 膜を交配させます。</li>
		<li>コンテナーに PVDF 膜を取り出し、TBST で置きます。Tbst 倍 PVDF 膜を洗い流してください。</li>
		<li>軌道シェーカーで振って 45 rpm で 30 分間 TBST で PVDF 膜を浸します。</li>
		<li>30 rpm サスペンション ミキサーを使用して振動を室温で 1 時間ブロッキング バッファーで抗家兎抗体希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) と共役 (1:4, 000) PVDF 膜を交配させます。</li>
		<li>TBST 3 回手順 3.4.10 PVDF 膜を洗浄します。</li>
		<li>45 rpm は、懸濁液ミキサーを使用して振動 TBST で 30 分間の PVDF 膜を浸します。TBST を削除し、12 h まで 4 ° C で PVDF 膜を維持するために PBS を追加します。</li>
		<li>1 と 2 (1:1) (材料の表を参照してください) の化学発光基質 (ECL 基板) 試薬を混ぜます。PBS から PVDF 膜を削除、紙タオルや余分な水分を吸収し、簡単にしみが付くことで 3 ~ 5 分削除過剰な ECL 試薬の各膜の表面に ECL 試薬の 400 μ L を直ちに追加する軽型ワイパーで簡単にしみが、m を許可しません。embrane に完全に乾燥。</li>
		<li>オートラジオグラフィー フィルム27発光イメージング システムを使用してしみを公開します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li>
<li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification%2C+subnuclear+localization%2C+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li>
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<li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2%2F3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1%2FCoREST1%2FHDAC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li>
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著者は潜在的な利益相反を開示ないです。

プロトコルは生体外でsumo 化ここで説明は日常的に識別された Ubc9 基板の sumo 化地位を確立する使用します。相撲 E3 リガーゼの sumo 化関数を勉強する標準プロトコルを使用して主要な制限は、相撲 E1 が活性化し、E2 抱合酵素 Ubc9の in vitroにおける相撲の活用を最大化する豊富です。このような課題を考慮して考えてレベルに相撲 E1 と E2 酵素の量を滴定 1 つはかろうじて sumo 化で彼らの活動は、のみ方法利用できますこの体外を使用して相撲 E3 リガーゼ活性を決定する検出できることSumo 化システム。この仮説に従って我々 は正常に K bZIP の E3 リガーゼ活性を解明し、相撲-2/3 に向けての特異性と新規相撲 E3 リガーゼとしてそれを識別しました。
プロトコルの中で重要なステップの E1 と E2 の低量の混入であります。に示すよう図 2、小説相撲 E3 リガーゼ低リガーゼ活性を持つこれらのより低い金額を使用して基板と...

SUMO 化当初、タンパク質安定性1を調整する可逆的な翻訳後修飾 (PTM) として同定されました。直接活用に加えて、相撲はできます相撲相互作用モチーフ (SIMs)2非共有結合性相互作用によってタンパク質に添付も。Src ホモロジー 2 (SH2) をかくまっている分子によってチロシン リン酸化のバインディングまたはホスホチロシン結合のよう (PTB) ドメイン3,4SUMO 化のための追加の対話プラットフォームを提供します選択SIM を含むエフェクター蛋白質5,6の募集。シグナル伝達の規制に加えて転写因子とクロマチン再構築分子の sumo 化は遺伝子発現7、8を調節するのに役立ちます。ゲノム sumo 化パターンの研究は、正9,10または負の10、11,12転写に関連付けられていることを明らかにしました。規制で一部の sumo 化のパラログの特異性のため。
タンパク質は、哺乳類細胞で現在の活用の 3 つの主要な相撲アイソ フォームがあります。相撲-1 と高い相同性相撲 2 相撲 3 (相撲-2/3 と呼ばれる)13が含まれます。相撲は通常ターゲット蛋白質の ψKxD/E コンセンサス モチーフ内リジン (K) 残基に共役系します。相撲 E3 リガーゼの SIM はパラログ特異性14担当です。ユビキチン経路 E3 リガーゼの数百人を含むと対照をなして、いくつか相撲 E3 リガーゼ特定15するされているだけ。相撲 E3 リガーゼは、(i) Ubc9 のバインド、(ii) SIM ドメインを介して相撲部をバインドして (iii) 基板上に Ubc9 から相撲伝達を強化する能力を含むプロパティによって定義されます。E3 リガーゼは相撲活用16、絶対に必要ではないが、基板と相撲パラログの特異性を提供します。通常以来総基質タンパク質のごく一部は相撲変更だけ SUMOylated 蛋白質の生体内での検出は常に挑戦です。したがって、正確かつ再現可能なアッセイは、SUMO 化の正確な機能を解明するために必要です。
体外基質タンパク質の sumo 化を触媒する精製 Ubc9 の能力を評価、sumo 化の試金は相撲変更17を勉強するための広く受け入れられた試金。ただし、ほとんどの場合相撲 E3 リガーゼ活性を検出できないまたはできますのみによって検出される変異相撲リガーゼと高相撲 E3 リガーゼ活性と低基質特異性標準プロトコル Ubc918の豊富な量が存在するので.この試金の全体的な成功は主として精製 Ubc9 の慎重な滴定によって異なります。ここで説明した生体外でsumo 化アッセイが標準の sumo 化から変更されたプロトコル (材料の表を参照してください)。カポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) の再アクティブ化の間に高められたグローバル SUMO 化の観察を求め私たちは sumo 化規制上の責任がありますウイルス相撲 E3 リガーゼを識別します。次のウイルスの相撲 E3 リガーゼ K bZIP の相互作用の蛋白質の小規模上映、p53 は新規基質として同定されました。このプロトコルでは昆虫細胞発現と野生型 K bZIP、相撲-2/3 の特異性を持つウイルス相撲 E3 リガーゼの精製の手順で詳細に紹介します。P53、よく知られている相撲の基質の sumo 化を高める精製 K bzip 型の機能は、E1 と E2 酵素の減らされた量の存在下で評価されます。この変更された sumo 化の試金を使用して、研究者確実に定義できます相撲 E3 リガーゼの能力 SUMOylate 小説または知られている基板に sumo 化における主要なステップであります。また、このメソッド低リガーゼ活性が高い基質特異性を持つ新規相撲 E3 リガーゼを識別に役立ちます。

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>二重発現バキュロウイルスベクター</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO ベクター</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR 産物ベクター</td></tr><tr><td>コンピテントセル&nbsp; 大腸菌 DH5&alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>コンピテント E. coli細胞 A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>コンピテントE. coli細胞 B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>reduced serum media</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEW EnglandBioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>ガラクトシダーゼ基質</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace's 昆虫培地</td><td>ギブコ</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>無脂乳</td><td>フォンテラ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセリン</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>洗剤 A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>洗剤 B</td></tr><tr><td>ポロキサマー 188溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>洗剤 C</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>04-693-132-001</td><td></td></tr><tr><td>3x フラッグペプチド</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 磁気ビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>抗体タグ付き磁気ビーズ</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 キット</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>標準 SUMOylation protocol&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 キット</td><td>アクティブ モチーフ</td><td>40220</td><td>標準 SUMOylation プロトコル&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN プラスミド ミニキット</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>プラスミド抽出キット</td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>コーニング</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>ローディングチップ</td><td>ソレンソンバイオサイエンス</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティングフィルターペーパー</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini スラブゲル装置 (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロット SD セミドライ電気泳動転写セル</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940 Pierce</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL試薬</td></tr><tr><td>懸濁液ミキサー</td><td>Digisystem laboratory instruments&nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>カンシンインスツルメンツ株式会社</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 生体分子イメージャー</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anti-p53 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

体外相撲 e3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

小さなユビキチン様修飾 (相撲) の変更は、重要な翻訳後修飾 (PTM) 主に蛋白質蛋白質の相互作用を変調を介するシグナル伝達を仲介します。ユビキチンの変更と同様に、sumo 化は E1 活性化酵素 (SAE1/SAE2)、E2 抱合 (Ubc9) E3 リガーゼ (すなわちPIA の家族、RanBP2、Pc2) など順次酵素カスケードによって監督されます。しかし、ユビキチン化とは異なる、E3 リガーゼは非本質的なため反応が相撲の活用の精度と有効性を提供します。タンパク質の sumo 化によって変更は、基質特異的抗体と相撲特異抗体と免疫ブロット免疫沈降法による生体内での試金によって識別できます。ただし、タンパク質 SUMO E3 リガーゼ活性のデモ sumo 化アッセイ精製酵素、基質、および相撲蛋白質を使用しての体外の再構成が必要です。In vitro反応で通常 SAE1/SAE2 と Ubc9 だけなので相撲の活用のために十分、sumo 化と推定される E3 リガーゼによる強化が検出する容易で常にはないです。ここで、変更された生体外の in vitro再構成システムを用いた SUMO 化を一貫して識別する sumo 化プロトコルについて述べる.触媒活性 K bZIP、ウイルス相撲-2/3 E3 リガーゼを浄化するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。精製 K bZIP の sumo 化活動は、p53、相撲の既知のターゲットに表示されます。このプロトコルないしか採用できない小説相撲 E3 リガーゼの解明その相撲パラログ遺伝子の特異性を明らかにするためにも。

製造元によって提供される情報によると sumo 化アッセイで E1 と E2 酵素の標準量は 50 nM と 500 nM、それぞれ。E2 の最小量は酵素 Ubc9 p53 SUMOylate することができるの活用はだった最初の in vitro sumo 化アッセイによって決まります。低 Ubc9 標準、体外sumo 化の試金のプロトコルで使用される量の 5 分の 1 SUMOylate p53 効率的にすることができた (図 1A)。したがって、Ubc9 標準プロトコルで使用される量の 10 分の 1 との組み合わせで E1 酵素の量の半分は別の in vitro sumo 化アッセイに使用されました。Sumo 化効率の大幅な削減は、標準的なプロトコル (図 1B) と比較して観察されました。
<p class="jov...

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

この実験の全体的な目標は、SUMOO化できる、またはSUMO E3ライガスである目的のタンパク質を検証することです。この方法は、SUMO E3ライガスの同定など、SUMOO化分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、さまざまなSUMOアイソフォームに対するSUMO E3リガス特異性の研究に利用できることです。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるWan-Shan Youngです。タグK-bZIPを精製するには、まず10ミリリットルの細胞溶解物と50マイクロリットルの抗体タグ付き磁気ビーズを14ミリリットルのポリプロピレンチューブでインキュベートします。次に、サスペンションミキサーでチューブを摂氏4度で毎分50回転で3時間回転させます。タンパク質が捕捉されたら、サンプルを800倍gで摂氏4度で30秒間遠心分離し、ビーズをペレット化します。1ミリリットルの上清を除くすべての上清を廃棄して、ビーズを再懸濁します。そして、溶解したビーズを1.5ミリリットルのチューブに移します。捕捉したタンパク質を洗浄するには、ビーズの入ったチューブを磁気スタンドに置きます。ビーズがチューブの側壁に付着するまで約3秒待ってから、上清を取り除きます。ビーズを洗浄するには、1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの溶解緩衝液を追加します。次に、チューブを10回反転させます。次に、1.5ミリリットルのチューブをマグネットスタンドに置き、ビーズが壁に付着したら上澄み液を取り除きます。ビーズを再度洗浄するには、1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を加え、10回反転させます。次に、チューブを磁気スタンドに移し、ビーズが側壁に付着したら上清を取り除きます。抗体タグ付き磁気ビーズからK-bZIPタグ付きタンパク質を溶出するには、1.5ミリリットルのチューブ内のリン酸緩衝生理食塩水で希釈したオクタペプチド150マイクログラム/ミリリットルで100マイクロリットルを加えます。次に、サスペンションミキサーでチューブを毎分50回転で室温で10分間回転させます。チューブを磁気スタンドに移します。次に、上清を含むK-bZIPを収集します。次に、精製したK-bZIPタグを解析するために、精製したタンパク質の1〜5マイクロリットルをSDSページに供し、続いてクマシーブルー染色を行います。0.5、1、2 μgのウシ血清アルブミンを標準物質としてゲルにロードし、K-bZIP濃度を定量します。Image J.Nextで画像を処理しながら、精製したK-bZIPをリン酸緩衝生理食塩水で希釈します。マイクロリットルあたり100ナノグラムの最終濃度を達成するため。そして、マイナス80°Cで小さなアリコートで保管してください。精製されたタグ付きK-bZIPのマイクロリットルあたり100ナノグラムの3マイクロリットルをin vitro SUMOylationマスターミックス反応で添加します。次に、マスターミックスの内容物を穏やかに混合し、摂氏30度で3時間インキュベートします。次に、ローディングバッファー付きの20マイクロリットルの2X SDSページを追加して反応を停止します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱して、タンパク質を変性させます。次に、20マイクロリットルのサンプルを10%SDSページゲルにロードします。そして、染料がゲルの底に達するまで、ゲルを80ボルトで約120分間泳がせます。エレクトロ麻痺が終わったら、ゲル装置を切断します。.そして、ゲルをセミドライ転写バッファーに5分間移します。次に、PVDFメンブレンをメタノールで満たされた別の容器に1分間浸します。メタノールからPVDFメンブレンを取り出し、セミドライトランスファーバッファーに浸します。次に、メンブレンを5分間静かに攪拌します。セミドライ電気泳動装置の安全カバーを取り外します。濾紙をあらかじめ濡らします。そして、プラチナアノードの底にゲルサンドイッチを準備します。カソードプレートを安全カバーに固定した後、ブロットを15ボルトの定電流で90分間運転します。次に、セミドライ装置を切断した後、電源をオフにし、PVDFメンブレンを取り出します。次に、PVDFメンブレンをブロッキングバッファーでブロッキングバッファーで1時間、オービタルシェーカーで毎分30回転でブロックします。次に、PVDFメンブレンを抗p53抗体およびブロッキングバッファーとハイブリダイズし、サスペンションミキサー上で摂氏4度、毎分30回転で12〜16時間ハイブリダイズします。次に、PVDFメンブレンを取り出し、トリス緩衝生理食塩水tween20で満たされた容器に移します。次に、PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水Tween 20にオービタルシェーカーで30分間、毎分45回転で浸します。次に、PVDFメンブレンを、ブロッキングバッファーで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗ウサギ抗体とハイブリダイズし、室温で1分間30回転で懸濁液ミキサー上で1時間ハイブリダイズします。次に、PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水Tweenで20回3回洗浄します。洗浄後、PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水Tween 20に懸濁液ミキサーで毎分45回転で30分間浸します。次に、トリス緩衝生理食塩水tween20をリン酸緩衝生理食塩水に交換します。PVDF膜を摂氏4度で最大12時間保存します。次に、増強化学発光基質試薬1と2を1対1の比率で混合します。次に、リン酸緩衝生理食塩水からPVDF膜を剥がし、パンチポケットで短時間吸い取り、余分な水分を吸収します。すぐに400マイクロリットルの化学発光試薬を膜表面に加え、3〜5分待ちます。短時間ブロットして余分な化学発光試薬を排出し、メンブレンが完全に乾燥するのを防ぎます。ルミネセントのイメージングシステムを使用して、ブロットを露光します。ここでは、免疫ブロット分析を行い、p53ターゲットをSUMOylateするために必要なUbc9酵素の濃度を示しました。このことは、Ubc9酵素の1/2および1/5の濃度で、SUMO 1およびSUMO 2ペプチドを用いたin vitro SUMO化アッセイにおいて、p53酵素を十分にSUMOylateできることを示しています。SUMO化p53を分析するために、メンブレンを抗p53抗体でプローブしました。同様の免疫ブロット分析を行い、SUMO 1、SUMO 2、および SUMO 3 ペプチドを用いた in vitro SUMOylation アッセイで p53 標的を SUMOylate 化するためには、E1 濃度の半分と 1/10 濃度の Ubc9 酵素が必要であることを示しました。ここでは、メンブレンをCoomassieで染色して、精製されたK-bZIPタンパク質を示しました。バキュロウイルス発現系を用いて、精製したK-bZIPをSDSページで解析し、ウシ血清アルブミンを標準試料として比較した。追加の免疫ブロット分析も行われ、K-bZIPの濃度を上げると、E1の半分の量とUbc9酵素の1/10の量の存在下でp53のSUMO化が触媒されることが示されました。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば4時間で完了します。この手順を試みる際には、in vitro SUMOylation assay のすべての試薬を氷上に保管し、1 回の大きな希釈ではなく、一連の希釈を行うことを覚えておくことが重要です。この手順を見つける 過剰発現SUMOlygaseのような他の方法は、in vitroでSUMO化を確認するために実行できます。その開発後、この技術は、SUMO化の分野の研究者がより多くのSUMOlygaseを探求し、特異性の力を検証するための道を開きました。このビデオを見れば、in vitroシミュレーションアッセイを使用してSUMO e3ライガスを同定する方法を十分に理解できるはずです。

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

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JoVE Journal

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生物学

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SUMO化アッセイ:イムノブロッティングにより基質タンパク質のSUM化状態を検出するIn vitro技術

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我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

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本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

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体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

学ぶ体外SUMO化アッセイを用いて、新規SUMO E3リガーゼを同定し、異なるSUMOアイソフォームへの特異性を調査する方法。この技術は生化学研究においてタンパク質修飾メカニズムの理解に貢献します。

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

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