貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

このプロトコルは、アストロ サイトの貪食能を測定するライブ イメージングの in vitro貪食アッセイを提示します。精製したラット アストロ サイトやミクログリアは、pH インジケーター共役シナプトソームと共に使用されます。このメソッドは、リアルタイムの貪食・分解速度を検出することができ、アストロ サイト細胞貪食の変調の要因を識別するために適切なスクリーニングのプラットフォームを提供します。

この実験の全体的な目標は、pH指示薬結合シナプトソームの食作用のin vitroライブイメージングを通じて、アストロサイトやミクログリアなどのグリア細胞の巻き込みと分解の動態をリアルタイムで検出することです。この方法は、グリア細胞の食作用が健康な脳と病気の脳でどのように調節されているかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitro培養細胞のライブイメージングを通じて、グリア細胞のリアルタイムの食作用動態を効果的に監視および分析できることです。

この方法は、グリア細胞の巻き込みおよび分解能力を調節する因子および化合物のスクリーニングにも使用できます。解凍したシナプトソームサンプルを21,092 Gおよび摂氏4度で3〜4分間遠心分離することから始めます。上清を吸引した後、ペレットをチューブあたり200マイクロリットルの0.1モル炭酸ナトリウムに再懸濁し、十分に混合した後、各サンプルに2マイクロリットルのpHインジケーターを追加します。.

穏やかな渦巻きの後、アルミホイルカバーで溶液を光から保護し、サンプルをツイストシェーカーに置き、室温で2時間穏やかに攪拌します。インキュベーションの終わりに、1ミリリットルのダルベッコPBS(DPBS)を加え、遠心分離によってシナプトソームを回収し、1回の洗浄でペレットを1ミリリットルの新鮮なDPBSに再懸濁します。最後の遠心分離後、5%DMSOを添加した200マイクロリットルのDPBSに非機能的なシナプトソームペレットを再懸濁します。

シナプトソームの巻き込みのライブイメージングでは、まずコンフルエントアストロサイト培養の各ウェルから上清を除去し、1回の洗浄につき1ミリリットルのDPBSで細胞を3回迅速に洗浄します。最後の洗浄後、300マイクロリットルのイムノパン化アストロサイト塩基性培地と5マイクロリットルのpH指示薬標識シナプトソーム、およびグリア細胞の食作用を調節できる追加の因子を追加します。シナプトソームがウェルの底に沈殿し、摂氏37度、CO2が5%のアストロサイト上のホスファチジルセリン受容体に付着するのを待ちます。

40分後、上清を捨て、1回の洗浄につき1ミリリットルのDPBSでウェルを3回すばやく、しかし穏やかに洗浄します。最後の洗浄後、目的の因子を補充した500マイクロリットルの新鮮な培地を適切なウェルに加え、プレートをライブイメージング装置に移します。イメージング位置を選択し、フォーカス、露光時間、明るさ、LED電力を調整し、ライブイメージングの画像形式、時間間隔、および合計サイクル数を実験的に適切に設定します。

次に、食作用実験のライブイメージングを開始します。適切な実験エンドポイントで、イマジン解析プログラムを開き、タイムラプス画像シーケンスをインポートします。画像を 8 ビット グレースケールに変換し、ローリング バーの半径 50 ピクセルで背景の減算を開始します。

次に、Time Series Analyzer V3 プラグインを開き、関心領域をプラグインにドラッグします。関心領域マネージャーで、[追加] をクリックします。Time Series V3 プラグインで、「Get Total Intensity」をクリックします。

次に、結果を保存し、データを統合します。調製後、シナプトソームは外膜上でホスファチジルセリンを発現し、機能の喪失を示唆しており、これはアストロサイトやミクログリアのホスファチジルセリン受容体によって認識できます。pH指示薬標識シナプトソームは、食作用を受けると真っ赤な蛍光を発します。

グリア細胞の食作用を定量化するために、赤色蛍光シグナルの領域、または食作用指数を測定することができます。アストロサイトは、多数のpH指示薬結合シナプトソームの貪食に効率的ですが、ミクログリアはシナプトソームを飲み込んで分解するのに迅速です。興味深いことに、アストロサイト馴化培地に含まれるアストロサイト分泌因子は、アストロサイトとミクログリアを介した食作用の両方を増加させるために不可欠です。

さらに、マウスMEGF10ノックアウトアストロサイトは、野生型細胞と比較して有意に食作用能力が損なわれていることを示しました。その開発後、この技術は、神経科学とグリア細胞生物学の分野の研究者が、さまざまな神経障害を治療するための潜在的な方法として、グリア細胞食作用の調節に関与するメカニズムを探求する道を開きました。