ニューラル ネットワークによる発達有能か無能なマウス完全育てられた卵母細胞の同定

この手順の全体的な目標は、非侵襲的ツールを使用して、裏側の発生能力を持つオクサイトを特定することです。この方法の主な利点は、in vitro成熟中に発生する卵子の動きを単純に観察することで、雌の配偶子の発達能力を評価できることです。この手法は、ニューラルネットワークベースの分析である粒子画像速度測定と組み合わせたタイムラプスイメージングに基づいています。

ここでは、胚性小胞から中期の2段階への移行中にマウスの卵母細胞が、その発生能力または無能力と有意に相関する前記プラズマ運動の異なるプロファイルを示すことを実証するために取られた手順について説明します。世界保健機関(WHO)によると、不妊症はカップルの約20%が罹患している病状であり、さらに、がん治療を受けている女性の3分の1は、早期卵巣不全のリスクにさらされています。これは、米国やイタリアなどの国の約300, 000人または30, 000人の女性に相当します。

卵子の発達能力を特定するための非侵襲的手順のデザインは、妊娠結果の全体的な成功を改善するのに役立ちます。ここでは、マウス用に開発された手順の最も重要なステップの詳細を示します。これにより、ウシやヒトなどの他の哺乳類種で容易に試験および使用できるようになります。卵巣は、M2、培地、温められ平合化、摂氏37度、CO2が5%のM2を含むペトリー皿に移されます。

卵管と一部の脂肪がまだ卵巣の周りに存在する場合は、それらを除去する必要があります。次に、ピンセットで卵巣を保持し、滅菌済みの1G針を使用して卵巣の表面に穴を開けます。穿刺した卵巣をM2培地から取り出し、手で引っ張ったマイクロピペットを使用して、新しいきれいなM2培地に最初の移動を行い、卵子を取り巻く卵丘細胞が完全に除去されるまで数秒間ピペットでインおよびアウトします。

次に、卵母細胞を20マイクロリットル滴のM2培地に移し、一部の卵丘細胞が持続している場合は、卵丘細胞が完全に排除されるまで、滴下から滴へと数回の継代を通じて卵子を完全に除去します。最終濃度0.05マイクログラム/ミルでHoechst 33342を調製するために、まず5ミリグラム/ミルの濃度のHoechstのマイルド溶液から始め、1回限りのpbsで調製し、これを必要な濃度が得られるまでさらに希釈します。3.5マイクロリットルのHoechst溶液をPetrie皿の蓋の底に置き、希釈した卵子を1滴ずつ移します。Hoechst染色プロセス中の光の露出を減らすように注意しながら、皿を暗い蓋で覆います。

10分間の染色後、紫外線を用いた蛍光顕微鏡で卵子を観察します。クロマチンの立体配座に基づいて、それらは、核小体の周囲にx陽性クロマチンの環を示す場合は囲まれた核小体、SN、または核小体にx陽性クロマチンの環がなく、全体的なクロマチンが核小体に分散しているように見える場合は、非囲まれた核小体、NSNとして分類されます。アルファmem媒体の4つの2マイクロリットルの滴は、特定の距離内に滴を保つように注意しながらガラス底のペトリー皿に置かれ、液滴は予め温められ、均一化された鉱物油で覆われ、合計3〜4個の卵子が各滴に移されます。

ペトリー皿は、タイムラプス顕微鏡のインキュベーションチャンバーに移され、摂氏37度、CO25%の温度を長時間維持し、赤色LEDライトで照明することができます。タイムラプス分析の前に、BioStationソフトウェアを使用して、タイムラプスルーチン中の1つのドロップから次のドロップへの通過を自動化するために、各ドロップの座標が設定されます。タイムラプスフレームは、8分間隔で合計15時間撮影されます。

記録された動画は、CellPaveソフトウェアを使用して解析され、速度ベクトルで表される細胞質の動きを検出できます。まず、CellPaveツールを使用して、各卵子の周囲を手動で区切ります。次に、ソフトウェアは、2つの連続したタイムラプスフレーム間の比較で発生する細胞質の動きの速度を計算し、色の強度と長さが動きの速度と方向を定義する色付きの矢印を配置することでそれを表現します。

ここで見られる卵子の下のヒストグラムは、SN卵子の15時間の記録期間における全体的な細胞質運動の速度を示しています。同じタイプの分析がNSN卵子に対して行われます。SN卵子と比較したNSN卵子が示す1つの押し出しピークが極性体に遅延していることに注目してください。

画面の下部には、卵子の細胞質移動速度の時間パターンが表示されます。速度は、2つの連続するフレームを比較することによって計算されます。次に、細胞質の移動速度の生データをExcelシートにエクスポートし、行、Frens配列、および分析された単一の卵子の列

左側にはSN卵子のデータ、右側にはNSN卵子のデータがあります。次に、SNまたはNSN卵子のデータを10のサブグループに分割します。9つはトレーニングに使用され、緑色です。

そして、ブラインドテスト用の1つは赤い色です。この手順を合計10回繰り返します。ブラインドテストサンプルを変更するたびに。

次に、データはフィードフォワード人工ニューラルネットワーク(FANN)を通じて調査されます。FANNは、タイムラプスフレーム全体を分析するために構築されており、ここでは「入力ニューロン」後者は3つの隠れニューロンに接続されており、それ自体が2つの出力ニューロンにリンクされています。1つの出力は、入力が有能な卵子である確率を示します。

もう一つは、それどころか、入力が無能な卵子であるということです。2つの出力の比較により、卵母細胞の精神的能力が91.03%の精度で予測されます。この技術は、ここに示すようにマウスの卵子用に設定されています。

しかし、将来的には、ヒトの卵子でテストすることになる。実際、人工生殖技術の分野では、卵子の品質分析による非侵襲的な手順が特に求められています。