系統解析を使用して真核生物遺伝子の起源を調査するには

この方法は、配列の収集方法や正しい計算モデルの選択方法など、植物遺伝学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、習得が非常に簡単であることです。一般に、この方法に不慣れな人は、系統発生の原理と方法に関する基本的な知識が不足しているため、データの扱い方がわからないという理由だけで苦労する可能性があります。

この手法は、真核生物のSWEET遺伝子のアラインメントを解析した際に初めて開発されました。この手法の視覚的なデモンストレーションは、アライメントのさまざまな側面に対して多くの選択肢と設定があるため、非常に重要です。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、単細胞真核生物からの35の候補SWEETタンパク質を選択することから開始します。

35のSWEETシーケンスをClustal Omegaに入力して整列させます。FASTA形式のタンパク質配列をコピーして入力ボックスに貼り付けるか、FASTA形式の配列ファイルをアップロードします。それがアミノ酸配列であることを指定するには、ステップ1セクションのプルダウンメニューの下にあるアイコンをクリックします。

必要に応じて、ステップ 2 のセクションで出力形式とその他のパラメーターを指定します。このスタディでは、出力形式をClustal without numberに設定し、他のパラメータはデフォルト設定のままにします。ほとんどの場合、デフォルトのパラメータは指定なしで適切に機能します。

ステップ 3 のセクションで整列を送信して実行します。位置合わせが完了するまで、数秒から数分かかる場合があります。Result Summaryパネルで、Alignment in CRUSTAL形式のリンクを右クリックし、アラインメントされたシーケンスを35.clustalとして保存します。

アラインメント結果ファイルをBioEditで開くには、Sequenceをクリックし、BioEditのメインパネルの最初のプルダウンメニューでEdit Moodを選択します。次に、サブメニューの「残留物の編集」をクリックします。カーソルを使用して整列の左側にある突き出たシーケンスを選択し、[編集]メニューの[削除]アイコンをクリックして、選択したシーケンスを削除します。

最初のMtN3唾液ドメインの右側にある配列を選択して削除し、トリミングした最初のMtN3唾液ドメイン配列を35-1.fasとして保存します。同様に、2番目のMtN3唾液ドメインの左右の配列を削除し、35-2.fasとして保存します。1番目と2番目のMtN3唾液ドメイン配列は、リズムまたはTMHMMで事前に予測できます。

MEGAでファイル35-1.fasを開き、プロンプトが表示されたら[整列]をクリックします。[編集] メニューで [すべて選択] をクリックします。

次に、「Select Sequences」をクリックします。分類群の名前と順序は黒で選択されます。編集メニューから「コピー」を選択して、シーケンスをクリップボードにコピーし、コピーしたシーケンスをdocファイルに貼り付けます。

doc ファイルで、すべての番号記号を大なり記号に置き換え、関連のない文字をすべて削除して FASTA 形式に変換します。各分類群名の末尾に 1 を追加して、最初の MtN3 唾液ドメイン配列としてマークします。同じ方法に従って2番目のMtN3唾液ドメイン配列を処理し、各分類群名の後に2を追加します。

次に、1番目と2番目のMtN3唾液ドメイン配列をFASTA形式でdocファイルに結合します。これを行うには、結合されたシーケンスをClustal Omegaに再度ロードし、前と同じようにシーケンスを整列させます。結果を 35realigned.cllustal として保存します。

35realigned. clustal ファイルを BioEdit で開きます。アラインメントされた配列の両端にある不均一なアミノ酸残基を削除し、配列を35realigned.fasとして保存します。

一部の非標準文字を保存できないという警告が表示されたら、[はい] をクリックします。オープン35再調整。MEGAのfas。

[データ] メニューをクリックし、[位置合わせのエクスポート] を選択します。次に、配置を POP 形式で 35 として保存します。次に、後でMRベースで使用します。

その間、MEGAのメインパネルにある[モデル]アイコンをクリックします。「Find Best DNA Protein Models」を選択し、ポップアップウィンドウで「OK」をクリックします。[コンピューティング] をクリックして、モデルの検索プロセスを開始します。

新しい進行状況パネルが開きます。このプロセスは、ロードされたシーケンスの複雑さとコンピューターのパフォーマンスに応じて、数分から数日続きます。モデル検索プロセスが完了すると、結果を示すテーブルが開きます。

最小の BIC スコアが最初にリストされ、次に一連の異なるモデルが続き、BIC スコアが徐々に増加します。BIC スコアが最小の LG+G+F の最初のモデルは、35realigned に基づく ML ツリーの推奨モデルです。fas ファイル。

次に、MEGAのメインパネルにある系統発生アイコンをクリックします。「最尤木の構築/テスト」をクリックし、ポップアップ・パネルで「はい」をクリックします。新しいウィンドウが開き、指定が必要なさまざまなパラメーターが表示されます。

まず、系統発生ボックスのテストでブートストラップ値を設定します。ほとんどの場合、500または1, 000で十分です。「置換モデル」で、置換タイプとして「アミノ酸」を選択します。

代替モデルを選択する目的は、現在の状態に基づいてシーケンス間の真の差を推定することです。「モデルと方法」ボックスで「LG with Freqs Model」を選択します。[レートとパターン] ボックスで、緩やかに変化するサイトの変化により多くの重みを与えるなど、サイト間のレート変動を説明するために [ガンマ分布] を選択します。

[データ サブセット] ボックスで [完全削除] を選択し、ハイフンを含むすべての列を削除します。他のすべてのパラメーターはデフォルトの状態に保ちます。これらのパラメータを指定したら、[計算] アイコンをクリックして計算を開始します。

MEGAを使用した計算が終了すると、系統発生MLツリーが表示されます。ツリーパネルの「ファイル」アイコンのプルダウン・メニューで、「現在のセッションを保存」を選択して結果を保存します。本研究では、結果は 35.mas として保存されました。

Tree パネルには、クレードの長さ、ツリーのスタイル、ツリートポロジ、分類群名のフォント、サイズ、色など、多くのパラメータが表示され、さまざまなオプションに設定できます。クリックして最終的なツリーファイルを保存します 画像 アイコンをクリックし、図を別の形式で保存するか、画像を編集のソースとしてコピーします。SWEETとsemiSWEETの関係の解析を進め、テキストプロトコルに詳述されているMR Baseによる配列アラインメント系統樹構築を使用します。

系統樹は、35のSWEET配列の最初のMtN3唾液ドメインすべてが1つのクレードとしてクラスター化され、SWEET配列の2番目のMtN3唾液ドメインが別のクレードとしてクラスター化したことを示しています。さらに、SWEETとsemiSWEETのアライメント結果は、α-プロテオバクテリア由来の一部のsemiSWEETがSWEET配列の最初のMtN3唾液ドメインに整列したのに対し、メタノバクテリア由来のsemiSWEETはSWEET配列の2番目のMtN3唾液ドメインに整列したことを示しています。これらの結果から、SWEETsを含む2つのMtN3唾液ドメインは、細菌のsemiSWEETと古細菌の進化的融合に由来する可能性があることが示唆されています。

この手法を習得すると、データの複雑さに応じて1時間から数日で実行できます。このプロトコルを試す際には、事前に高品質の配列を収集することが重要です。その開発後、このプロトコルは、進化の研究者が相同遺伝子間の関係を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、系統樹の構築方法についてよく理解しているはずです。