リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、リアルタイムの3D単粒子追跡顕微鏡を実装することです。この手法の主な利点は、単一の拡散ナノスケールの物体を光子制限された時間分解能で連続的に監視できることです。この手法は、感染プロセス全体を通じて単一のウイルス粒子を追跡するなど、ウイルス学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

光学テーブルの上に装置を準備します。このセットアップは、キャリブレーションの準備ができています。主要コンポーネントには、488ナノメートルの固体レーザー、ビームの経路に沿った2つの電気光学デフレクター、調整可能な音響勾配レンズ、マイクロおよびナノポジショナーを備えたサンプルステージが含まれます。

このセットアップの概略図では、追加の詳細について説明します。これがサンプルステージへのレーザービーム経路です。電気光学デフレクターと調整可能な音響レンズは、ビームの経路に沿っています。

これらのデバイスは、サンプルステージでレーザースポットを動的に駆動します。サンプルからの光子は、アバランシェフォトダイオードによってカウントされます。カメラがパーティクルの位置を監視します。

サンプルの位置は、マイクロコントローラーとナノコントローラーを使用して設定します。フィールドプログラマブルゲートアレイは、レーザースポット、リアルタイムの粒子位置計算、ステージフィードバック、およびフォトンカウンティングを制御します。2つのサンプルを準備する必要があります。

1つ目は、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した190ナノメートルの蛍光ビーズが必要です。カバースリップを使用して、固定粒子サンプルを調製します。400マイクロリットルのビーズ溶液をカバースリップに置きます。

次に、自由に移動する粒子サンプルを作成します。水で希釈した110ナノメートルの蛍光ビーズが必要です。400マイクロリットルの溶液をカバースリップに載せて、自由に移動する粒子サンプルを作成します。

固定された粒子サンプルを顕微鏡に持って行き、取り付けます。サンプルはXYナノポジショナー上にあります。レーザー、光検出器、ビームラインエレメントのコントローラー、ポジショナーのスイッチを入れます。

Piezo nanoポジショナーを閉ループで実行します。次に、光検出器の手前から蛍光発光フィルターを取り外します。次に、マイクロポジショナーでサンプルのz位置を変化させます。

位置が変化するため、光検出器を使用してレーザーの反射強度を監視します。対物レンズの焦点面を特定するために、強度を最大化します。サンプルを焦点面に置いた状態で、蛍光発光フィルターを交換します。

次に、コンピューター制御ソフトウェアで作業します。カスタムソフトウェアを使用して、サンプルをラスタースキャンします。まず、スキャン範囲を大きく設定し、開始と終了の差を設定します。

ここでは、Y軸が10マイクロメートル、X軸が10マイクロメートルの範囲となっています。また、各方向に大きなステップサイズを設定します。ここでは、200ナノメートル。両方の Z フィールドを、以前に特定した焦点面の位置に設定します。

スキャンを押すと、ラスター スキャンが開始されます。スキャンを開始します。このソフトウェアは、夜間のツアーで電気光学デフレクターを駆動し、光検出器からカウントを収集し、ナノポジショナーを駆動し、位置計算を実行します。

スキャンは、プラタ蛍光を通じてソフトウェアで識別可能な粒子を見つけます。スキャンの各サイトについて、ソフトウェアは、エレクトロオブジェクトデフレクタースキャンの中心に対するXおよびYの粒子位置の推定値も決定します。粒子を見つけたら、その周りのスキャン範囲をXとYで2マイクロメートルに縮小し、また、両方のステップサイズを100ナノメートルに減らします。

Z方向に2マイクロメートルのスキャン範囲を追加して、蛍光フォーカスを囲みます。Z ステップ サイズを 200 ナノメートルに設定します。3Dラスタースキャンを開始して、蛍光フォーカスを見つけます。

スキャンから生成されたデータは、調整可能な音響勾配レンズの電源がオンになる前の焦点面を示しています。制御ソフトウェア内の調整可能な音響レンズ設定の操作に進みます。まず、[接続]をクリックし、次に電源をオンにします。

パルスとゲーティング制御セクションに移動し、出力トリガーモードをRGBからマルチプレーンに変更します。次に、出力位相を変更できるようにRGBに戻します。スライダーを使用して、出力フェーズを 0 度、90 度、270 度の間で設定します。

次に、周波数制御セクションに移動します。そこで、68、500ヘルツの共振周波数を選択します。画面の上部に移動し、[詳細設定]をクリックします。

次に、[設定] タブを選択します。新しい画面で、ゼロ列の最大頻度を見つけます。調整して、周波数検索範囲を変更します。

[編集]をクリックし、キャリブレーションを保存してから、キャリブレーションを終了します。周波数コントロールに戻り、共振周波数を変更します。すぐに 68, 500 ヘルツに戻し、キャリブレーションを有効にします。

で ampリチュードコントロールセクションで、スライダーを使用してゆっくりとリチュードを35%に上げます この後、ロックレゾナンスをクリックします。周波数がロックされている場合は、[レゾナンスのロックを解除]をクリックします。ラスタースキャンソフトウェアに戻ります。

XとYの粒子を中心とする2マイクロメートルのスキャン範囲を入力し、100ナノメートルのステップサイズを使用します。粒子をZ軸の4マイクロメートルの範囲の中心に置き、ステップサイズは200ナノメートルです。その結果生じるスキャン画像では、粒子を表す照明領域の幅は約1マイクロメートルです。

これに基づいて、XY スケール パラメーターを調整して、X と Y の推定位置が負の 0.5 マイクロメートルから 0.5 マイクロメートルの範囲になるようにします。Zスケールで同様の手順を行った後、ナノポジショナーをゼロ位置に設定します。続行する前に、ナノポジショナーの電源を切ってください。

固定された粒子サンプルを、自由に動く粒子サンプルに置き換えます。次に、すべての機器がオンになっていることを確認します。Piezo nanoポジショナーをオープンループで実行します。

コンピューターで、前と同じように調整可能な音響勾配レンズソフトウェアを設定します。蛍光発光フィルターを光検出器への経路から取り外します。サンプルのZ位置を変化させ、カバースリップからレーザー反射の強度を最大化して、焦点面を見つけます。

焦点面を見つけたら、フォーカス位置を溶液の15マイクロメートルに増やします。蛍光発光フィルターを交換してください。カスタム追跡ソフトウェアを開きます。

位置推定パラメーターを、最適化中に検出された値に設定します。次に、ナノポジショナーの応答速度を決定する積分制御定数を設定します。X 定数から開始します。

低い値を入力し、ゆっくりと増やします。粒子位置の読み出しで振動が始まるときは、制御定数の値に注意してください。積分制御定数を、発振開始時の値の約70%に減らします。

制御定数 Y と Z を使用して手順を繰り返します。トリガーを設定して、トラックのしきい値の追跡を3キロヘルツに開始します。トラックの最小値(トリガーからトラッキングの終了まで)を1.5キロヘルツに設定します。

テストを開始するには、[検索] をクリックし、[自動追跡] をクリックします。この動画は、3次元の動的光子局在追跡顕微鏡を用いて、水中の110ナノメートルの蛍光ナノ粒子の拡散運動を追跡した結果を示しています。ナノポジショナーの位置読み出しを使用して測定された粒子の位置は、3D軸上に表示されます。

挿入図は、科学的な海苔カメラの読み取りです。これは、粒子がトラッキングシステムによって焦点ボリュームに保持され、ロックされていることを示しています。粒子は追跡され、その位置は2分以上記録されました。

この手法を習得すると、システムが適切に位置合わせされ、キャリブレーションパラメータが設定されていれば、50分以内に行うことができます。開発後、この技術は、薬物送達の分野の研究者が細胞貨物の内在化と輸送の経路を探求するのに役立ちます。このビデオを見れば、ゼロタイムの3D単粒子追跡顕微鏡の操作方法について十分に理解できるはずです。