Name: リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶリアルタイム3D単一粒子追跡顕微鏡の構築と操作方法。電気光学偏向器と音響勾配レンズを用いて、ナノスケール蛍光プローブや単一ウイルス粒子の動態を連続的に観測できます。ウイルス学における感染過程の解明に有用です。

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この作品は、によって、国立医学研究所の一般的な受賞番号 R35GM124868 の下で健康の国民の協会のデューク大学にサポートされていました。

1 のレイアウトおよび配置をセットアップします。
<ol>
	<li>インストールおよび追跡励起のコリメーション レーザーします。<ol>
		<li>自作のマウントを使用して光学テーブルにレーザーを貼付します。マウントは、取り付けレーザー ヘッドおよび光学テーブルの穴が付いたシンプルなアルミ板です。レーザーは、安定性と放熱のため金属製のマウントにしっかりと固定する必要があります。この作品は、特定の蛍光体に合うか実験する波長を選択できますが照明 (図 1)、488 nm 固体レーザを使用してください。重要な要因は 2 つのデフレクタ間波長板によって主に決定される 2D EOD の作業範囲をレーザー波長に合わせて (図 1: W2)。488 nm レーザーは効果的に、緑または黄色蛍光蛋白質 (GFP/YFP)、生きているセル実験における一般的な蛍光タグであるを刺激できます。</li>
		<li>レーザー ビーム高さと誘電体ミラーのペアを使用して方向を調整 (図 1: M). レーザー光は光学テーブルに平行かどうかを確認し、適切な高さに調整します。 注: 高さは顕微鏡プラットフォームに基づいて選択する必要があります。それ明示的には述べていませんが、このプロトコルで使われるそれ以降のすべてのミラーのこの高さを維持しなければなりません。</li>
		<li>コリメート レンズのペアを持つビーム (図 1: L1 と L2)。レンズの焦点距離は、2 D EOD の絞りでクリップされるレーザ スポットを避けるために慎重に選択必要があります。クリッピングは 2D EOD を通過した後レーザー ビーム形状の変化によって明白であります。コリメーションここの品質との相違は 2D EOD たわみ性を悪化する収差のレンズによって増幅されるため非常に重要です。理想的には、少なくとも 20 m のポイントにビームの集束によってビームをコリメートします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ピンホールを配置 (図 1: PH) 最初のコリメーション レンズの焦点に適切なサイズの (図 1: L1)。<ol>
		<li>適切なサイズのピンホールを選択します。ピンホールの大きさは、以下の計算に基づいて選択できます。 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> レーザーの波長λはfは最初のレンズの焦点距離、 Dは入射ビーム径。</li>
		<li>3D 変換ステージ上ピンホールをマウントし、最初のコリメーション レンズの焦点を正確に配置できるようにします。</li>
		<li>ピンホールの位置を調整します。ピンホール後レーザー パワー メーターを置き、電源メーター読み出しを最大化するために XYZ のピンホールの位置を調整します。回折リングを観察すると、手前に 2 D EOD アイリス ブロックします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>グラントムソン偏光板のインストール<ol>
		<li>グラントムソン偏光板を置く (図 1: GP) 第二のコリメーション レンズ後 (図 1: L2) レーザー光の偏光をきれいにします。パワーメータを最大転送を見つけるに偏光板を回転させます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EODs のインストール<ol>
		<li>2 EODs を使用 (図 1: EOD1 &amp; EOD2) X および Y の方向のレーザーをそらすために。ヨー、ピッチ、および各 EOD の高さを調整することによってレーザ伝送を最大化します。</li>
		<li>互いに各デフ側に製造元から提供されるアライメント マーカーを使用して 2 つの EODs を合わせます。</li>
		<li>EOD の出力を検査する 2 D EOD のコント ローラーにテスト パターンを適用されます。下記 FPGA または関数発生器によって提供される簡単な正弦波でナイトツアー (図 2) を指定できます。ベスト パフォーマンスのため各偏向で偏向は圧電 nanopositioner の X または Y 方向に平行する必要があります。この方向は、トランス ミッション軸デフレクタの角度の方向によって決まります。たわみ方向を回転すると、2 D EOD を移動せず、ピエゾ nanopositioner 軸にたわみ軸を揃える 2 D EOD 後鳩プリズムを配置します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>半波長板のインストール<ol>
		<li>半波長板を配置 (図 1: W1) グラントムソン偏光板の間 (図 1: GP) と着信のレーザーに合わせて 2 D EOD 2D EOD のたわみ軸と偏光のビームします。2 D EOD 後長焦点レンズ (300 mm) を配置し、レーザーの焦点に sCMOS カメラを配置します。次に、騎士のツアー (図 2) 以下を生成する 2次元 EOD を入れます。半波長板を回してカメラの均等に正方形レーザ分布が観察されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>レンズのペアと中継レンズ組み合わせを費やすはりのインストール<ol>
		<li>レンズのペアを配置 (図 1: L3 と L4) 対物レンズの背面の開口部に合わせてビームを展開する 2 D EOD 後 (図 1: OL) とレンズの別のペア (図 1: L5 と L6) に対物レンズに焦点面を中継します。必ずタグ レンズは、後の手順でそれらの間インストールされますとレンズのこれらの 2 つのペアの間の十分な余裕を確保してください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ダイクロイック フィルター、10/90 ビームスプリッター、フォーカシング レンズ、APD、対物レンズと蛍光発光フィルター検出経路を完了するインストールします。<ol>
		<li>ダイクロイック フィルターをインストール (図 1: DC) 対物レンズに向かってレーザーを反映します。長いレンズの筒の上下に 2 つの菖蒲を使用する対物レンズの中心をまっすぐ通過するレーザーを合わせます。</li>
		<li>10/90 ビームスプリッターをインストール (図 1: BS) によって光の 10% が、イメージング用 sCMOS カメラ (後述) と追跡のための APD を通過の 90% によって反映されます。</li>
		<li>APD を合わせます。対物レンズで観察にレーザーを集中します。Coverslip からリフレクションを使用して、目的の焦点で観察を置くと APD 読み出しの強度をチェックすべてダウン ストリーム要素を揃えます。ビームスプリッター後、レンズを中心に APD をインストール (図 1: L7) 3 D 変換段階で APD が続きます。目標からのレーザー反射レンズの中心を通るようなレンズを配置します。</li></ol></li></ol>APD の位置を上、レーザーの反射の強度を最大化する 3 D の位置を調整することによって最適化できます。APD の位置は、任意の方向に検出器位置の移動、強度が低下する最適な位置です。
		<li>Longpass 蛍光発光フィルターをインストール (図 1: F) ビームスプリッター反射・散乱光を削除する前に。</li>
	
	
	<li>タグ レンズのインストール<ol>
		<li>レンズの 2 つのペアのタグ レンズ (図 1間: L4 と L5) として前に言及し、図 1に示す。タグ センター レンズを垂直に通過するビームをヨー、ピッチ、高さおよび横の位置を調整します。</li>
	</ol>
	</li>

2. 試料調製。
<ol>
	<li>固定粒子の作製<ol>
		<li>190 nm の蛍光ビーズを希釈 〜 5 × 108ビーズ/mL の PBS の。圧電ステージのサンプル ホルダーに coverslip とマウントに 400 μ L ビーズ ソリューションを追加 (ビーズの量は、試料ホルダーに依存; ここで使用されるサンプル ホルダーの商工会議所の直径は 18 mm)。ここで使用されるビーズ、PBS によって発生する上、入金する粒子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>無料の移動粒子の作製<ol>
		<li>希釈する 110 nm の蛍光ビーズ 〜 5 × 108ビーズ/mL の DI 水で。観察に 400 μ L ビーズ ソリューションを追加し、圧電ステージのサンプル ホルダーにマウントします。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. トラッキング パラメーターを最適化します。
<ol>
	<li>ラスター スキャン固定粒子<ol>
		<li>顕微鏡に固定粒子サンプルを置きます。</li>
		<li>レーザー、マイクロポジショナー コント ローラー、ピエゾ nanopositioner コント ローラー、タグ レンズ コント ローラーおよび EOD コント ローラーを入れます。順序が重要ではないことに注意してください。閉ループにおける圧電 nanopositioner を実行します。</li>
		<li>ラスター スキャン プログラムを使用してカスタム スキャン ソフトウェア (図 S3、著者からの要求時に利用可能なソフトウェア)、騎士のツアー (図 2) で 2 D EOD をドライブ、APD からカウントを収集し、ドライブの圧電 XYZ のサンプルnanopositioner、位置計算 (図 S2) を実行するとします。ステップ サイズは 40 nm、スキャン範囲は 2 μ m。<ol>
			<li>目的のフォーカス、coverslip に配置、蛍光発光フィルターを削除し、マイクロポジショナーの Z 位置の機能として信号強度を最大化する、coverslip からレーザーの反射を使用します。後焦点面にサンプルを置くこと、蛍光発光フィルターを配置戻る。</li>
			<li>スキャナー用のプログラムを開きます。'開始'、'終了'、および 'ステップ' で数値を入力して、スキャン範囲とステップ サイズを設定します。最初大規模なスキャン範囲と粒子 (例えば、200 nm ステップ サイズ 10 × 10 μ m 幅) を検索する手順のサイズを設定します。粒子を検出、スキャン範囲を縮小、ステップ サイズ (例えば、100 nm ステップ サイズの 2 x 2 μ m 範囲) を減らします。蛍光フォーカスを見つけるために 3D ラスター スキャンを実行するには、'scan' をクリックします。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>タグ レンズの設定 (図 3を参照してください)<ol>
		<li>タグ レンズ制御ソフトウェアをクリックします。順番を '接続'、'電源を入れます'] をクリックします。</li>
		<li>トリガー信号の出力の位相を変更するには、出力トリガー モードを変更する必要は。まずモードを 'RGB' から 'Multiplane' を変更し、それを戻します。今フェーズがすることができます (図 3 b) を変更します。</li>
		<li>0 °、90 °、270 ° に出力の位相を設定します。経験的に動作するようにこれらの 3 つが見つかった位相空間をカバーする 3 つのフェーズを使用できますが (図 3 c)。</li>
		<li>68,500 Hz の周波数設定を選択します。</li>
		<li>最適な周波数を見つけることそれは周波数の検索範囲を変更する必要があります。'詳細'、'設定' をクリックします。変更、' Max。Freq(Hz)' 列の 0 には 70,000 Hz から 71,500 Hz の。これは、どのような周波数範囲が適切に調整できます。クリックして '校正を保存'、'Exit 校正' (図 3)。</li>
		<li>新しいキャリブレーションを有効にするために、別の周波数 (たとえば、189,150 Hz) に共鳴を切り替え、68,500 Hz 周波数設定 (図 3e) に切り替えた。</li>
		<li>35% に徐々 に振幅を変更します。「共鳴をロック」をクリックします。周波数がロックされている 'のロックを解除共鳴' (図 3 e) をクリックします。タグ レンズは今を使用する準備ができてです。</li>
		<li>F. 入力 x、y のスキャン範囲の調整、図 4 eで示すように、実際の位置に等しい位置推定に推定で使用されるパラメーターを変更して移動に XYZ のサンプルをスキャンする z 'scan' をクリック ボタン、粒子移動のレーザー スポット。粒子の位置レーザー フォーカスを介してスキャン位置推定ループ (図 S1) によって決定される推定のパーティクルの位置と一致します。推定位置と実際の位置 (図 4 d) との関係は、推定位置の画像 (図 4 階) から抽出できます。位置が同意しない場合は、位置推定ループ (図 S1) で使用されているレーザーの位置 (kc) の値を調整します。</li>
		<li>タグ レンズを揃える<ol>
			<li>タグ レンズ コント ローラーがオフの場合、ラスター スキャン タグ レンズをインストールする前に、インストールのタグ レンズは同じに見える必要があります後を撮影した (後述) 粒子画像です。次に、位置やタグ レンズ (図 4) の角度を調整する z nanopositioner の目的を移動することによって走査蛍光粒子 Z スタックを実行します。Z 方向、Z 位置 (図 4 d) の関数として粒子の XY 位置に変更がないとき達成される XY 平面に粒子画像のドリフトがないタグ レンズの位置を調整します。追跡システムはタグ レンズの配置後に使用する準備ができています。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SCMOS 粒子監視用カメラの設置<ol>
		<li>彼らは追跡されている間に粒子を可視化する sCMOS カメラを取り付けます。追跡システムのすべてのコンポーネントのインストールおよび最適化完了後にのみ、sCMOS をインストールします。</li></ol></li></ol>顕微鏡に固定の蛍光粒子のサンプルを読み込むし、客観的焦点ボリュームの 1 つの粒子をロックする追跡プログラムを実行します。その後、100 ミリメートル焦点距離のレンズをインストール (図 1: L8) と sCMOS。粒子の画像は最小かつ最も明るいスポットに焦点を当てているので、sCMOS の位置を調整します。
	
	

4 自由にナノ粒子を拡散リアルタイム 3 D トラッキング
<ol>
	<li>無料入れて、110 nm は、顕微鏡の粒子サンプルを移動します。</li>
	<li>レーザー、マイクロ位置決めコント ローラー、ピエゾ nanopositioner コント ローラー、タグ レンズ コント ローラーおよび EOD コント ローラーを入れます。オープン ループで圧電 nanopositioner を実行します。3.2 の手順に従ってタグ レンズ ソフトウェアを設定します。</li>
	<li>開き、追跡ソフトウェア (著者からの要求時に使用可能) を実行します。セクション 3 で発見された最適化された値に位置推定パラメーターを設定します。</li>
	<li>目的のフォーカス、coverslip に配置、蛍光発光フィルターを削除し、マイクロポジショナーの Z 位置の機能として信号強度を最大化する、coverslip からレーザーの反射を使用します。Coverslip を見つけた後、coverslip からソリューションにレーザーを集中する焦点位置 15 μ m を増加します。場所は、蛍光発光フィルターをバックアップします。</li>
	<li>積分制御定数を設定します。低値から開始して、パーティクルの位置読み出しの振動を見ることができるまで、ゆっくりと増やして、積分制御定数を設定できます。振動が観測されて、一度振動を引き起こす値の 80% に不可欠なコントロールの定数を設定します。典型的な値は、'積分ゲイン' XY の 0.012 と z '積分ゲイン' 0.004 前後になる予定します。</li>
	<li>'トラックしきい値' と 'トラック最小' 追跡しきい値を設定し、'検索'、' 自動トラック ' をクリックして追跡実験を開始します。終端トラッキングのしきい値がバック グラウンド レベルよりわずかに高い設定し、トラッキングをトリガーのしきい値は背景に比べて約 2 倍。ここでは、追跡のトリガーのしきい値は 3 kHz で、軌道を終了するためのしきい値は、1.5 kHz。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

3 D の単一粒子追跡方法の多くの品種は、近年浮上している堅牢なリアルタイムで追跡の簡単なセットアップと低い光子カウント料金で高速三次元拡散はまだ重要な生物学への応用を制限の挑戦問題。3 D DyPLoT メソッドは、いくつかの方法でこれらの課題をこのプロトコルのアドレスで説明します。まず、励起と検出経路はシンプルで堅牢な合わせを作る他の実装に比較して大幅簡素化します。第二に、移動レーザー スポットと位置推定アルゴリズムより安定したフィードバックを作るフィードバック ループの位置の正確な推定値を提供します。第三に、動的に移動レーザー スポットの効果的に大規模な検出範囲 (4 μ m x 1 x 1) は、高速移動粒子の追跡のためことができます。この大規模な検知エリアが重要な理由は、「圧電 nanopositioner 組み込みの応答時間を考慮することが重要です。高速圧電ステージは、1 kHz、順番に 1 さんの 1 ms、4 μ m2/s の拡散係数と 100 nm のナノ粒子への応答時間を制限する順序の共鳴回折麗のセンターから平均 90 nm に拡散します。負わないもの検出ボリューム。平均変位のみで、真にランダム...

高度なイメージング技術の出現は、分子レベルまでの細胞現象のより詳しい構造を表示するウィンドウを開いています。確率論的光再構成顕微鏡 (嵐)1,2,3、光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム)4,5,6,7 等、照明顕微鏡 (SIM)8,9,10,11, 構造および誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED)12,13、 14は、生きた細胞の機能と構造に前例のない詳細を提供する回折限界を越えるまで行っています。しかし、どのようにこれらのシステムの動作を完全理解構造情報と同様に、動的な情報が必要です。上記の超解像の方法は、空間分解能、時間分解能、ダイナミックなプロセスを検出できる時間の精度を制限することの間のトレードオフを含みます。空間精度と時間分解能の両方が RT 3 D SPT15,16,17,18,19,20を提供する方法 21,22,23,24,25,26,27,28,29。ここでは、我々 は区別を描く伝統的な 3 D SPT30と spt 上 RT-3D 伝統的な 3 D SPT が単に必要です (どちらか落射蛍光顕微鏡や共焦点の顕微鏡を使用して得ることができる 3次元画像データの時系列右の構成を与えられた)。伝統的な 3 D-SPT で粒子の座標は、軌道を作成する、各画像のスタックで粒子を検索し、連続ボリュームの場所を連結によってデータ収集後決定されます。これらのメソッドは、究極の時間分解能は体積のイメージング速度によって決定されます。共焦点顕微鏡は、これは簡単に数十秒秒のスケールで。落射蛍光メソッドは、前記軸位置情報を抽出することができますので、光路は操作され、時間の分解能は、カメラの露出や読み出し時間によって制限されます。これらの epifluorescent メソッドは、軸方向の情報を収集できる範囲に限られている、デザインと適応光学は 10 μ m またはより多くの31,32これらの範囲を拡張するフーリエ面相の最近の進歩のマスクが,33,34。
対照的に、RT 3 D SPT では、3 D 画像のスタックを取得し、事実の後の粒子を見つけることに依存しません。代わりに、単一ポイント探知器を介してリアルタイムの位置情報を抽出し、効果的にフィードバックが適用される高速圧電ステージを使用して対物レンズの焦点容積の粒子を「ロック」。これにより限られた粒子の位置の連続測定、だけでどのように多くの光子を収集することができます。また、このメソッドは、長い範囲に移動すると、粒子のスペクトルの尋問をできます。RT 3 D SPT 有効ナノスケール物質、粒子は継続的に検出、大型レーザー加工力を必要とせずリアルタイムまたは光で測定前記のフォース フリー光学トラップに似ている作品を強制します。考えると RT 3 D SPT 高速拡散オブジェクト (最大 20 μ m2/s)25,29低光子カウント レート20,29、3 つの次元での継続的な尋問のための手段を提供します 35、それの細胞内輸送、ligand 受容器のバインディング、および単一粒子の細胞のダイナミクスなど高速または一時的な生物学的プロセスにウィンドウを提供する必要があります。しかし、このポイントに RT 3 D SPT のアプリケーションはこの技術を進めるために働くグループの一握りに制限されています。
1 つの障壁は、RT 3 D SPT メソッドは、変化に必要な光のレイアウトの複雑さです。ほとんどのメソッドは、光フィードバックは圧電ステージによって提供されます。粒子は小さな動きの X、Y、または Z、シングル ポイント探知器からの読み出しエラー関数に変換され、供給として圧電 nanopositioner を高速で回す移動粒子の運動を効果的に対抗するためにサンプル対物レンズの相対的な場所にそれをロックします。X で小の位置の動きを測定する Y、および Z、複数検出器 (4 または 5 の実装に応じて)15,18,21または複数の励起スポット (2-4、低いどの場合も適用できます、ロックイン アンプを使用して、X を抽出して Y 位置回転レーザー スポット)25,28が適用されます。これら複数の検出、発光スポットの重複、システムの配置および保守が困難。
ここで、3 D DyPLoT29と呼ばれる簡略化された光学設計と高速ターゲット ロックの 3 D SPT 法を提案する.3 D DyPLoT は、高レート (50 kHz XY ・ Z 70 kHz) で客観的焦点音量を介し集光レーザー スポットを動的に移動する 2 D EOD とタグ レンズ36,37,38を使用します。レーザー焦点位置と光子の到着時間を組み合わせることにより、低光子カウント レートでも急速に得られる粒子の 3 D 位置。騎士のツアー パターン39 X Y 平面に 1 x 1 μ m の正方形のサイズでの 2D EOD ドライブのレーザーの焦点とタグ レンズは 2-4 μ m の範囲で軸方向にレーザーの焦点を移動します。3 D 粒子の位置は、最適化された位置推定アルゴリズム29,40 3 D で取得されます。3 D 動的に動いてレーザー スポット、フォトンカウンティング アバランシェ フォト ダイオード (APD)、実時間粒子位置の計算、圧電ステージ フィードバック、およびデータ記録からのコントロールは、フィールド プログラマブル ゲート アレイ (FPGA) で行われます。このプロトコルでは、ステップバイ ステップで、固定粒子を用いたキャリブレーション光学アライメントを含む 3 D DyPLoT 顕微鏡を構築する方法について説明し、最後に無料の粒子追跡。例として 110 nm 蛍光ビーズで追跡された継続的に水の分を一度に。
記載方法は、それがウイルス、ナノ粒子、エンドソームなど小胞など、低光レベルでの高速移動の蛍光プローブを継続的に監視する望まれる任意のアプリケーションに最適です。以前の方法と対照をなして単一励起とアラインメントや保守を簡単に作る、単一検出経路のみがあります。また、大規模な検知エリアはこの顕微鏡を簡単に拾う (10 kHz) まで低信号レベルで追跡する機能は、このメソッドは低光アプリケーション29に最適すぐに粒子を拡散できます。

<table><tbody><tr><td>2D電気光学ディフレクター&nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 必要な</td></tr><tr><td>EOD用電源</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>FPGA出力をEODタグ用の高電圧に変換します</td></tr><tr><td>&nbsp;レンズ</td><td>TAG 光学</td><td>TAG 2.0</td><td>軸方向に沿ってレーザーを偏向するために使用されます</td></tr><tr><td>XY圧電ナノポジショナー</td><td>MadCity Labs</td><td>ナノPDQ275HS</td><td>サンプルを移動させて粒子を対物レンズの焦点ボリュームに固定するために使用されます。</td></tr><tr><td>Z圧電ナノポジトナー</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>拡散粒子に追従するように対物レンズを移動させるのに使用</td></tr><tr><td>マイクロポジショナー</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>サンプルの粗い位置決めと評価に使用</td></tr><tr><td></td><td>ツァイス</td><td>PlanApo</td><td>最高の感度を得るためには高い開口数が必要 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOSカメラ</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>粒子の位置を監視するために使用</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>ダークカウントを少なくし、有益な</td></tr><tr><td>フィールドプログラマブルゲートアレイ</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking 励起レーザー</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr>ピン<tr><td>ホール</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson 偏光子</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>半波長板</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>蛍光発光フィルター</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 ビームスプリッター</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm蛍光ナノ粒子</td><td>前髪研究所</td><td>FC02F / 9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm蛍光ナノ粒子</td><td>前髪研究所</td><td>FC02F / 10617</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>パワーメーター</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>DCC1545M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイリスソー</td><td>ラブ</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td>マ<td>ッドシティラボRM21</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リアルタイム 3 d 単一粒子追跡のためのプロトコル

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

リアルタイム三次元単一粒子 (RT-3D-SPT) を追跡するセルラ システムにおける高速、3 D プロセスに光を当てる可能性があります。各種 RT 3 D SPT は、近年に前方を置かれているがユーザーは、課題のままに低い光子カウント レートでの粒子の拡散 3 D 高速を追跡します。さらに、RT 3 D SPT セットアップが一般に複雑で実装が困難生物学的問題への広範な応用を制限します。このプロトコルは、(10 kHz) まで低光子カウント レートで 3 D ダイナミック フォトン局在追跡 (3 D DyPLoT)、高拡散速度 (最大 20 μ m2/s) の粒子を追跡する名前付き RT 3 D SPT システムを提案します。3 D DyPLoT が 2次元電気光学偏向器 (2 D EOD) を採用し、単一焦点を当てたドライブに可変音響グラデーション (タグ) レンズ レーザー 3 D で動的にスポット。最適化された位置推定アルゴリズムを組み合わせると、3 D DyPLoT を高いトラッキング スピードと高い位置推定精度単一粒子にロックできます。単一励起と単一検出パス レイアウト、3 D DyPLoT は堅牢で簡単にセットアップです。このプロトコルでは、3 D DyPLoT ステップ バイ ステップを構築する方法について説明します。まず、光のレイアウトが記述されます。次に、システムは校正、走査線 190 nm の蛍光ビーズを圧電 nanopositioner を最適化します。最後に、リアルタイム 3 D の追跡能力を示すためには、110 nm の蛍光ビーズが水で追跡されます。

固定粒子 (図 4) をスキャンと自由に拡散 110 nm 蛍光粒子追跡 (図 5) 上記のプロトコルを次に行った。同時にパーティクルの計算をする各ポイントでのスキャン位置を推定しながら圧電 nanopositioner と箱の光子を移動することによって粒子のスキャンを行ったでも強度 (図 4 a) の正方形で示し、推定位置 x で 1 × 1 × 2 μ m の範囲にわたって粒子の実際の位置との線形関係を示すスキャン画像 y、および z の方向 (図 4 b-f)。
リアルタイム追跡を示すためには、110 nm 蛍光粒子は水の 3 D DyPLoT...

建設と操業追跡ナノスケール蛍光ことができるリアルタイム 3 D 単一粒子追跡顕微鏡プローブ高拡散速度と低い光子カウント率をこのプロトコルの詳細

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

このプロトコルの全体的な目標は、リアルタイムの3D単粒子追跡顕微鏡を実装することです。この手法の主な利点は、単一の拡散ナノスケールの物体を光子制限された時間分解能で連続的に監視できることです。この手法は、感染プロセス全体を通じて単一のウイルス粒子を追跡するなど、ウイルス学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。光学テーブルの上に装置を準備します。このセットアップは、キャリブレーションの準備ができています。主要コンポーネントには、488ナノメートルの固体レーザー、ビームの経路に沿った2つの電気光学デフレクター、調整可能な音響勾配レンズ、マイクロおよびナノポジショナーを備えたサンプルステージが含まれます。このセットアップの概略図では、追加の詳細について説明します。これがサンプルステージへのレーザービーム経路です。電気光学デフレクターと調整可能な音響レンズは、ビームの経路に沿っています。これらのデバイスは、サンプルステージでレーザースポットを動的に駆動します。サンプルからの光子は、アバランシェフォトダイオードによってカウントされます。カメラがパーティクルの位置を監視します。サンプルの位置は、マイクロコントローラーとナノコントローラーを使用して設定します。フィールドプログラマブルゲートアレイは、レーザースポット、リアルタイムの粒子位置計算、ステージフィードバック、およびフォトンカウンティングを制御します。2つのサンプルを準備する必要があります。1つ目は、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した190ナノメートルの蛍光ビーズが必要です。カバースリップを使用して、固定粒子サンプルを調製します。400マイクロリットルのビーズ溶液をカバースリップに置きます。次に、自由に移動する粒子サンプルを作成します。水で希釈した110ナノメートルの蛍光ビーズが必要です。400マイクロリットルの溶液をカバースリップに載せて、自由に移動する粒子サンプルを作成します。固定された粒子サンプルを顕微鏡に持って行き、取り付けます。サンプルはXYナノポジショナー上にあります。レーザー、光検出器、ビームラインエレメントのコントローラー、ポジショナーのスイッチを入れます。Piezo nanoポジショナーを閉ループで実行します。次に、光検出器の手前から蛍光発光フィルターを取り外します。次に、マイクロポジショナーでサンプルのz位置を変化させます。位置が変化するため、光検出器を使用してレーザーの反射強度を監視します。対物レンズの焦点面を特定するために、強度を最大化します。サンプルを焦点面に置いた状態で、蛍光発光フィルターを交換します。次に、コンピューター制御ソフトウェアで作業します。カスタムソフトウェアを使用して、サンプルをラスタースキャンします。まず、スキャン範囲を大きく設定し、開始と終了の差を設定します。ここでは、Y軸が10マイクロメートル、X軸が10マイクロメートルの範囲となっています。また、各方向に大きなステップサイズを設定します。ここでは、200ナノメートル。両方の Z フィールドを、以前に特定した焦点面の位置に設定します。スキャンを押すと、ラスター スキャンが開始されます。スキャンを開始します。このソフトウェアは、夜間のツアーで電気光学デフレクターを駆動し、光検出器からカウントを収集し、ナノポジショナーを駆動し、位置計算を実行します。スキャンは、プラタ蛍光を通じてソフトウェアで識別可能な粒子を見つけます。スキャンの各サイトについて、ソフトウェアは、エレクトロオブジェクトデフレクタースキャンの中心に対するXおよびYの粒子位置の推定値も決定します。粒子を見つけたら、その周りのスキャン範囲をXとYで2マイクロメートルに縮小し、また、両方のステップサイズを100ナノメートルに減らします。Z方向に2マイクロメートルのスキャン範囲を追加して、蛍光フォーカスを囲みます。Z ステップ サイズを 200 ナノメートルに設定します。3Dラスタースキャンを開始して、蛍光フォーカスを見つけます。スキャンから生成されたデータは、調整可能な音響勾配レンズの電源がオンになる前の焦点面を示しています。制御ソフトウェア内の調整可能な音響レンズ設定の操作に進みます。まず、[接続]をクリックし、次に電源をオンにします。パルスとゲーティング制御セクションに移動し、出力トリガーモードをRGBからマルチプレーンに変更します。次に、出力位相を変更できるようにRGBに戻します。スライダーを使用して、出力フェーズを 0 度、90 度、270 度の間で設定します。次に、周波数制御セクションに移動します。そこで、68、500ヘルツの共振周波数を選択します。画面の上部に移動し、[詳細設定]をクリックします。次に、[設定] タブを選択します。新しい画面で、ゼロ列の最大頻度を見つけます。調整して、周波数検索範囲を変更します。[編集]をクリックし、キャリブレーションを保存してから、キャリブレーションを終了します。周波数コントロールに戻り、共振周波数を変更します。すぐに 68, 500 ヘルツに戻し、キャリブレーションを有効にします。で ampリチュードコントロールセクションで、スライダーを使用してゆっくりとリチュードを35%に上げます この後、ロックレゾナンスをクリックします。周波数がロックされている場合は、[レゾナンスのロックを解除]をクリックします。ラスタースキャンソフトウェアに戻ります。XとYの粒子を中心とする2マイクロメートルのスキャン範囲を入力し、100ナノメートルのステップサイズを使用します。粒子をZ軸の4マイクロメートルの範囲の中心に置き、ステップサイズは200ナノメートルです。その結果生じるスキャン画像では、粒子を表す照明領域の幅は約1マイクロメートルです。これに基づいて、XY スケール パラメーターを調整して、X と Y の推定位置が負の 0.5 マイクロメートルから 0.5 マイクロメートルの範囲になるようにします。Zスケールで同様の手順を行った後、ナノポジショナーをゼロ位置に設定します。続行する前に、ナノポジショナーの電源を切ってください。固定された粒子サンプルを、自由に動く粒子サンプルに置き換えます。次に、すべての機器がオンになっていることを確認します。Piezo nanoポジショナーをオープンループで実行します。コンピューターで、前と同じように調整可能な音響勾配レンズソフトウェアを設定します。蛍光発光フィルターを光検出器への経路から取り外します。サンプルのZ位置を変化させ、カバースリップからレーザー反射の強度を最大化して、焦点面を見つけます。焦点面を見つけたら、フォーカス位置を溶液の15マイクロメートルに増やします。蛍光発光フィルターを交換してください。カスタム追跡ソフトウェアを開きます。位置推定パラメーターを、最適化中に検出された値に設定します。次に、ナノポジショナーの応答速度を決定する積分制御定数を設定します。X 定数から開始します。低い値を入力し、ゆっくりと増やします。粒子位置の読み出しで振動が始まるときは、制御定数の値に注意してください。積分制御定数を、発振開始時の値の約70%に減らします。制御定数 Y と Z を使用して手順を繰り返します。トリガーを設定して、トラックのしきい値の追跡を3キロヘルツに開始します。トラックの最小値(トリガーからトラッキングの終了まで)を1.5キロヘルツに設定します。テストを開始するには、[検索] をクリックし、[自動追跡] をクリックします。この動画は、3次元の動的光子局在追跡顕微鏡を用いて、水中の110ナノメートルの蛍光ナノ粒子の拡散運動を追跡した結果を示しています。ナノポジショナーの位置読み出しを使用して測定された粒子の位置は、3D軸上に表示されます。挿入図は、科学的な海苔カメラの読み取りです。これは、粒子がトラッキングシステムによって焦点ボリュームに保持され、ロックされていることを示しています。粒子は追跡され、その位置は2分以上記録されました。この手法を習得すると、システムが適切に位置合わせされ、キャリブレーションパラメータが設定されていれば、50分以内に行うことができます。開発後、この技術は、薬物送達の分野の研究者が細胞貨物の内在化と輸送の経路を探求するのに役立ちます。このビデオを見れば、ゼロタイムの3D単粒子追跡顕微鏡の操作方法について十分に理解できるはずです。

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

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細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

四ビュースプリッターと高速度カメラに基づいた三次元粒子追跡速度測定（3D-PTV）システムは、ここに記載されています。技術は、下流≈7,000レイノルズ数Reで10直径の近傍に円管からの噴流に適用されます。...

ジェット流の場合：乱流のアプリケーションのための3次元粒子追跡流速

流体中を「泳ぐ」ことができ、その3D軌道を決定することができる触媒活性ヤヌスコロイドを準備する方法が提示されています。...

触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

この原稿は、移動粒子が画像分析によって追跡される寝床積堆積物輸送実験の伝導のためのプロトコールを提示する。実験施設、実行実現とデータ処理の手順、そして最後にいくつかの概念実証結果をここに示します。...

ベッド負荷実験における画像ベースのラグランジュ粒子トラッキング

ここでは、単一粒子の拡散係数、蛍光顕微鏡で検出する単一粒子の運動とクラスター サイズの種類の定量評価ができる画像解析を追跡するためのプロトコルを提案する.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。...

温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御

このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。...

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

多くの天然変性タンパク質は、多くの細胞プロセスにとって重要な行動である、非常に動的な生体分子凝縮物の形成に関与することが示されています。ここでは、生細胞内の生体分子凝縮物中でタンパク質が互いに相互作用するダイナミクスを定量化するための1分子イメージングベースの方法を紹介します。...

生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

学ぶリアルタイム3D単一粒子追跡顕微鏡の構築と操作方法。電気光学偏向器と音響勾配レンズを用いて、ナノスケール蛍光プローブや単一ウイルス粒子の動態を連続的に観測できます。ウイルス学における感染過程の解明に有用です。

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

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