Name: 自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぶ自動マイクロ流体デバイスを用いたCandida albicansバイオフィルム形成のリアルタイム可視化法。抗菌薬の有効性評価や遺伝子変異体の解析に応用でき、新規抗真菌治療薬の開発に貢献します。

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我々 は、バイオ フィルムの試金の役に立つ議論のノビレ ラボのすべてのメンバーを感謝します。この調査は、健康 (NIH) のグラント R21 AI125801 (C.J.N.) に国立衛生研究所によってサポートされました。地下鉄は、メキシコとアメリカ合衆国 (UC mexus フライ) と国立ナシオナル デ サイエンス y Technologia (CONACYT) カリフォルニア大学の大学から博士課程フェローシップによって支えられました。

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クラリッサ ・ j ・ ノビレは阻害剤とC. albicansのバイオ フィルムの診断の開発会社 BioSynesis 社の創始者です。

ここで説明したカスタマイズ可能なマイクロ流体バイオ フィルム アッセイでのバイオ フィルム形成の可視化は、固定レート層流および一定した温度に露出されたときに単一セルのレベルでリアルタイム。野生型および変異株のバイオ フィルムの研究開発に強力な手段を提供しています, 生理学的条件を模倣条件下でバイオ フィルムに対する抗菌剤治療の効果臨床設定で.異なり、ほとんどの in vitroバイオ フィルム アッセイ、このメソッドは、リアルタイムの開発バイオ フィルムの検討を形成。
このメソッドは、24 サンプルまでことができるバイオ フィルム形成を評価するために同時に実行高スループット方法で使用することができます。メソッドは、通常バイオ フィルム開発のために必要な遺伝子を識別するために突然変異体のライブラリの遺伝子スクリーニングを実施するも使用でき、化合物ライブラリー画面に関心の抗菌物質のバイオ フィルムに対する有効性を評価するために使用することができます。このマイクロ流体デバイスの将来のアプリケーションは、このような画面を含めることを期待しています。我々 は、しかし、特定の...

しかし、それはまた、日和見主義の病原体、表面的な重症真菌感染症1,2を引き起こすことができる、カンジダは人間の微生物叢の共生メンバーです。C. albicansの主な病原性の特徴は弾力性のあるフォームにその能力と薬剤耐性のバイオ フィルム細胞のコミュニティ、表面に付着、細胞外マトリックス材料1,3で囲まれます。C. albicansのバイオ フィルムの構造高度、種類の細胞のいくつかの層を含む (ラウンド出芽酵母フォームのセル、オーバル偽セル、および尿細管の菌糸細胞)4。C. albicansのバイオ フィルムの開発で始まる画面で、これらの細胞の増殖が続く (シーディングにバイオ フィルム)、表面に丸い酵母型細胞の付着と未熟なバイオ フィルムの成熟に構造化し、完全に形成されたバイオ フィルム細胞外マトリックス材料4によって囲まれます。成熟したバイオ フィルムは主に、バイオ4に安定したアーキテクチャを提供する密な相互接続ネットワークを形成する細長い菌糸細胞で構成されます。バイオ フィルムのライフ サイクルでは、出芽酵母細胞成熟したバイオ フィルムから分散ぐるぐる播種性感染症を引き起こすまたは他サイト4,5で新しいバイオ フィルムをシードに体の他の地域への旅行があります。C. アルビカンスは生物の表面、粘膜面など、ホスト組織全体とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの非生物的表面にバイオ フィルムを形成できます。バイオ フィルムの反抗的な性質上、根絶することは困難、唯一の効果的な治療戦略は、多くの場合感染したデバイス4の除去。つまり、臨床現場で観察されたと同様の条件下でのバイオ フィルム形成を調査することが重要。
いくつか重要な生体内で動物のモデルC. albicansバイオ フィルム形成6,7,8; を研究するために使用しかし、これらの研究は高価、時間のかかることができます、系統と同時にテストすることができます抗菌剤の数によって制限されます。培養バイオ フィルムの試金、その一方で、抗真菌化合物および突然変異系統の高速、高スループットの評価を可能にする、はるかに費用対効果と運ばれるバイオ フィルム アッセイより倫理的な動物のモデル9、 10、11,12,13,14。ここで我々 が開発し、カスタマイズ可能なマイクロ流体デバイス14,15を使用して層流の下で一時的にバイオ フィルム形成を観察するように最適化の in vitroアッセイについて述べる。アッセイは、初期接着性のステップ、細胞の増殖、成熟バイオ フィルム細胞分散などのバイオ フィルム形成の各段階の可視化が可能です。試金はまたバイオ フィルムの開発中の細胞形態変化を視覚化するのに役立ちます。
マイクロタイター プレート、バイオ フィルム アッセイ培養、高スループット中は、制御フローの条件を許可しないため通常利用されています。伝統的な層流セル系バイオ フィルム形成の制御の流れの条件の継続的な評価を可能にするが、設定し、ダイナミック レンジ コントロールおよびスループットが制限する傾向があるに時間がかかることが多い。活用するマイクロ流体デバイス組み込み流室高スループット プレート (48 井戸を含む) を組み合わせることによりこれら制限を克服、高再現性、汎用性とカスタマイズ可能です。
ここでは、野生型C. albicansのバイオ フィルム形成を評価するために市販の自動マイクロ流体デバイスを使用するためのプロトコルについて述べるひずみ、バイオ フィルム、およびバイオ フィルムの発育に及ぼす知られている抗真菌剤バイオ フィルムを持っている以前報告された変異株 (bcr1Δ/Δ ・ Δ/Δ efg1 ) が 2 つの層の欠陥の in vitroとin vivoの16,17,18。記述のプロトコルは、バイオ フィルムのバイオ フィルム形成を阻害することで抗菌薬の有効性をテストするのには、ライブラリの突然変異体をスクリーニングによって通常バイオ フィルム開発に必要な遺伝子を識別するために使用できます。

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>生細胞解析用自動マイクロ流体装置</td></tr><tr><td>48ウェルプレート 0-20 dyne</td><td>フラックス</td><td>910-0047</td><td>マイクロ流体プレート</td></tr><tr><td>モンタージュソフトウェア</td><td>Fluxion</td><td>Version 7.8.4.0</td><td>可視化解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>酵母抽出物</td><td>基準</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース (D-グルコース)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>栄養ブロス</td><td>基準</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-マンニトール</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>基準</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>コーニング</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>滅菌接種ループ</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>透明な蓋付きペトリ皿</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てキュベット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>レンズ</td><td>ペーパーVWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートおよびキュベット分光光度計</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベータ</td>ー<td>エッペンドルフ</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

カンジダは、院内敗血症症例の約 15% を引き起こす人間の最も一般的な真菌病原体です。C. albicansの主な病原性属性は、そのバイオ フィルム フォームする能力、生物と非生物の表面に細胞の構造化されたコミュニティです。C. albicansのバイオ フィルムは、粘膜層などのホスト組織とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの医療機器を形成できます。物理と化学の摂動に強く、種子に貯水池播種性感染症として機能することができますので、バイオ フィルムは重要な臨床的課題を提起します。各種の in vitroアッセイは、 C. albicansのバイオ フィルム形成、マイクロタイター プレート アッセイ、乾燥重量測定、セル実行可能性の試金、共焦点走査型レーザー顕微鏡などの研究に利用されています。これらの試金のすべては、特定の時点でのバイオ フィルム形成の評価、単一エンドポイント アッセイです。ここでは、層流条件下で自動マイクロ流体デバイスを用いた実時間でのバイオ フィルムの形成を研究するためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、血管カテーテルにおいて直面する問題など、ホストのそれらを模倣するカスタマイズ可能な条件を使用して、時間をかけて開発するバイオ、バイオ フィルム形成の観測できます。このプロトコルは、遺伝的変異のバイオ フィルムの欠陥だけでなく、バイオ フィルムにおけるリアルタイム抗菌剤の抑制効果を評価するために使用できます。

ここで野生型を使用して記述されているマイクロ流体バイオ フィルム アッセイを行った 2 つのメディア条件 (RPMI 1640 とクモ メディア) C. albicans歪み、知られている抗真菌剤アムホテリシン B (16 μ G/ml) RPMI の存在下で野生型株バイオ フィルム形成 ( efg1 Δ/Δbcr1Δ/Δ ・ スパイダー メディアの欠陥を持っている 2 つの突然変異体系統が以前報告しました。
ビデオ 1 では、RPMI 1640 中規模およびバイオ フィルム形成に及ぼす抗真菌薬、アムホテリシン B、野生型バイオ フィルムの開発を示しています。野生型の条件の下でいくつかのセルは、チャネルに強く付着、セル形成時間の経過として菌糸と厚いバイオ フィルム間菌糸をインターカ レートで観察することができます酵母細胞。マイクロ流体実験の終わりには、野生型バイオ フィルムは完全に表示チャンネルを塗...

このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ フィルム形成を視覚化するカスタマイズ可能な自動化されたマイクロ流体デバイスの使用について説明します。

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

このプロトコルの全体的な目標は、宿主の生理学的条件下でカンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成をリアルタイムで視覚化することです。この方法により、バイオフィルムの形成が進行する様子をリアルタイムで観察することができ、抗菌剤の有効性試験や遺伝子変異体の評価に活用することができます。この手法は、バイオフィルムに対する活性の潜在的な治療法をハイスループットでスクリーニングするために使用でき、その有効性を測定、視覚化、および現在の治療と比較することができます。この技術の主な利点は、研究者が関心を持ついくつかの異なる条件下でバイオフィルム形成をアッセイするために使用できることです。この方法は、カンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成を研究するために特別に開発されましたが、他の真菌種や細菌など、他のバイオフィルム形成微生物にも適用できます。まず、酵母抽出物ペプトンデキストロースまたはYPD培地寒天培地に播種した細胞から、標準的な微生物学的手法に従って、異なるC.albicans株の単一コロニー培養物を調製します。次に、コントローラー、2つの電源ユニット、顕微鏡、カメラ、およびシステムに接続されているコンピューターを含むマイクロ流体システムの電源を入れます。コンピュータがロードされたら、システムを制御するソフトウェアを開きます。使用中のプレートのバーコード番号を見つけ、ソフトウェアからプロンプトが表示されたら番号を入力します。次に、制御モジュールで、マイクロ流体システムの温度を摂氏37度に設定します。次に、インレットウェルI1、I7、I13、およびI19をクリックし、界面プレートチューブに滅菌空気を5分間流して、結露を取り除きます。すべての結露が蒸発したら、48ウェル0-20ダインマイクロ流体プレートを顕微鏡ステージに置きます。12時間のバイオフィルム形成実験では、まず600マイクロリットルの予熱培地をインレットウェルに加えます。洗浄したインターフェースプレートを48ウェルマイクロ流体プレートの上にゆっくりと下げます。次に、チューブがインレットウェルとアウトレットウェルの上部に配置され、所定の位置にロックされるまで、インターフェースプレートをわずかに左にスライドさせます。ソフトウェアのせん断制御セクションで、フローモードを一定に設定し、最大せん断を1ダインセンチメートルの2乗に設定します。次に、メディア付きのインレットウェルをクリックして、チャネルをプライミングするために、インレットウェルからアウトレットウェルへのメディアの流れを開始します。5分間の流れの後、ソフトウェアのウェルプレートコントロールセクションにある停止ボタンをクリックします。次に、インターフェースプレートを取り外し、マイクロ流体プレートウェルを観察します。出口ウェルには、わずかなメディアの滴だけが見えるはずです。野生型および変異型のC.albicans株をテストするには、クモ培地中の野生型SC5314細胞培養物を50マイクロリットルを2つの出口ウェルに添加し、スパイダー培地中のbcr1変異体を2つの出口ウェルに添加し、スパイダー培地中のEFG1変異体を2つの出口ウェルに添加します。インターフェースプレートをマイクロ流体プレートに戻し、蓋を所定の位置にロックします。ソフトウェアのせん断制御セクションに戻り、フローモードを一定に設定し、最大せん断を2ダインセンチメートルの2乗に設定します。セルのある出口ウェルをクリックして、出口から入口ウェルへの培地の流れを開始し、C.albicansの播種を開始します。3秒後、ウェルプレートコントロールセクションの停止ボタンをクリックして、細胞がインレットウェルに入るのを防ぎます。細胞を最初の細胞付着のために、視聴チャネルで10〜20分間流れずに静止させます。イメージングモジュールウィンドウで、多次元集録モジュールを開き、左側のメニューのステージタブをクリックします。ステージセクションで、48ウェル0-20ダインマイクロ流体プレートのマスターステージリストをロードします。次に、サンプルリロード調整を開き、ステージを絶対位置モジュールに移動します。サンプルの再読み込み調整モジュールで、ライブボタンを押すと、十字線付きの画像プレビューが表示されます。ジョイスティックを使用して、チャンネル4の表示に隣接する矢印の先端がソフトウェアの十字線と揃うようにウェルプレートを配置します。次に、絶対位置メニューへの移動ステージに移動し、原点設定ボタンを押します。次に、サンプルリロード調整モジュールに戻り、左側のメニューの最初の基準点セクションをクリックして、48ウェル0-20ダインマイクロ流体プレートのファイルをロードします。多次元取得モジュールのステージセクションで、ステージ位置22.2をダブルクリックして、顕微鏡の視聴ステージとカメラの焦点を矢印マーカーに近づけます。次に、ジョイスティックを使用して、ビューイングチャネル22に隣接する矢印の先端が十字線と揃うようにウェルプレートを配置します。多次元集録モジュールの Y 座標を の Y 位置にコピーします。2 サンプルリロード調整モジュールの Update Reference Points タブにあります。最後に、サンプルリロード調整モジュールの「Update stage positions」タブで、「Apply to MDA stage list」をクリックします。イメージングモジュールウィンドウで、多次元取得モジュールを使用し、左側のメニューの[保存]タブをクリックします。次に、実験のファイル名と、取得した画像をコンピューターに保存するフォルダーを選択します。次に、タイムラプスタブをクリックして、各画像の間に5分で合計145枚の画像を取得するように設定します。次に、[波長]タブで、波長の数を1に設定し、50%明視野と50%カメラで12〜20ミリ秒の露光時間でキャプチャします。ゲインを 0.6 に、デジタイザを 20 ミリヘルツに設定します。付属のテキストプロトコルで説明されているようにフォーカスを設定した後、取得を選択して、すべてのサブステージの接着細胞のプレフラッシュ画像のキャプチャを開始します。せん断制御セクションで、フローモードを一定に設定し、最大せん断を1ダインセンチメートルの2乗に設定します。次に、インレットウェルをクリックして、インレットウェルからアウトレットウェルへの培地の流れを開始し、接着していないセルを除去します。5分後、ウェルプレートコントロールセクションの停止ボタンをクリックします。2 回目の画像を取得できるようにし、せん断制御セクションで、最大せん断流量を 0.5 dyne per cm の 2 乗に調整し、変更を確認します。イメージングモジュールウィンドウで、[分析ツール]タブを選択し、ドロップダウンメニューから[多次元データのレビュー]をクリックします。次に、[ベースファイルの選択]をクリックします。これにより、多次元データセットユーティリティウィンドウが開きます。次に、ディレクトリの選択ボタンをクリックして、実験の保存に使用されたフォルダを選択します。データ セットの一覧で、実験ファイル ログを選択します。ログが読み込まれたら、表示ボタンをクリックします。左側の波長メニューのオプションをクリックして波長を選択し、ドロップダウンメニューから表示するステージ位置を選択します。モジュールの上部にある番号からロードする画像を選択するには、画像番号を右クリックします。次に、タイムラプスビデオを作成するためにすべての画像を選択します。選択した画像は、新しいウィンドウでビデオとして開きます。イメージングモジュールウィンドウのファイルタブをクリックし、ドロップダウンメニューから[名前を付けて保存]を選択します。結果のビデオをデフォルトのファイル形式で保存します。最後に、保存したビデオファイルを開いて画像 J.In 画像Jにロードし、[ファイル]タブをクリックして、[名前を付けて保存]をクリックします。ドロップダウンメニューから[AVI]を選択し、10フレーム/秒に設定されたJPEG変換を使用してファイルをAVIファイルに変換します。RPMI 1640培地の野生型条件下では、いくつかの細胞がチャネルに強く付着していました。それらは菌糸を形成し、挿入する菌糸と酵母細胞で厚いバイオフィルムを観察できます。マイクロ流体実験の終盤では、野生型のバイオフィルムがこの視聴チャネルを完全に埋め尽くします。しかし、アムホテリシンBの存在は、バイオフィルム形成の減少に顕著な影響を及ぼします。具体的には、細胞の接着が減少し、培地のせん断流とともにいくつかの細胞が流れ去るのが見られます。野生型のコントロール細胞は、今回はクモ培地で増殖し、RPMIで増殖したばかりのものと同様のバイオフィルムを形成しました。また、この培地では、2つのバイオフィルム欠損変異体が増殖しています。どちらの株も、対照と比較してバイオフィルム形成が大幅に減少しています。この細胞集団では、付着した細胞は菌糸を形成せず、結果として生じるバイオフィルムは深刻な欠陥があります。この他の株は、バイオフィルムの形成とチャネルへの接着能力の両方に欠陥があります。一度マスターすれば、この実験は1時間未満でセットアップできます。この方法を使用すると、初期の細胞接着、バイオフィルムの成熟、細胞の分散など、バイオフィルム形成のさまざまな側面について多くのことを学ぶことができます。このプロトコルは高度にカスタマイズ可能で、汎用性があります。これは、王国間で異なる微生物種を評価するように調整できます。流速、温度、インキュベーション時間、培地は、混合種のバイオフィルムの研究にも使用できます。このマイクロ流体バイオフィルムアッセイは、in vivo動物試験の前に活用するin vitroアッセイとして強くお勧めします。私たちの経験では、このアッセイの結果は、既存のin vivoバイオフィルムアッセイと非常によく相関しています。

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アセンブリ操作について述べる、流下しながらリアルタイムで画像菌バイオ フィルム形成に設計フロー装置のクリーニングします。我々...

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

カンジダ・アルビカンスのバイオフィルムの内部特徴を見て定量化するために、屈折率マッチングによって明らかにされた固定無傷の標本を用意します。そして、光学断面顕微鏡を用いれば、バイオフィルムの厚みを完全にもった3次元画像データを得ることができる。...

カンディダ・アルビカンスバイオフィルムの明確化とイメージング

学ぶ自動マイクロ流体デバイスを用いたCandida albicansバイオフィルム形成のリアルタイム可視化法。抗菌薬の有効性評価や遺伝子変異体の解析に応用でき、新規抗真菌治療薬の開発に貢献します。

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

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自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

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