自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

このプロトコルの全体的な目標は、宿主の生理学的条件下でカンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成をリアルタイムで視覚化することです。この方法により、バイオフィルムの形成が進行する様子をリアルタイムで観察することができ、抗菌剤の有効性試験や遺伝子変異体の評価に活用することができます。この手法は、バイオフィルムに対する活性の潜在的な治療法をハイスループットでスクリーニングするために使用でき、その有効性を測定、視覚化、および現在の治療と比較することができます。

この技術の主な利点は、研究者が関心を持ついくつかの異なる条件下でバイオフィルム形成をアッセイするために使用できることです。この方法は、カンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成を研究するために特別に開発されましたが、他の真菌種や細菌など、他のバイオフィルム形成微生物にも適用できます。まず、酵母抽出物ペプトンデキストロースまたはYPD培地寒天培地に播種した細胞から、標準的な微生物学的手法に従って、異なるC.albicans株の単一コロニー培養物を調製します。

次に、コントローラー、2つの電源ユニット、顕微鏡、カメラ、およびシステムに接続されているコンピューターを含むマイクロ流体システムの電源を入れます。コンピュータがロードされたら、システムを制御するソフトウェアを開きます。使用中のプレートのバーコード番号を見つけ、ソフトウェアからプロンプトが表示されたら番号を入力します。

次に、制御モジュールで、マイクロ流体システムの温度を摂氏37度に設定します。次に、インレットウェルI1、I7、I13、およびI19をクリックし、界面プレートチューブに滅菌空気を5分間流して、結露を取り除きます。すべての結露が蒸発したら、48ウェル0-20ダインマイクロ流体プレートを顕微鏡ステージに置きます。

12時間のバイオフィルム形成実験では、まず600マイクロリットルの予熱培地をインレットウェルに加えます。洗浄したインターフェースプレートを48ウェルマイクロ流体プレートの上にゆっくりと下げます。次に、チューブがインレットウェルとアウトレットウェルの上部に配置され、所定の位置にロックされるまで、インターフェースプレートをわずかに左にスライドさせます。

ソフトウェアのせん断制御セクションで、フローモードを一定に設定し、最大せん断を1ダインセンチメートルの2乗に設定します。次に、メディア付きのインレットウェルをクリックして、チャネルをプライミングするために、インレットウェルからアウトレットウェルへのメディアの流れを開始します。5分間の流れの後、ソフトウェアのウェルプレートコントロールセクションにある停止ボタンをクリックします。

次に、インターフェースプレートを取り外し、マイクロ流体プレートウェルを観察します。出口ウェルには、わずかなメディアの滴だけが見えるはずです。野生型および変異型のC.albicans株をテストするには、クモ培地中の野生型SC5314細胞培養物を50マイクロリットルを2つの出口ウェルに添加し、スパイダー培地中のbcr1変異体を2つの出口ウェルに添加し、スパイダー培地中のEFG1変異体を2つの出口ウェルに添加します。

インターフェースプレートをマイクロ流体プレートに戻し、蓋を所定の位置にロックします。ソフトウェアのせん断制御セクションに戻り、フローモードを一定に設定し、最大せん断を2ダインセンチメートルの2乗に設定します。セルのある出口ウェルをクリックして、出口から入口ウェルへの培地の流れを開始し、C.albicansの播種を開始します。

3秒後、ウェルプレートコントロールセクションの停止ボタンをクリックして、細胞がインレットウェルに入るのを防ぎます。細胞を最初の細胞付着のために、視聴チャネルで10〜20分間流れずに静止させます。イメージングモジュールウィンドウで、多次元集録モジュールを開き、左側のメニューのステージタブをクリックします。

ステージセクションで、48ウェル0-20ダインマイクロ流体プレートのマスターステージリストをロードします。次に、サンプルリロード調整を開き、ステージを絶対位置モジュールに移動します。サンプルの再読み込み調整モジュールで、ライブボタンを押すと、十字線付きの画像プレビューが表示されます。

ジョイスティックを使用して、チャンネル4の表示に隣接する矢印の先端がソフトウェアの十字線と揃うようにウェルプレートを配置します。次に、絶対位置メニューへの移動ステージに移動し、原点設定ボタンを押します。次に、サンプルリロード調整モジュールに戻り、左側のメニューの最初の基準点セクションをクリックして、48ウェル0-20ダインマイクロ流体プレートのファイルをロードします。

多次元取得モジュールのステージセクションで、ステージ位置22.2をダブルクリックして、顕微鏡の視聴ステージとカメラの焦点を矢印マーカーに近づけます。次に、ジョイスティックを使用して、ビューイングチャネル22に隣接する矢印の先端が十字線と揃うようにウェルプレートを配置します。多次元集録モジュールの Y 座標を の Y 位置にコピーします。

2 サンプルリロード調整モジュールの Update Reference Points タブにあります。最後に、サンプルリロード調整モジュールの「Update stage positions」タブで、「Apply to MDA stage list」をクリックします。イメージングモジュールウィンドウで、多次元取得モジュールを使用し、左側のメニューの[保存]タブをクリックします。

次に、実験のファイル名と、取得した画像をコンピューターに保存するフォルダーを選択します。次に、タイムラプスタブをクリックして、各画像の間に5分で合計145枚の画像を取得するように設定します。次に、[波長]タブで、波長の数を1に設定し、50%明視野と50%カメラで12〜20ミリ秒の露光時間でキャプチャします。

ゲインを 0.6 に、デジタイザを 20 ミリヘルツに設定します。付属のテキストプロトコルで説明されているようにフォーカスを設定した後、取得を選択して、すべてのサブステージの接着細胞のプレフラッシュ画像のキャプチャを開始します。せん断制御セクションで、フローモードを一定に設定し、最大せん断を1ダインセンチメートルの2乗に設定します。

次に、インレットウェルをクリックして、インレットウェルからアウトレットウェルへの培地の流れを開始し、接着していないセルを除去します。5分後、ウェルプレートコントロールセクションの停止ボタンをクリックします。2 回目の画像を取得できるようにし、せん断制御セクションで、最大せん断流量を 0.5 dyne per cm の 2 乗に調整し、変更を確認します。

イメージングモジュールウィンドウで、[分析ツール]タブを選択し、ドロップダウンメニューから[多次元データのレビュー]をクリックします。次に、[ベースファイルの選択]をクリックします。これにより、多次元データセットユーティリティウィンドウが開きます。

次に、ディレクトリの選択ボタンをクリックして、実験の保存に使用されたフォルダを選択します。データ セットの一覧で、実験ファイル ログを選択します。ログが読み込まれたら、表示ボタンをクリックします。

左側の波長メニューのオプションをクリックして波長を選択し、ドロップダウンメニューから表示するステージ位置を選択します。モジュールの上部にある番号からロードする画像を選択するには、画像番号を右クリックします。次に、タイムラプスビデオを作成するためにすべての画像を選択します。

選択した画像は、新しいウィンドウでビデオとして開きます。イメージングモジュールウィンドウのファイルタブをクリックし、ドロップダウンメニューから[名前を付けて保存]を選択します。結果のビデオをデフォルトのファイル形式で保存します。

最後に、保存したビデオファイルを開いて画像 J.In 画像Jにロードし、[ファイル]タブをクリックして、[名前を付けて保存]をクリックします。ドロップダウンメニューから[AVI]を選択し、10フレーム/秒に設定されたJPEG変換を使用してファイルをAVIファイルに変換します。RPMI 1640培地の野生型条件下では、いくつかの細胞がチャネルに強く付着していました。

それらは菌糸を形成し、挿入する菌糸と酵母細胞で厚いバイオフィルムを観察できます。マイクロ流体実験の終盤では、野生型のバイオフィルムがこの視聴チャネルを完全に埋め尽くします。しかし、アムホテリシンBの存在は、バイオフィルム形成の減少に顕著な影響を及ぼします。

具体的には、細胞の接着が減少し、培地のせん断流とともにいくつかの細胞が流れ去るのが見られます。野生型のコントロール細胞は、今回はクモ培地で増殖し、RPMIで増殖したばかりのものと同様のバイオフィルムを形成しました。また、この培地では、2つのバイオフィルム欠損変異体が増殖しています。

どちらの株も、対照と比較してバイオフィルム形成が大幅に減少しています。この細胞集団では、付着した細胞は菌糸を形成せず、結果として生じるバイオフィルムは深刻な欠陥があります。この他の株は、バイオフィルムの形成とチャネルへの接着能力の両方に欠陥があります。

一度マスターすれば、この実験は1時間未満でセットアップできます。この方法を使用すると、初期の細胞接着、バイオフィルムの成熟、細胞の分散など、バイオフィルム形成のさまざまな側面について多くのことを学ぶことができます。このプロトコルは高度にカスタマイズ可能で、汎用性があります。

これは、王国間で異なる微生物種を評価するように調整できます。流速、温度、インキュベーション時間、培地は、混合種のバイオフィルムの研究にも使用できます。このマイクロ流体バイオフィルムアッセイは、in vivo動物試験の前に活用するin vitroアッセイとして強くお勧めします。

私たちの経験では、このアッセイの結果は、既存のin vivoバイオフィルムアッセイと非常によく相関しています。