Name: 転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学ぶChIP-seq、4sU-seq、リボソームプロファイリングを組み合わせた手法で、転写因子結合、転写、翻訳、RNA回転率をリアルタイムに解析します。細胞活性化時の遺伝子制御の全層を同時に可視化できます。

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我々 は 4sU が主な T 細胞の分類を確立するアドバイスの Lars Dölken に感謝します。エリーザベト ・ グラーフとライブラリの世代と配列の重要な助けのためのトーマス ・ シュワルツマイヤーDirk Eick とアンドリュー ・ フラットレイの RNAPII と T 細胞の抗体を提供するため(名) アンリエット Uhlenhaut とフランツィスカ グロイリッヒ ライブラリに備えてチップ seq; ヘルプキャロライン C. フリーデルは FR2938/7-1 と CRC 1123 (Z2) ドイツ研究振興協会 (DFG) からの助成金によって支えられました。エルケ Glasmacher からの助成金 GL 870/1-1 ドイツ研究振興協会 (DFG) とドイツ語センター糖尿病研究 (DZD)、ヘルムホルツ ツェントルム ミュンヘンのによって支えられました。

<ol><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
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<li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription%2C+Splicing%2C+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li>
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<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis%2C+processing+and+decay+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ContextMap+2%3A+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
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<li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li>
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<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li>
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<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533(2016).</li>
<li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).</li>
<li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li>
<li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

遺伝子の規則の全体のプロセスを分析治療または特定の刺激への応答の細胞の適応を十分に理解する必要は。総 RNA シーケンスを組み合わせて、4sU seq、プロファイリング、リボソームと異なる時点でチップ seq は時間をかけて遺伝子の規則の主要なプロセスの包括的な分析に します。実験のセットアップだけでなく、最適な時間ポイントを定義するには、生物学的プロセスの深い理解が必要。
遺伝子を研究する手法を急速に向上させるため、これらのプロトコルの急激な変化に適応できます。それにもかかわらず、彼らはセルの任意の種類の基本的な遺伝子の調節機構を研究するための最も重要なメソッドを提供します。ここでは、我々 はいくつかの落とし穴と 1 つはこれらのメソッドを使用する場合を検討している事実について説明します。
細胞:細胞は非常に現実的なする必要があります、セル人口の純度主隔離されたセルを使用している場合 (例えば、主な T 細胞の FACS 解析) 保証が必要があります。少しでも強調した細胞はこれらの非常に敏感な配列方法の結果に影響し、新しく転写や翻訳の RNA の量を下げるやシーケンスの結果のストレス反応の不要な読み出しに 。細胞のペレットをこのプロトコルに記載されている遠心速度は主な T 細胞に最適です。したがって、細胞の種類に応じて速度を調整します。
4sU に及ぼす細胞生理学研究:4sU 添加によって細胞生理学に最小限の摂動を確認するため、前述のオプションに加えてさらにおよび/または追加の解析を実行できます、細胞数が限られている場合は特に。単にラベルとラベルのないセルをカウントすることによって細胞の倍加時間を確認することによって、細胞の増殖に及ぼす影響をテストできます。核小体のストレス誘導は、ヌクレオリンと核の免疫蛍光染色による細胞の形態を分析することによってテストできます。4sU の影響をさらに確認するには、ラベル付きの総 RNA からラベルの総 RNA にカウントを読むを関連付けることによって世界的な遺伝子発現変化を測定すること。
セルの番号:T 細胞の in vitro生成少なくとも表 2に示された細胞の量で開始することをお勧めします。セルの種類に応じてメソッドごとの十分な番号を選択します。T 細胞は少ない細胞と他の細胞と比較して RNA を持っている、ので他の細胞の最も可能性の高い値を下げるほど十分であります。チップ seq セル番号高使用抗体と細胞内で興味の蛋白質の発現レベルに依存します。ヒストンや RNAPII チップは、fewe セルすることができます使用が細胞数が低レベルで出された場合は特に転写因子を使用すると、増加する必要があります。
4sU ラベリングと RNA ビオチン化:付着性のセルを使用する場合は、Rädleらで説明されているように指示されることができます 4sU ラベルします。19セル非常に急速に組み込む 4sU から追加できます懸濁液、付着、または半付着性のセルの中に直接。
RNA の 60-80 μ g、ビオチン化を開始することをお勧めします。それにもかかわらず、RNA の量を減らすことができます使用する、30 未満ではテストしませんでしたが μ g。 追加 (例えば、GlycoBlue) のクロムと、ペレットが見にくい場合、RNA を沈殿させます。ダッフィーらまた methylthiosulfonate 活性化ビオチン (MTS ビオチン) より効率的に HPDP ビオチン31より 4sU された RNA と反応を示した。したがって、少ないウリジン残基 (ダフィーら;を参照してください 4sU ラベルの RNA の浄化によって述べられるビオチン化プロトコルを参照してくださいする傾向がある、小さな Rna の回復のため特に、MTS-ビオチンに切り替えを検討して価値があるかもしれない実験プロシージャ)。
新たに転写された RNA の回復、常磁性ビーズや RNA のクリーンアップお好みのビーズを使用することが可能です。常にこれらのキットや、特定の Rna の浄化可能性がありますいないことを考慮します。たとえば、miRNAs に興味がある場合は、miRNA キャプチャとシーケンスの特定のキットを使用することを検討します。
新しく転写された RNA の定量化:新しく転写の RNA を正確に定量化する測定適した蛍光光度計によって実行される (材料の表を参照してください)。4sU 露出の 1 時間以内は、新しく転写 RNA は総 RNA の約 1-4% を表します。ラベル 1 h の新たに転写された RNA は、活性化 T 細胞は、rRNA1190 ~ 94% で構成されています。
リボソームプロファイリング:メソッドを確立し、我々 は、元のプロトコルの提案よりも 1.5 倍のヌクレアーゼの量を使用して適切な消化力を保証決定されます。また、ヌクレアーゼの上昇量の副作用は報告されています。リボソームタンパク質によってバインドされている RNA の一部である間、RPFs を overdigest ことはかなり困難なのでまだ若干最適ヌクレアーゼ消化を滴定する量を増やすことができます。
場合未満 500 ステップ 4.4.2 で回収された RPF RNA の ng、rRNA の枯渇とプールは RNA クリーン & コンセントレーター 5 列を持つ RPFs を精製を繰り返します。また、RNA 溶出 (手順 4.5.6) ゲルの中にゲル (ステップ 4.5.3) の互いとプール ゲルのスライスの横にある 2 つの同一のサンプルをロードします。
28 と 30 の nt バンドをできるだけしっかりとゲルの RPFs を切断をお勧めします。これは Rrna、Trna、後であなたのライブラリの一部となって、あなたの RPFs の配列の読み取りを削減するから不要なフラグメントを排除することに役立ちます。
また、ゲルの浄化中に紫外線を避けるためにことをお勧めします。これはピリミジン二量体、最後に深刻なライブラリの作製とシーケンスの結果に影響を与えると同様に、RNA 断片でニックネームを作成できます。
ライブラリの準備とデータのシーケンス:プロトコルをプロファイリング リボソーム配列に適した cDNA ライブラリを生成できるようにします。4sU ラベルによって生成されるサンプルは、任意の適切な RNA シーケンス キットとライブラリの準備のため直接使用できます。新しく転写 RNA から特に短い時間をラベル付けできない場合場合まだ polyadenylated、ポリ A 選択する必要がありますは実行されません。代わりに、我々 は強く rRNA の枯渇を防ぐためをお勧めします実際のサンプルのシーケンスの深さを減らすこと。T 細胞を使用して、我々 は 400 の実行 (、キットは材料を参照) によって新しく転写と総 RNA の ng rRNA 枯渇を開始し、PCR バイアスを最小限に抑えるために pcr のサイクルを短縮します。ライブラリの準備より少ない原料で実行できます。ライブラリ複雑さ PCR のサイクル数を考慮して最適化する必要があります。
チップ seq ありますも多くキット ライブラリの準備のため。手ライブラリで準備作業も 2 から始まる DNA チップの ng (用材料を使用するキットの提案を参照してください)。シーケンス処理中にカラー バランスの指標をチェックすることを確認します。4sU seq の RNA シーケンス、チップ seq サンプルの合計のための各 10 の6読み取り x ≥40 とプロファイリング サンプル リボソームの 10 の6読み取り x ≥80 のシーケンスの深さをお勧めします。シーケンスの深さはサンプルと下流のバイオインフォマティクス解析に依存し、慎重に検討する必要があります。Cotranscriptional スプライシング、100 のイントロンの読み取りを分析するには、bp ペアエンド シーケンスを選択する必要があります。
バイアスをシーケンス:シーケンスは、転写、翻訳、または転写因子結合でグローバルな変更を決定する際のゴールド スタンダードになりました。近年、既存の方法はその限界に押されたまたは RNA 量がますます少ない開始のシーケンス処理の新しい技術を開発しました。CDNA は、ノイズまたはバイアス導入の拡大が必要です。最近では、分子の一意の識別子 (Umi) は実験的 PCR によって導入された重複を識別するために開発されました。最近では、行政は、シーケンス処理力と差動遺伝子発現32虚偽の発見率にだけ軽度改善が示されました。それにもかかわらず、特に RNA の少量で開始し、多くの PCR のサイクルが必要な場合、コントロール ライブラリの複雑さのためにすべてのシーケンス ライブラリ分子の一意の識別子 (Umi) を使用を検討します。
バッファーおよび貯蔵液:4sU seq とリボソームのプロファイルのすべてのバッファーは、ヌクレアーゼ フリー水を用いた厳密な RNase フリーの条件下で準備されなければなりません。既製のヌクレアーゼ フリーの NaCl、トリス-HCl、EDTA、クエン酸ナトリウム、水を購入することをお勧めします。ヌクレアーゼ フリーの条件を確保するため RNase 擦りあわせるソリューションは、ピペットや表面をきれいにする使用できます。チップ seq のすべてのバッファーは、する必要があります少なくとも DNase 自由し、室温で保存することができます。プロテアーゼ阻害剤を常に追加し、必要に応じて、ホスファターゼの抑制剤使用前に右し氷の上を保ちます。
バイオインフォマティクス:すべてのシーケンス データ (すなわち、チップ seq、RNA シーケンス、および ribsosome プロファイリング) の分析が含まれていますには (例えばFastQC を使用して http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)、アダプター トリミング (例えばでcutadapt20) は調査の下のセルの参照ゲノムにマッピングに続きます。RNA シーケンス データ (合計と 4sU seq) としてプロファイル データ リボソーム、スプライシング RNA seq マッパー ContextMap 221など、必要です。チップ seq データ, 線形、BWA MEM22を使用して十分です。遺伝子発現は、読みのプログラム、例えばfeatureCounts23を用いた遺伝子ごとの数を決定する後 RPKM モデル (エクソン プラスミド百万フラグメント マップあたりあたりヒット)1を使用して計算できます。チップ seq データからピーク通話のためのプログラムの数があります、例えば、MAC24または宝石25。さらに下流の分析は R26、特に Bioconductor プロジェクト27によって提供されるツールを使用して実行できます。
ここでは、4sU と総 RNA レベルとリボソームのプロファイリングから並進の活動を統合する主要な課題は、正規化です。この問題に対処するための古典的なアプローチは、家事の遺伝子のレベルにノーマライズします。個々 の家は維持遺伝子のランダム変動によるノイズを除去するだけでなく例えばより大きいセットの中央のレベルがいくつかの家は維持遺伝子を使用する勧めします > アイゼンバーグと28 を待ってによってコンパイルされた 3,000 の家は維持遺伝子.比 4sU-に平均売り上げ高に基づいて、正規化の総 RNA からの RNA 離職率の計算 (例えばRNA の半減期には 5 h と仮定すると)29 を料金します。ただし、以来、これは家事の遺伝子のための全体的な変更を一切、正規化、例えば相関に基づく遺伝子のグループを識別するためにデータ型の異なる時系列クラスタ リングの独立した分析方法を使用して転写と翻訳活性化中に明確な行動。基づく統合のさまざまなデータ型の詳細については、我々 は、元文書11を参照してください。
売り上げ高レートとデータ統合の分析:グローバル メソッドと多重遺伝子制御 (MGC) によって決定される半減を比較する最近公開されたペーパー33半減相関 (はなど、他の方法と比べて代謝分類方法により得られた最高のしていることを示すことができます。薬によって転写の一般的な抑制)。しかし半減期の計算間違いが生じるし、説明15,34をされている言及する必要があります。我々 は長期 4sU 暴露によるストレス反応によって導入される相違と問題のほとんどを占めています。したがって、4sU ラベルによって導入されたストレス反応を除外するのには欠かせません。離職率をさらに検証するため、MGCs の使用をお勧めします。
また、ここで生成されるデータ セットはより統合的データ分析 (例えば、長い非コード Rna のレギュレーション)35,36も使用できます。

近年では、RNA シーケンス (seq RNA) セルまたは生物1内ですべて表現された Rna を分析する標準的なツールとなっています。ただし、特定の刺激/薬剤に対して適応セルの全体のプロセスを理解する mRNA の転写から処理、回転、および変換に至るまで、すべての基になるプロセスを完全に決定する必要は。総 RNA の変化に依存要因例えばRNA 半減と転写活性は総 RNAseq による RNA 転写の短期的な変化を測定することができますはほとんど細胞の適応を反映させるため貧しいテンプレートであります。環境への影響2,3。確かに、遺伝子の規則4右のように組み合わせた場合の過程で様々 なステップの分析を許可するさまざまな新しいシーケンス技術を開発されています。このプロトコルでは、比較の方法で mRNA の不可欠なレイヤーの規制の追跡を許可いくつかのではなく簡単に該当するシーケンス技術を結合する方法について説明します。転写活性を分析するさまざまな方法が記載されている、遺伝子表現 (ケージ)5、ネイティブ伸長トラン スクリプト シーケンス (seq NET)6、およびゲノムワイド核実行 (GRO seq)7のキャップ分析など,8と同様、bromouridine シーケンス (seq Bru) と 4-thiouridine-シーケンス (seq 4sU)、代謝産物を使用して新たに組み込まれている転写 RNA9,10、ちょうどいくつかの言及します。ケージは、正確な転写開始部位を識別、NET seq と GRO seq 読み取り方向、についてより正確な情報を提供、(ここで説明したメソッドである) 4sU seq を新しく検出は RNA に転写されます。しかし、4sU seq の高感度は、積極的に変更 (これは数分以内に起こる) mRNA プロセシングの量的変化と同様に、細胞の定量的転写活性を測定する別のタイム フレームで適用することができます9、 11,12。さらに、4sU seq は遺伝子9RNA 離職率を計算するための RNA シーケンスとを結合する理想的です。MRNA の転写は実施による RNA ポリメラーゼ II (RNAPII)、転写因子、ヒストン修飾なども一般のアクティベーター/リプレッサー、転写の一部となるなど、多くの要因に左右順番複雑です。遺伝子、プロモーター、エンハンサー領域の数が 1 つの要因に拘束されているをテストするため、今このために、多くの市販抗体13のための標準的な方法である、チップ seq が開発されています。しかし、ChIPseq は、バインドがどこを規制する要因について明確な情報を与える、それ反映されるとはかどうか、それは確かに転写14の変化に 。したがって、4sU seq のチップ seq の共演は、このような生物学的質問のための理想的な組み合わせです。遺伝子発現の調節は、mRNA やタンパク質のレベルが15,16, 並進や翻訳後修飾の可能性のある重要な規則を示すを必ずしも相関するのでも発生後の段階でレベル、状況に応じて。2011 年には、リボソーム プロファイリングまず RNA シーケンスと組み合わせていたし、質量17といくつかの感度の限界があるので、蛋白質で急速に発生する変更を定量化する最適な方法は、今。確かに、このような方法から得られた翻訳速度が (少なくとも長期的変化を測定) 蛋白質のレベルの変更の比較的よい見積もりを提供でき、翻訳などの過程に関するさらに詳細なビューに示されている、開始側と代替翻訳による17 ををフレームします。すべての 4 つの方法の組合せの使用は様々 な細胞のタイプの間の安定した状態で使用できるまたは急速に変化するセル11時間連続の実験します。この使用は、転写因子結合 RNA 転写、処理、および変換に影響を与える変化のゲノムの概要を提供します。

<table><tbody><tr><td>4sU-labeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>無菌H2O/PBSで50 mMストックを準備します。20°C50-500 &micro のアリコートの C;l;再凍結しないでください。</td></tr><tr><td>1.5mlのセーフロックチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30121589</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>1.5mlスクリュートップポリプロピレンチューブ</td><td>ザルスタット</td><td>72692005</td><td>ジメチルホルムアミドに対応</td></tr><tr><td>15mlチューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352096</td><td>ジメチルホルムアミド</td></tr><tr><td>2.0mlのスクリュートップポリプロピレンチューブ</td>に対応 <td>ザルスタット</td><td>72694005</td><td>ジメチルホルムアミド</td></tr><tr><td>50mlに対応チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>ジメチルホルムアミドに対応</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>これらの常磁性ビーズの使用をお勧めします。アリコートと4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマアルディルヒ</td><td>372978</td><td>警告&ndash;健康に有害</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>ヌクレアーゼフリーの H2O で 100 mM DTT として調製し、常に新鮮な</td></tr><tr><td>エタノールを</td>調製 <td>メルク</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link ビオチン-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>50 mg のビオチン-HPDPを50 mLのDMFに溶解して、1 mg/mLの原液を調製します。やさしい加温により、可溶化が促進されます。4°Cで保管します。1 mlのアリコート中のC. DMFは、一部のプラスチック材料を溶解します。ガラスピペットを使用して、ストックガラス瓶から50mlのファルコンチューブにDMFを移すことをお勧めします。</td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>原液</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーEDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>原液</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>原液</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー トリスCl (1M)、pH 7.4</td><td>ロンザ</td><td>51237</td><td>原液</td></tr><tr><td>フェーズロックゲル ヘビーチューブ (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>ステップ1.3.4で使用します。</td></tr><tr><td>ポリプロピレン 15&nbsp;mlの遠心分離管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>または同等物; 彼らは15,000まで耐えなければならない &times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis 試薬 (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>RNAの分離のためのこのか同等のTRIの試薬を使用して下さい、警告&ndash;腐食性で健康に有害です!フェノール解毒剤(PEG-メタノール)への即時アクセスを確保</td></tr> <tr><td>Qubit RNA HSアッセイキット</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>ステップ1.4.11でRNA量を定量化するためにこのキットを使用</td></tr><tr><td>RNeasy MinEluteキット</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>オプション; バッファーRLT</td></tr><tr><td>ナトリウム シトラ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td>を含む <td>ヌクレアーゼフリー水を使用して1.6 Mストック溶液を調製</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&マイクロ;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>4&degで保管;C、マイクロが含まれます。手順 1.4.6 で使用した Mac の列。(RTでストア)</td></tr><tr><td>細胞生存率とストレスアッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE アネキシンVアポトーシス検出キットI</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>オプション</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>オプション</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>オプション</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td> <td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>オプション</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>オプション</td></tr><tr><td><ストロング>バッファー</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU 洗浄バッファー</td><td></td><td>RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in Nuclease-free H2</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td> <td>4 &deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA ヌクレアーゼフリー水中; 1 mL のアリコートを作成し、4°C;C</td></tr><tr><td>RNA沈殿バッファー</td><td></td>は、<td>RT</td><td>1.2 M NaCl、0.8 Mクエン酸ナトリウムでヌクレアーゼフリー水に保存します。ヌクレアーゼフリーの条件下で事前に準備してください。50mlのファルコンチューブに室温で保存してください。</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー機器</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 ナノキット</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>このキットを使用して、ステップ1.3.10でRNAの完全性を確認します</td></tr><tr><td>RNA 6000 ピコキット</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>UV/VIS分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>または同等のもの。ステップ1.2.2 / 3.1.8 / 3.3.3 / 3.4.3で使用</td></tr>高速<tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>または13,000に達することができる同等の機器&nbsp;&times;&nbsp;g</td></tr><tr><td>高速ローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>15mlチューブ</td><td></td><td></td><td></td>用アダプター</tr><tr><td>冷蔵卓上型遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>または同等品。</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>サーモミキサー C</td><td>または同等品。</td></tr><tr><td>磁気スタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>1つのスタンドは8 & microを保持します。Macの列。</td></tr><tr><td>超微細スケールの</td><td>メトラー・トレド</td><td>ML204T</td><td>または同等品。</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>RNAゲル用、または同等品です。</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% アガロースプレキャストゲル</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>RNA ゲル用、または同等品。</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>オプション</td></tr><tr><td>TruSeq ストランドトータル RNA ライブラリ準備キット</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>または同等品。T細胞については、400 ngの4sUとTotal RNAを11サイクルでPCR増幅に使用しました。このキットにはrRNAの枯渇が含まれています</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td>は<td>、Nanodropまたは同等の機器を使用してRNA濃度を測定します</td></tr><tr><td><ストロング>リボソームプロファイリング</ストロング>/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo プロファイルキット(哺乳類または酵母)</td><td>イルミナ</td><td>RPYSC12116(酵母)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo プロファイルキット(哺乳類または酵母)</td><td>イルミナ</td><td>RPHMR12126 (哺乳類)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HRカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &コンセントレータ-25キット</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr> <tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>4sU-seq</td></tr><tr><td> その他の消耗品や機器は、ユーザーガイドに記載されています</td><td>!!</td><td></td><td>ユーザーガイドをよく読み、必要な消耗品を事前に注文してください（ゲルなどの一部の消耗品は納期が長いことを考慮））</td></tr><tr><td>ChIP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>1%</td></tr><tr><td>70%のEtOH</td><td>の老人的な実験室の供給業者</td><td></td>の最終濃度に加える <td>常に新鮮な</td></tr><tr><td>アガロー</td>スの<td>一般実験室の供給者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XPのビーズ</td><td>を準備して下さい ベックマン・コール</td><td>ターA63987</td><td>私達はこれらの常磁性ビーズを使用することを推薦します。アリコートと4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ChIPライブラリ調製キット</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>または、お好みのキットを使用してください</td></tr><tr><td>DNA低結合微量遠心チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>ステップ4.3.1でプロテインGに結合したこれらの超常磁性ビーズを使用してください。使用前にRTに持参してください</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td>2Mストック溶液を準備し</td></tr>ます <tr><td>グリコーゲン</td><td>ロシュ</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>このキット(または同等のもの)を使用して、ステップ4.2.4でクロマチンを精製します。</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤 (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>新たにバッファーに加え、氷上に保持</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>新たにバッファーに添加し、氷上に保持</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>このキットを使用して、ステップ 4.6.4. で DNA 量を定量化します Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicized to about 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies (可能であれば ChIP グレード)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 RNA Pol II [8WG16]</td><td></td><td>abcam ab817</td><td></td></tr><tr><td>抗 Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>または対象</td><td></td><td></td><td></td>抗体</tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking バッファー</td><td></td><td>0.5 % BSA および 0.5 % Tween 20</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Lysis バッファー</td><td></td>と共に RT PBS で保存<td>RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0]、85 mM KCl、および 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP バッファー</td><td></td>で保存 <td>RT</td><td>0.01 % SDS で保存してください。1. 1%トリトンX-100;1.2&nbsp;mM EDTA;16.7&nbsp;mM Tris-HCl、pH 8.1;16.7&nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>溶出バッファー</td><td></td><td>RT で最長 6 か月</td>保存 <td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、5 mM EDTA (pH 8.0)、300 mM NaCl および 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>核溶解バッファー</td><td></td><td>RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0]、10 mM EDTA、および 1 % SDS</td></tr><tr><td>洗浄バッファー I</td><td></td><td>RT で保存</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td> RT <td>で保存</td><td>0.1 % 安全データシート;1%トリトンX-100;2&nbsp;mM EDTA;20&nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1;500°CmM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>RT</td><td>0.25で保存&nbsp;M LiCl;1%NP-40;1&nbsp;mM EDTA;10&nbsp;mM Tris-HCl、pH 8.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー機器</td><td>Agilent</td><td></td><td>G2939BA 電気泳動分析のためにこの機器を使用します</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBXマイクロチューブ 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>またはあなたの超音波処理装置のための特別なチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td></td><td></td>による<td>T細胞の超音波処理:20 - 25サイクル(500 &microの2つの1.5 ml Bioruptorマイクロチューブで30秒オン、30秒オフ。l 各チューブ)</td></tr> <tr>チューブ<td></td><td></td><td></td><td>用磁気スタンド</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キュービットフルオロメーター</td><td>サーモサイエンティフィ</td><td></td>ック <td>このフルオロメーターを使用して、少量のRNA/DNAを定量化します</td></tr></tbody></table>

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

起動時に、細胞は急速に機能プログラムを変更し、それにより、その遺伝子発現プロファイル。、たとえば、細胞の分化、形態形成や (免疫細胞の活性化)、などの機能性の刺激の間に遺伝子発現の大規模な変化は発生するまたはローカル環境から薬やその他の要因への暴露後。刺激し、細胞の種類によっては、これらの変更は、急速に、遺伝子発現制御の任意の可能なレベルを発生します。刺激/薬物の特定の種類に反応細胞のすべての分子プロセスを表示するは、分子生物学の最も困難な作業の 1 つです。ここでは、遺伝子の規則の多重層の同時分析を可能にするプロトコルについて述べる。比較すると、特に、(リボソームの翻訳と同様、転写因子 (クロマチン免疫沈降-配列 (チップ seq)) を結合、 de novo転写 (4-thiouridine-シーケンス (seq-4sU))、mRNA プロセシングと売り上げ高プロファイリング)。これらの方法を組み合わせることによってアクションの詳細とゲノム広いコースを表示することが可能です。
急速に適応またはこれは (彼らが新鮮かどうか) に関係なく 4sU 露出の時にすべての遺伝子の転写活性を示していますので、システムの変更を分析する際、新たに転写された RNA の配列することを特にお勧めします。総 RNA シーケンスとリボソームのプロファイリングの組合せの使用は、RNA の売り上げ高と翻訳料金の計算をさらにできます。高スループット シーケンス結果のバイオ情報解析は、データの分析と解釈のための多くの手段のことができます。生成されたデータは、co-transcriptional と代替のスプライシング、いくつかの可能な結果に言及するだけの追跡もできます。
別のモデル有機体または細胞の種類、細胞を含むためここで説明した結合されたアプローチを適用できます。また、品質管理を含む、各メソッドの詳細なプロトコルを提供し、潜在的な問題や落とし穴を議論します。

4sU ラベル: 最適なことを確認4sU ラベル条件 (アポトーシス、核ストレス、細胞ストレス)、時刻、および濃度:4sU の高レベルは rrna 処理と生産を抑制でき、細胞質と核の応力30を誘発します。したがって、4sU 誘起応力としてアポトーシスの興味のセルをテストする必要があります。西部のしみの分析は、原子力のストレスを示す p53 蛋白の蓄積を可視化するため推奨細胞ストレスおよび蛍光活性化細胞のアポトーシス (FACS) 解析を選別表示リン EIF2a レベルを上げます。高レベルと 4sU またはアーゼファミリーや亜ヒ酸のような薬剤への長い露出は、細胞ストレスを誘導するために使用できます。BH3I 1 と扱われた細胞アポトーシスや細胞死を誘導する (500 ng/μ L) または 95 ° C (ヒート ショック) で 5 分間インキュベートしました。アネキシン V/7 AAD の染色は、アポトーシス (アネキシン V) と死者 (7 AAD) セルを決定に使用されました。500 μ M 4sU で 0.5 h のプライマリの Th1 細胞を生成の in vitroのラベリング (最終濃度) または 200 μ M 4sU で 1 h も誘導する細胞ストレスの兆候もアポトーシス (図 1) は、十分な 4sU 設立に 。
RNA の分類の時間も短縮できます (≤5 分) もはやに比べてラベリング回のシーケンス イントロン短時間の増加に 。Co-transcriptional 融着接続率を可視化、4sU ラベルの時間は 30 分を超えない。4sUlabeling に関する詳細については、Rädleらを参照してください。19
品質管理:RNA を処理するとき、RNA の整合性は非常に重要なのです。電気泳動分析によるビオチン化後 4sU された RNA の RNA の品質をチェックすると便利です (材料の表を参照してください)。総 RNA の塩基配列決定に使用する場合に特に、2.2.2 のステップから隔離された RNA の検証を検討してください。RNA の整合性の数 (鈴) は、さらなる処理 (図 3) のための RNA の整合性を確保する ≥8 をする必要があります。
電気泳動分析は、新しく転写 RNA を確認する使用できます。新しく転写 RNA にされてはるかに少ない顕著な典型的な rRNA バンドと総 RNA と比較して著しく少ない成熟した Rrna が含まれていることに注意します。
リボソームのプロファイリング: cDNA ライブラリの PCR の拡大: cDNA 増幅 (ステップ 4.9.1) は良いシーケンス結果を確保するための重要なステップです。電気泳動分析によって増幅されたライブラリを分析します。増幅されたライブラリの良いサンプルが付近でピークを示しています 140 160 bp (図 4 a)。二量体であるべきアダプターの過剰な量は避ける (図 4 b)、これらのサンプルは製造元のプロトコル (PCR の製品の浄化ページ) によるとページの精製の手順を使用してさらに浄化する必要があります。あまりにも多くのテンプレートまたはあまりにも多くの PCR のサイクルは、期待を超える分子量バンド、にじんだり PCR 製品、およびアダプター ダイマー製品 (図 4) の出現によって特徴付けられる過剰増幅で起因できます。ほとんどのサンプルの円形の cDNA の 1-5 μ L と増幅用 9 PCR のサイクルは通常正しい PCR の製品の十分な量を得られます。
チップ: クロマチンのせん断:最適な剪断条件は、細胞の種類ごとに調整する必要があります。事前にせん断条件 (例えば、高または低電源サイクル数) を決定します。低い細胞密度がせん断効率を高めるので、テスト目的のため、同じ数の細胞と同じボリュームを使用します。上または下-剪断、クロマチンを回避ましょう。大規模なクロマチン フラグメントことができます詰まらせて、チップ結果に影響劇的とエピトープ抗体に結合効率の低下につながる興味の蛋白質過剰せん断破壊できます。せん断のクロマチンの主要な割合の約 1,000 頃この実験で最良の結果が達成された bp か (図 5 a) を少し下げます。
QPCR によるチップの検証:チップを開始する前に、それは使用される抗体がチップに適して場合をテストすることをお勧め (可能であれば、使用チップ グレード抗体) チップ qPCR による。QPCR によるライブラリの準備を開始する前にシーケンスのためにチップを確認 (手順 5.6.5 参照)。興味の蛋白質の既知のターゲット サイトにバインドのプライマーを設計します。遺伝子内の正確なターゲット サイトが既知の場合は、遺伝子と関連する規制要素をスキャンするいくつかのプライマーのペアを使用できます。RNAPII チップの Th1 細胞Ifngのが発現刺激、誘導とアクチンのプライマーをポジティブ コントロールとして使用できます。これらの遺伝子は Th1 細胞 (図 5 b) に表されないので、 Sox9とインスリンはネガティブ コントロールとして機能します。MRNA の qPCR 用通常エクソン スパニングのプライマーを使用しないように注意してください。IgG コントロールは、使用される抗体の特異性を証明するためにも使用できます。沈澱 DNA は適切な蛍光光度計で測定可能 (材料の表を参照してください)。IgG 制御による連結特異的 DNA の量大幅削減とを比較する興味の抗体によってバインドされている DNA 量。
複製: 生物学的意義の証明:強く、細胞すべて未処理と処理のサンプル (図 2) の id が同じであることを確認するためのセルの同じプールから始まってすべてのメソッドの運動の実験を実行することをお勧めします。それにもかかわらず、生物学的複製 (例えばqPCR、FACS 解析によって) とサンプルを比較する各メソッドの主な時間ポイントの小さい因数を取ることをお勧めします。これにより大まかな推定のため、両方のレプリケートのため治療が再現可能なシーケンスを続行することができる場合。基づく分析による複製の検証を実行する必要があります。結果の再現性は、複製間の FPKM 値との相関の観点から評価することができ、散布 (図 6) を用いて可視化します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> 図 1: 細胞生理学の摂動なしの最適な 4sU ラベル条件の検証 (ダーバリー工房らから図。11) (A) FACS 解析によるアポトーシスの検出: それぞれ体外生成された Th0 細胞は 4sU (角かっこで示されます) の異なる濃度の 0.5 h、1 h、2 h の扱われました。ヒート ショック (95 ° c 5 分) 7 AAD により細胞死を誘導するために使用されたに対しアポトーシス アネキシン V によって決定を誘導するために使用した BH3I 1 治療法。(B) 西部のしみの分析 4sU の p53 の扱われ、T 細胞を活性化: サンプルは 200 μ M 4sU で活性化、500 μ M の 4sU が付いていた 0.5 h 時間ポイント以外の指定された時間のため付けられました。(C) ウエスタンブロット法リン EIF2a と (B) のように同じラベルの条件で活性化 Th1 細胞で合計 EIF2a。アーゼファミリーは肯定的な制御として使用されました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> 図 2: ゲノム全体の変更を追跡するキネティック セットアップの概要 この方式は、4sU seq、総 RNA シーケンス、リボソーム プロファイル、および細胞治療時にゲノム変化を研究するチップ seq を結合するためのセットアップを示しています。細胞をプールして必要な対照の細胞数をおきます。残りのセルを扱い、各メソッドおよび時間ポイントの分割します。前述の 4sU と 4sU seq の放置処理セルのラベルを付けます。タイム ポイントと各メソッドのサンプルは、検討されている特定の生物学的問題に依存します。各時点のメソッド、サンプルとプロトコルの専用の一部に従います。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> 図 3: 4sU された RNA の品質管理 総 RNA とビオチン化活性化 Th1 細胞から得られた RNA は、バイオアナライザーを分析しました。18 s rRNA、28 s rRNA が表示され RNA 整合性数 (鈴) は、RNA の整合性を判断する計測器で与えられます。凛は、RNA の整合性を確保する ≥8 をする必要があります。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> 図 4: バイオアナライザー プロファイル ライブラリをプロファイリングするリボソームの (A) A の良いライブラリ: 予想されるサイズの範囲 (140-160 bp) でピークを示し、更に精製する必要はありません。(B) このサンプルは過剰なアダプター ダイマー増幅産物を示しています (120 bp) (140-160 bp) の目的の製品を基準にしています。このライブラリには、浄化が必要です。(C) 過剰に増幅したサンプル: (矢印によって示されます)、期待を超える分子量ピークとまみれて PCR 産物が表示されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> 図 5: 最適なクロマチン サイズせん断と qPCR によるチップの検証後 (A) Agarose のゲル画像 25 サイクル、超音波発生装置でせん断され、プロトコルで前に説明したようにして精製した 3 つのサンプルからせん断クロマチンの最適なフラグメントのサイズを示しています。(B) 合計 RNAPII チップ (抗 RNA Pol II、8WG16、ab817) の Q PCR の結果、入力の割合として表されます。Ifng 、アクチンのプライマーは、 Sox9とインスリンマイナス コントロールです (両方の遺伝子は活性化 Th1 細胞では表されません)、正として使用されました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> 図 6: 生物の比較 (ダーバリー工房らから図を複製します。11) 代表的な散布式の値 (FPKM) を比較を活性化 Th1 細胞の刺激後新しく転写 (4sU) RNA 4 h のレプリケートします。緑の線は、FPKM の値に等しいを示し、順位相関は、各プロットに示されています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>持続時間 (分) を表示</td>
			<td>推奨 4sU 濃度 (μ M)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100-200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15-30</td>
			<td>500-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>&lt; 10</td>
			<td>500-2000</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 推奨 4sU 濃度 (Rädle からら 。19) ラベルの異なる時間の推奨 4sU 濃度の範囲が示されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>メソッド</td>
			<td>セル数</td>
			<td>RNA の量</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU ラベル</td>
			<td>≥2 10 x7
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>リボソームのプロファイリング</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>チップ seq</td>
			<td>≥2 10 x7 - 3 × 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 主な T 細胞の必要量 各メソッドに必要な主な T 細胞の最小量。他の細胞型を使用するときの金額は小さくなります。

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA の処理、離職率、時間をかけて翻訳と活性化および/または急速に変化するセルのイベントの全体のコースを表示の変更を追跡できます。

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

この実験装置の全体的な目標は、刺激や治療に応答して発生する主要な分子メカニズムを明らかにするために、RNAおよびDNA調節の主要な層を描写することです。この方法は、一般的な免疫応答だけでなく、薬物治療に対する分子応答など、さまざまな生物学分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、時間の経過とともに複数の遺伝子調節層を同時に表示できることです。したがって、各方法で同じセルのプールを使用することが重要です。大まかに言えば、これら3つのプロトコルは、最初に目的の細胞を異なる時点に操作することを含む。各操作の後、細胞はプールされ、アッセイごとに1つずつ、3つのグループに分けられます。ビデオのこのセクションでは、4sUラベリングを使用した最近生成された転写産物のラベリングと精製について説明します。各プロトコルは、最終的にシーケンシングの準備が整ったサンプルを生成します。まず、目的の細胞株に必要な4sUの濃度とインキュベーション時間を調べます。例えば、200マイクロモルの4sUをT細胞に1時間使用します。処理後の細胞プールを、各方法と時点ごとに1つの別々の皿に分離します。次に、必要な数の4sUアリコートを完全に解凍し、4sUを細胞培地に直接加えて、指示どおりに培養物をインキュベートします。次に、4sUで標識した細胞をポリプロピレンチューブに集めます。次に、細胞を遠心分離します。ペレットをTRIzolに約300万細胞/mLで再懸濁し、TRIzolで細胞を室温で5分間インキュベートします。次に、Radleとその会社の方法を使用して、30〜80マイクログラム以上のRNAを調製します。次に、チオール特異的なビオチン化反応をこの順序で混合します。ヌクレアーゼフリーの水から始めて、次に10倍バッファー、次にRNA、最後にビオチン-HPDPを使用します。その後、ピペッティングで混合し、インキュベートします。クリーンアップステップに進み、新たに転写されたビオチン化RNAと非標識の既存のRNAを混合したサンプルを作製します。次に、サンプルを摂氏65度に10分間加熱します。その後、すぐに氷の上に置きます。各サンプルが冷えたら、100マイクロリットルのストレプトアビジンビーズを加え、室温で15分間回転させてインキュベートします。次に、新たに転写されたRNAで装飾されたビーズを磁気カラムで分離し、その後、11マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出して後遺症を収めます。このセクションでは、活発に翻訳されているRNAを単離する方法について説明します。これらの転写産物のシーケンシングにより、動的トランスラトソームが調査されます。このアッセイは、RNAシーケンシングデータと組み合わせることで、RNAのターンオーバーと翻訳速度の計算を可能にします。まず、懸濁液にシクロヘキシミドを添加し、反転して混合します。室温で1分後、細胞を遠心分離し、培地を取り出し、シクロヘキシミドを添加したPBSを少なくとも10ミリリットルで細胞を洗浄します。次に、培地を吸引し、1,000万細胞あたり100マイクロリットルの哺乳動物細胞溶解バッファーと交換します。混合物を漉動して、20〜25ゲージの針を使用して細胞を溶解します。次に、細胞ライセートを予冷した1.50ミリリットルチューブに移し、ライセートを氷上で10分間インキュベートし、定期的に逆転させます。10分後、ライセートを遠心分離し、上清を冷たい1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、ヌクレアーゼフリー水でライセートを1〜10希釈分に調製し、260ナノメートルでの吸光度を測定します。次に、希釈されていないライセートの200マイクロリットルのアリコートを作成し、吸光度の各ユニットに対してそれぞれを7.5ユニットのヌクレアーゼで処理します。ヌクレアーゼを45分間反応させてから、15マイクロリットルのRNase阻害剤を使用して反応を終了するか、摂氏マイナス80度で保存します。次に、市販のキットを使用してRPF RNAを精製し、続いてキットを使用してrRNAを枯渇させます。次に、500ナノグラムの単離されたRPF RNAに対してPAGE精製を行います。サンプルをゲルにロードする準備をした後、それらを変性させ、後者とコントロールを、摂氏95度で5分間インキュベーションします。次に、サンプルを180ボルトで約75分間分析し、結果を評価します。ゲルスライスコレクションの場合は、滅菌済みの20ゲージ針を使用して、0.5ミリリットルのチューブの底に穴を開けます。次に、28〜30塩基ヌクレオチド領域に対応するゲルスライスを切除し、それらを調製した0.5ミリリットルチューブに移す。コンタミネーションをチェックするために、RNAコントロールのサンプルとネガティブコントロールのサンプルを含めます。次に、キャップ付きの小さなサンプルチューブを大きな微量遠心チューブにロードします。次に、アセンブリを遠心分離してゲルを細断し、サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、水、酢酸アンモニウム、SDSをサンプルチューブに加え、摂氏4度の一晩反応でRNAを溶出させます。次に、市販のキットを使用してsmall RNAからcDNAライブラリを作成し、cDNAライブラリのシーケンシングを進めます。ChIP-seqは、ゲノム全体にわたる目的の転写因子の結合をマッピングするために使用されます。リボソームプロファイリングとすべての新しい転写産物の調査からのデータと組み合わせることで、ChIP-seqは転写因子結合の実際の影響を明らかにします。まず、ホルムアルデヒドを使用して細胞サンプルを最終濃度1%に架橋します室温で10分間穏やかに揺さぶった後、グリシン濃度を0.125モルに上げて反応を停止します。次に、細胞を採取し、氷冷したPBSで3回洗浄し、細胞ペレットをマイナス80°Cで凍結します。その後、新たにプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷細胞溶解バッファー1ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁し、細胞を氷上で10分間インキュベートします。10分後、細胞をスピンダウンし、上清を吸引し、溶解バッファーの添加とインキュベーションを繰り返します。次に、超音波処理を使用して、200〜1, 000塩基対のせん断クロマチンを生成します。次に、クロマチンを抗体でコーティングした磁気ビーズに結合し、50 μLの溶出バッファーでタンパク質-DNA複合体を溶出します。次に、5マイクロリットルの40%RNaseと溶出バッファーを加え、サンプルを30分間インキュベートします。次に、1ユニットのプロテイナーゼKと20μgのグリコーゲンをサンプルに加え、2時間インキュベートします。次に、サンプルを一晩中摂氏65度まで移動して、逆架橋します。翌日、サンプルを磁石に少なくとも30秒間置き、目的のDNAを含む上清を収集します。その後、DNAを精製し、定量PCRを用いて検証を行い、DNAのシーケンシングを行います。4sU標識は細胞にストレスを与え、アポトーシスを引き起こす可能性があります。アネキシンVおよび7-AAD染色を使用して、アポトーシス細胞と死細胞を同定しました。30分または60分の処理を用いてTh1細胞を4sUで標識した後、細胞は死滅せず、アポトーシスも起こらなかった。RNAの完全性は、RNAを処理する際に非常に重要であるため、標準的なアッセイを使用してシーケンシングする前に常にチェックされていました。増幅されたライブラリには、健全な範囲のヌクレオチドが含まれていました。過剰なアダプターダイマーは、PAGEによるさらなる精製が必要でした。テンプレートが多すぎるか、サイクルが多すぎると、ヌクレオチドが重くなり、不純物が付着した製品、およびアダプターダイマー製品が生じる クロマチン剪断は、剪断されたクロマチンの主要画分が約1, 000塩基対またはわずかに少ない場合に最もよく機能することがわかりました。定量的PCRを使用して、クロマチン免疫沈降シーケンシングに対する抗体の適用性をテストしました。ネガティブコントロールプライマーは、目的の細胞で発現していない遺伝子用です。この手順を試行する際には、各方法の4sUをいつ追加するか、いつ細胞を採取するかのタイムスケジュールなど、実験セットアップの詳細な計画を立てることを忘れないでください。4sUが細胞の生存率とストレス応答に与える影響を事前にテストすることにより、常に最適な4sU標識条件を確認してください。要約すると、このアプローチにより、細胞活性化の過程で発生する可能性のある遺伝子調節のすべてのイベントを視覚化できます。この方法は、初代免疫細胞と、刺激や薬物に対するそれらの応答にも利用できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

学ぶChIP-seq、4sU-seq、リボソームプロファイリングを組み合わせた手法で、転写因子結合、転写、翻訳、RNA回転率をリアルタイムに解析します。細胞活性化時の遺伝子制御の全層を同時に可視化できます。

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

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