転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析
2018年3月7日
このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA の処理、離職率、時間をかけて翻訳と活性化および/または急速に変化するセルのイベントの全体のコースを表示の変更を追跡できます。
この実験装置の全体的な目標は、刺激や治療に応答して発生する主要な分子メカニズムを明らかにするために、RNAおよびDNA調節の主要な層を描写することです。この方法は、一般的な免疫応答だけでなく、薬物治療に対する分子応答など、さまざまな生物学分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、時間の経過とともに複数の遺伝子調節層を同時に表示できることです。
したがって、各方法で同じセルのプールを使用することが重要です。大まかに言えば、これら3つのプロトコルは、最初に目的の細胞を異なる時点に操作することを含む。各操作の後、細胞はプールされ、アッセイごとに1つずつ、3つのグループに分けられます。
ビデオのこのセクションでは、4sUラベリングを使用した最近生成された転写産物のラベリングと精製について説明します。各プロトコルは、最終的にシーケンシングの準備が整ったサンプルを生成します。まず、目的の細胞株に必要な4sUの濃度とインキュベーション時間を調べます。
例えば、200マイクロモルの4sUをT細胞に1時間使用します。処理後の細胞プールを、各方法と時点ごとに1つの別々の皿に分離します。次に、必要な数の4sUアリコートを完全に解凍し、4sUを細胞培地に直接加えて、指示どおりに培養物をインキュベートします。
次に、4sUで標識した細胞をポリプロピレンチューブに集めます。次に、細胞を遠心分離します。ペレットをTRIzolに約300万細胞/mLで再懸濁し、TRIzolで細胞を室温で5分間インキュベートします。
次に、Radleとその会社の方法を使用して、30〜80マイクログラム以上のRNAを調製します。次に、チオール特異的なビオチン化反応をこの順序で混合します。ヌクレアーゼフリーの水から始めて、次に10倍バッファー、次にRNA、最後にビオチン-HPDPを使用します。
その後、ピペッティングで混合し、インキュベートします。クリーンアップステップに進み、新たに転写されたビオチン化RNAと非標識の既存のRNAを混合したサンプルを作製します。次に、サンプルを摂氏65度に10分間加熱します。
その後、すぐに氷の上に置きます。各サンプルが冷えたら、100マイクロリットルのストレプトアビジンビーズを加え、室温で15分間回転させてインキュベートします。次に、新たに転写されたRNAで装飾されたビーズを磁気カラムで分離し、その後、11マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出して後遺症を収めます。
このセクションでは、活発に翻訳されているRNAを単離する方法について説明します。これらの転写産物のシーケンシングにより、動的トランスラトソームが調査されます。このアッセイは、RNAシーケンシングデータと組み合わせることで、RNAのターンオーバーと翻訳速度の計算を可能にします。
まず、懸濁液にシクロヘキシミドを添加し、反転して混合します。室温で1分後、細胞を遠心分離し、培地を取り出し、シクロヘキシミドを添加したPBSを少なくとも10ミリリットルで細胞を洗浄します。次に、培地を吸引し、1,000万細胞あたり100マイクロリットルの哺乳動物細胞溶解バッファーと交換します。
混合物を漉動して、20〜25ゲージの針を使用して細胞を溶解します。次に、細胞ライセートを予冷した1.50ミリリットルチューブに移し、ライセートを氷上で10分間インキュベートし、定期的に逆転させます。10分後、ライセートを遠心分離し、上清を冷たい1.5ミリリットルのチューブに移します。
次に、ヌクレアーゼフリー水でライセートを1〜10希釈分に調製し、260ナノメートルでの吸光度を測定します。次に、希釈されていないライセートの200マイクロリットルのアリコートを作成し、吸光度の各ユニットに対してそれぞれを7.5ユニットのヌクレアーゼで処理します。ヌクレアーゼを45分間反応させてから、15マイクロリットルのRNase阻害剤を使用して反応を終了するか、摂氏マイナス80度で保存します。
次に、市販のキットを使用してRPF RNAを精製し、続いてキットを使用してrRNAを枯渇させます。次に、500ナノグラムの単離されたRPF RNAに対してPAGE精製を行います。サンプルをゲルにロードする準備をした後、それらを変性させ、後者とコントロールを、摂氏95度で5分間インキュベーションします。
次に、サンプルを180ボルトで約75分間分析し、結果を評価します。ゲルスライスコレクションの場合は、滅菌済みの20ゲージ針を使用して、0.5ミリリットルのチューブの底に穴を開けます。次に、28〜30塩基ヌクレオチド領域に対応するゲルスライスを切除し、それらを調製した0.5ミリリットルチューブに移す。
コンタミネーションをチェックするために、RNAコントロールのサンプルとネガティブコントロールのサンプルを含めます。次に、キャップ付きの小さなサンプルチューブを大きな微量遠心チューブにロードします。次に、アセンブリを遠心分離してゲルを細断し、サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。
次に、水、酢酸アンモニウム、SDSをサンプルチューブに加え、摂氏4度の一晩反応でRNAを溶出させます。次に、市販のキットを使用してsmall RNAからcDNAライブラリを作成し、cDNAライブラリのシーケンシングを進めます。ChIP-seqは、ゲノム全体にわたる目的の転写因子の結合をマッピングするために使用されます。
リボソームプロファイリングとすべての新しい転写産物の調査からのデータと組み合わせることで、ChIP-seqは転写因子結合の実際の影響を明らかにします。まず、ホルムアルデヒドを使用して細胞サンプルを最終濃度1%に架橋します室温で10分間穏やかに揺さぶった後、グリシン濃度を0.125モルに上げて反応を停止します。次に、細胞を採取し、氷冷したPBSで3回洗浄し、細胞ペレットをマイナス80°Cで凍結します。
その後、新たにプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷細胞溶解バッファー1ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁し、細胞を氷上で10分間インキュベートします。10分後、細胞をスピンダウンし、上清を吸引し、溶解バッファーの添加とインキュベーションを繰り返します。次に、超音波処理を使用して、200〜1, 000塩基対のせん断クロマチンを生成します。
次に、クロマチンを抗体でコーティングした磁気ビーズに結合し、50 μLの溶出バッファーでタンパク質-DNA複合体を溶出します。次に、5マイクロリットルの40%RNaseと溶出バッファーを加え、サンプルを30分間インキュベートします。次に、1ユニットのプロテイナーゼKと20μgのグリコーゲンをサンプルに加え、2時間インキュベートします。
次に、サンプルを一晩中摂氏65度まで移動して、逆架橋します。翌日、サンプルを磁石に少なくとも30秒間置き、目的のDNAを含む上清を収集します。その後、DNAを精製し、定量PCRを用いて検証を行い、DNAのシーケンシングを行います。
4sU標識は細胞にストレスを与え、アポトーシスを引き起こす可能性があります。アネキシンVおよび7-AAD染色を使用して、アポトーシス細胞と死細胞を同定しました。30分または60分の処理を用いてTh1細胞を4sUで標識した後、細胞は死滅せず、アポトーシスも起こらなかった。
RNAの完全性は、RNAを処理する際に非常に重要であるため、標準的なアッセイを使用してシーケンシングする前に常にチェックされていました。増幅されたライブラリには、健全な範囲のヌクレオチドが含まれていました。過剰なアダプターダイマーは、PAGEによるさらなる精製が必要でした。
テンプレートが多すぎるか、サイクルが多すぎると、ヌクレオチドが重くなり、不純物が付着した製品、およびアダプターダイマー製品が生じる クロマチン剪断は、剪断されたクロマチンの主要画分が約1, 000塩基対またはわずかに少ない場合に最もよく機能することがわかりました。定量的PCRを使用して、クロマチン免疫沈降シーケンシングに対する抗体の適用性をテストしました。ネガティブコントロールプライマーは、目的の細胞で発現していない遺伝子用です。
この手順を試行する際には、各方法の4sUをいつ追加するか、いつ細胞を採取するかのタイムスケジュールなど、実験セットアップの詳細な計画を立てることを忘れないでください。4sUが細胞の生存率とストレス応答に与える影響を事前にテストすることにより、常に最適な4sU標識条件を確認してください。要約すると、このアプローチにより、細胞活性化の過程で発生する可能性のある遺伝子調節のすべてのイベントを視覚化できます。
この方法は、初代免疫細胞と、刺激や薬物に対するそれらの応答にも利用できます。
概要
本プロトコルでは、細胞株および初代細胞を対象とした、ChIP-seq、4sU-seq、total RNA-seq、およびリボソームプロファイリングの組み合わせによる利用方法について解説します。これにより、転写因子の結合、de novo転写、RNAプロセシング、ターンオーバー、および翻訳の時間的変化を追跡し、活性化細胞や急速に変化する細胞における一連のイベントの全容を明らかにすることが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- この手法は、さまざまな生物学的分野における重要な疑問への回答に役立ちます。
- これにより、時間の経過に伴う複数の遺伝子調節層を同時に提示することが可能になります。
- 正確な結果を得るためには、各手法において同一の細胞プールを使用することが極めて重要です。
- プロトコルには、異なる時点での細胞操作が含まれます。
研究目的
- RNAおよびDNA制御の主要な層を明らかにする。
- 刺激または治療に応答する主要な分子メカニズムを解明する。
- 免疫応答および薬剤治療に対する分子応答を分析する。
使用した手法
- 新規転写RNAを単離するための4sUラベル化。
- 動的なトランスラトソームを調査するためのリボソームプロファイリング。
- ゲノム全体の転写因子結合をマッピングするためのChIP-seq。
- 遺伝子調節を分析するためのRNAサンプルのシーケンシング。
主な結果
- 転写因子の結合とRNAダイナミクスの同時解析。
- RNAの代謝回転および翻訳速度に関する知見。
- 転写因子の結合が遺伝子発現に及ぼす影響を解明。
- 刺激に対する細胞応答の包括的な視点を提供。
結論
- この統合的なアプローチにより、遺伝子調節の理解が深まります。
- これにより、さまざまな状況下における細胞応答を研究するための強力なツールが提供されます。
- 将来的には、他の生物学的分野への応用が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
転写因子の結合、転写、翻訳、およびRNAターンオーバーを同時にリアルタイムで解析することで、細胞活性化時における遺伝子調節ダイナミクスの包括的な視点が得られます。この統合的なアプローチは、創薬における重要な転換点において、ターゲットバリデーションおよびメカニズムのリスク低減に関する予測の信頼性を高めます。本手法は、刺激や薬剤曝露に対する堅牢で多層的な分子プロファイリングを可能にし、企業の研究開発を支援します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 転写因子の結合および下流の遺伝子調節イベントの直接的な解析を可能にします。
- 転写の変化と機能的なタンパク質合成を関連付けることで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- ゲノムワイドで時間分解能の高い分子プロファイリングを通じて、機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- 複数の調節レイヤーを統合することで、ポートフォリオの優先順位付けにおける予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 転写および翻訳応答を定量化することにより、下流の化合物スクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
- 制御層全体にわたる再現性のある定量的なシーケンシングデータを用いて、アッセイ出力を標準化します。
- スクリーニング準備のための、遺伝子発現および翻訳のスケールアップ可能なハイスループット解析を可能にします。
- 遺伝子制御およびタンパク質合成に対する化合物の影響の信頼性の高い評価をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 分子リードアウトを、疾患に関連する細胞活性化および薬物応答モデルと整合させます。
- 時間の経過に伴う遺伝子調節イベントを追跡することで、創薬から前臨床検証までの連続性を確保します。
- 包括的な分子データを提供し、リスク調整後の推進決定を支援します。
- データによる裏付けがある場合、トランスレーショナルバイオマーカー開発における予測的なリスク低減を強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このコンビナトリアル・セクエンシングのワークフローは、単一の実験的な連続体の中でリアルタイムかつ多層的な分子解析を可能にすることで、初期探索、リード化合物の同定、および前臨床研究を橋渡しします。
- 探索生物学：転写因子の結合とその下流への影響をマッピングすることで、仮説検証とパスウェイの解明を統合します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物評価において、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：比較分析のために、転写、翻訳、およびRNAターンオーバーの高解像度測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：分子レベルのイベントを、疾患に関連する細胞応答や薬剤のメカニズムへと結びつけます。
- エンタープライズでの再利用：多様な細胞型や刺激にわたるマルチオミクスプロファイリングのための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させ、メカニズムの曖昧さを低減する。
- 運用的価値：再現性と拡張性を確保するため、多層的な分子アッセイを標準化する。
- 戦略的価値：十分な情報に基づいた意思決定（go/no-go判断）と、資本効率の高いポートフォリオ管理を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けと、創薬プログラムの推進を支援する。
実施上の検討事項
- 分子生物学、シーケンシング、およびバイオインフォマティクス解析の専門知識が必要です。
- ハイスループットシーケンシングプラットフォームおよび解析インフラへのアクセスが求められます。
- サンプル調製とデータ処理において、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 初代細胞や異なる生物種を含む、さまざまなモデルシステムに適応可能です。
- 潜在的な制限として、ラベル付けによる細胞ストレスや、生存率および品質管理を慎重に行う必要性が挙げられます。
