患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立

外科的に切除された腫瘍組織に由来するこのヒト前臨床モデルの全体的な目標は、患者由来の軟部組織肉腫の初代培養を確立することです。この方法は、軟部肉腫の病態生理学に関する重要な質問に答えるのに役立ち、治療に対する反応を予測するための重要な前臨床ツールを表しています。この手法の主な利点は、完全にヒトの前臨床モデルであることです。

この前臨床モデルは、従来の革新的な薬剤で試験してその活性と作用機序を調査できるため、この技術の意味は軟部肉腫の治療にまで及びます。この方法は軟部肉腫に関する洞察を得ることができますが、がん細胞の軟部組織細胞の相互作用の研究にも適用できます。この方法に不慣れな個人は、腫瘍組織の不均一性や腫瘍細胞の単離に苦労するでしょう。

初期の軟部組織肉腫細胞の選択とCDステップでは、習熟度を達成する前にある程度の経験が必要なため、この方法を視覚的に実証することが重要です。腫瘍標本は、パラフィンフィルムで密封された50ミリリットルのDMEM低グルコース培地を含む100ミリリットルの滅菌尿容器で受け取る必要があります。.サンプルは、腫瘍切除後最大 3 時間、摂氏 4 度に保たれることがあります。

組織培養フードを70%エタノールで滅菌し、スチール製INOXピンセットを70%エタノールで滅菌します。尿容器からパラフィンフィルムを取り出して廃棄します。尿容器の外側を70%エタノールで清掃します。

正方形のシャーレを開けてから、尿容器を開け、滅菌したスチール製のINOXピンセットを使用して腫瘍標本をディッシュに移します。PBSを添加し、腫瘍標本を2回洗浄します。洗浄後、腫瘍検体を1〜2mmの大きさに細かく刻む。

全サンプルの4分の1を2ミリリットルのチューブに移します。次に、1ミリリットルのTRIzol試薬をチューブに加え、すぐにマイナス80°Cで凍結します。細かく細断した腫瘍材料の残りの部分を15ミリリットルのチューブに集め、4ミリリットルのコラゲナーゼ1型溶液を追加します。

次に、コラゲナーゼタイプ1溶液を4ミリリットルの培地で希釈し、チューブを閉じてパラフィンフィルムで密封します。ローリングシェーカーで摂氏37度で15分間インキュベートし、消化を活性化します。15分後、ローリングシェーカー付きのチューブを室温で置き、一晩放置します。

翌日、細胞懸濁液を100ミクロンの滅菌フィルターで50ミリリットルのチューブに穏やかにろ過します。次に、フィルターを培地で洗浄し、濾液を室温で5分間、225 gで遠心分離します。チューブを反転させて上清を捨て、1〜2ミリリットルの培地で細胞を再懸濁します。

細胞数を実行し、細胞数を計算した後、標準的な単層培養物に細胞を80,000細胞/平方センチメートルの密度でプレートします。細胞学的サンプルを調製するには、まず200マイクロリットルの培地に100, 000個の細胞を収集することから始めます。溶液を、フィルターを装備し、スライドガラスを取り付けた使い捨て漏斗にピペットで移します。

細胞遠心分離機を開き、サンプルを挿入します。細胞遠心分離後、フィルターが取り付けられている漏斗を廃棄します。次に、スライドをアセトンで10分間固定し、続いてクロロホルムを5分間固定します。

コンフルエンスが約90%の場合、STS細胞を継代しますPBSで細胞シートを洗浄した後、PBSで2〜3ミリリットルの1Xトリプシンを加え、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。インキュベーション後、200〜1,000マイクロリットルのピペットを使用して分離した細胞を収集し、15ミリリットルのチューブに移します。酵素反応を止めるために4ミリリットルの培地を追加します。

その後、室温で225倍gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、1ミリリットルの培地を加えて細胞ペレットを再懸濁し、細胞を新しい培養プレートまたはフラスコに播種します。腫瘍細胞は、54歳の患者から外科的に切除された脂肪肉腫から単離されました。

患者組織標本中のMDM2増幅を検出するために、蛍光in situハイブリダイゼーションを行った。単離された腫瘍細胞におけるMDM2増幅の細胞学的分析により、患者由来の初代培養の確立が確認されました。培養物をイホスファミド、エピルビシン、イホスファミドおよびエピルビシン、トラベクテジンおよびエリブリンで処理すると、塩基からの形態学的変化が誘発された。

各生存率実験について、3回の独立した反復を行いました。その結果、培養物の化学療法に対する感受性が確認されました。最も積極的な治療法は、イホスファミドとエピルビシンの併用で、進行性または転移性のALT-DDLPSに使用される第一選択薬でした。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば15〜16時間で実行できます。この手順を試みるときは、腫瘍標本を細かく刻むことを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、遺伝子発現プロファイリング、免疫組織化学分析、細胞毒性アッセイなど、さまざまなダウンストリーム解析を実施して、軟部肉腫の生物学に関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、軟部肉腫の分野の研究者がこれらの十分に調査されていない悪性腫瘍の自然史を研究するための道を開きました。このビデオを見れば、患者由来軟部肉腫の初代培養を確立する方法について十分に理解できるはずです。生物学的サンプルや薬物の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、手袋の着用やドラフトでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。