ペプチド ベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング ワークフロー
January 16th, 2018
このプロトコルでは、ホルマリン固定組織イメージング質量分析向けの昇華ベース準備の再現性と信頼性の高い方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、ペプチド質量分析イメージング用の組織サンプルを再現性よく調製することです。この方法により、質量分析の初心者ユーザーは、長い経験的測定を経ることなく、独自のイメージング質量分析ワークフローを開発できます。この手法の主な利点は、再現性が高く、実装が簡単で、費用対効果の高い方法論を使用していることです。
ニトロセルロース被覆スライドを調製するには、導電性酸化インジウムスズ顕微鏡スライドの一方の端に40マイクロリットルの液体ニトロセルロースをピペットで移します。通常のガラス顕微鏡スライドを使用して、表面張力下のニトロセルロースをスライド全体にドラッグして、均一な薄膜コーティングを作成します。ニトロセルロースを室温で20秒間乾燥させ、その後、室温で必要になるまで保存します。
次に、標準的なプラスチック製のペトリ皿の下半分に収まる大きさの厚い吸い取り紙をカットして、カスタムベイパーチャンバーを作成します。紙をカットして、顕微鏡のスライドと同じサイズの長方形のストリップを中央に残します。紙がペトリ皿内の位置を維持するように、十分な余剰を残します。
FFPE組織の場合、テキストプロトコルで説明されているように、切片をニトロセルロースプレコートITOスライドにフロートマウントします。スライドを新鮮なキシレンに浸して、残留パラフィンを2分間除去します。脱パラフィンされたサンプルを、容量70%のエタノール水溶液と続いて100%エタノールからなる等級付けされた溶媒シリーズにスライドを30秒間浸して洗浄します。
次に、スライドをカーノイの液体に2分間沈めます。最後に、スライドを一連の100%エタノール、超純水、および100%エタノールに30秒間沈めます。サンプルスライドをプラスチック製のスライドボックスにロードし、上部に20ミリモルトリスHCOを充填します。
箱を密封し、500ミリリットルの水が入った水浴に入れ、箱が浴槽の底に触れるようにします。次に、圧力鍋で120°Cでボックスを15分間加熱すると、70キロパスカルの動作圧力を達成できます。スライドを取り外して冷まし、周囲温度で15分間乾燥させます。
加水分解したら、まず10マイクロリットルの溶液を組織切片の端にピペッティングして、超純水に10マイクロリットルのトリプシン溶液でサンプルをコーティングします。次に、同じピペットチップを使用して、表面張力下で液滴を組織の表面全体にわたってドラッグします。サンプルを周囲温度で乾燥させた後、スライドの両端にオートクレーブテープを使用して、以前に構築したベイパーチャンバーの上部にサンプルを取り付けます。
100%アセトニトリルと50ミリモルの重炭酸アンモニウムを1対1の容量で混合した溶液600マイクロリットルを、ペトリ皿の底部にある吸い取り紙の指に慎重にピペットで移します。ピペッティングは非常に重要です。ピペッティングを誤ると、マトリックスと表面アナロイドが非局在化し、サンプルに含まれる空間情報が破壊されるためです。ベイパーチャンバーの上半分を下半分に置き、ペーパーフィンガーとサンプルスライドが完全に揃うようにして、赤道周りのチャンバーをパラフィンフィルムでシールします。
サンプルを摂氏37度のインキュベーターに一晩放置して、完全に分解します。分解後、サンプルスライドを5桁の微量分析天びんに載せておきます。スライドを昇華装置の冷却フィンガーに取り付け、ベイパーチャンバーについて説明したのと同じ方法で銅テープで固定します。
チャンバーの底にあるガラスシャーレに300ミリグラムのCHCAマトリックスを入れ、均等に広げてマトリックス結晶の薄い層を作ります。昇華器を組み立てます。そして、馬蹄形クランプで2つの半分を固定します。
組み立てたユニットを、摂氏220度に予熱した砂浴から15〜20センチメートル上に吊り下げ、レトルトスタンドに接続された金属リングに入れます。チャンバーを真空源に接続し、真空をかみ合わせ、約25ミリトールまで5分間安定させます。冷却する指を上部に氷で詰め、50ミリリットルの水を加えます。
装置がさらに5分間落ち着くのを待ってから、先に進みます。チャンバーをスタンドの表面に下げ、砂がチャンバーの底部に完全に接触するようにします。45分間放置すると、0.22ミリグラム/平方センチメートルの理想的なコーティングが作成されます。
45分後、金属リングを上げて砂浴からチャンバーを取り外し、チャンバーを通気します。昇華したら、以前と同様に、以前に構築したベイパーチャンバーの上部にサンプルスライドを取り付けます。アセトニトリルとトリフルオロ酢酸を水中に混合した1対1の容量の溶液を600マイクロリットルの溶液をペトリ皿の底部の吸い取り紙に慎重にピペットで移し、均一なコーティングを確保します。
次に、チャンバーを組み立て、ペーパータブと顕微鏡スライドが完全に揃っていることを確認します。チャンバーを摂氏37度のインキュベーターに1時間放置します。フラットベッドスキャナーでスライドをスキャンして、デジタル画像を作成します。
サンプルを質量分析計にロードし、適切なソフトウェアプラットフォームを使用して分析します。最後に、テキストプロトコルで説明されているようにサンプルを分析します。ここに示されているのは、50ミクロンで画像化された正しく処理された組織標本であり、良好なマクロ構造と白質と灰白質の明確な違いを示しています。
サンプルの比較が成功すると、異なる組織位置で明確な分化が見られます。ここでは、白質領域で表されるように、白質領域で1, 085の質量電荷比で表されるペプチドのアップレギュレーションの明確な領域があります。対照的に、この不適切に準備されたサンプルは、大規模な非局在化を示しています。
3つのパネルに存在する分子のパターンは、生物学的領域間に明確な定義がないことや、表示される分子の存在量に違いがないことを明確に示しています。このビデオを見た後、ペプチドイメージング分析用のサンプルを調製する方法について、非常に良いアイデアが得られるはずです。適切な手順を踏めば、この方法は2日間で8時間以内に行うことができ、一晩で消化することができます。
この方法論を準備する際には、各ステップで注意することが重要です。組織に物理的な損傷が発生すると、サンプルに含まれる空間情報が破壊されます。この方法論のアイデアは、私たちが初めて独自のIMS宇宙調査を開始し、他の決定的な方法論が公開されていないことに気付いたときにありました。
わずかな変更を加えるだけで、私たちの方法論は、タンパク質、ペプチド、脂質、およびその他の低分子の分析に適用できます。この手順に続いて、免疫蛍光法やヘマトキシリンおよびエオシン染色などの他の組織学的手法をサンプルに適用して、イメージング質量分析データの基準点を取得できます。液体ニトロセルロースなどの爆発性の可能性のある化学物質を扱う場合は、正しい安全手順を維持することが重要です。
作業量を最小限に抑え、廃棄物をすぐに処理することは非常に重要です。
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概要
このプロトコルは、イメージング質量分析用にフォーマリン固定組織の昇華ベースの準備のための再現性と信頼性のある方法を説明しています。この技術は、初心者のユーザーが効率的に自分自身のワークフローを開発するのに役立つように設計されています。
主要な研究要素
科学の分野
- 質量分析
- 組織の準備
- イメージング技術
背景
- イメージング質量分析は、組織サンプルを分析するための強力なツールです。
- フォーマリン固定は、生物学的組織を保存するための一般的な方法です。
- 再現性は、信頼できる科学的結果にとって重要です。
- コスト効果の高い方法論は、広範な採用にとって重要です。
研究の目的
- 組織サンプル準備のための簡単で再現性のある方法を提供すること。
- 初心者のユーザーが自分自身のイメージングワークフローを作成できるようにすること。
- ペプチド質量分析イメージングのためのサンプル準備のプロセスを合理化すること。
使用した方法
- ニトロセルロース被覆スライドの準備。
- 導電性スライドへの液体ニトロセルロースの塗布。
- 表面張力を使用して均一な薄膜コーティングの作成。
- 室温でのスライドの乾燥と保管。
主要な結果
- この方法は高度に再現可能で実装が簡単です。
- コスト効果の高い方法論が成功裏に利用されました。
- 初心者のユーザーは広範な経験的試験なしに効率的にサンプルを準備できます。
結論
- このプロトコルは、イメージング質量分析のための組織サンプルの準備を容易にします。
- この分野の研究者のために信頼できるアプローチを提供します。
- この方法は初心者の質量分析ユーザーにとってのアクセシビリティを向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Peptide-based MALDI MSI workflows face significant challenges in detecting analytes from formalin-fixed tissues due to cross-linking and spatial delocalization risks. This protocol provides a reproducible, cost-effective method to preserve spatial information while maximizing peptide ionization, directly supporting target validation and assay development in discovery pipelines. By enabling reliable peptide detection from archival FFPE samples, it enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting spatially resolved peptides from FFPE archives.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through reproducible sample preparation that maintains tissue integrity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative peptide maps for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening with preserved spatial context.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via simple, manual coating steps.
- Scalability: Facilitates platform reuse across peptide, lipid, and small molecule screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through consistent FFPE sample handling.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of MSI peptide signals with histopathological references like H&E staining.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing reliable molecular localization data from archival cohorts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, specifically enabling peptide analysis from formalin-fixed samples that would otherwise be inaccessible to MALDI MSI.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting endogenous peptides with spatial resolution.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible matrix coating and analyte localization without delocalization.
- Analytics: Generates quantitative ion intensity readouts that allow comparison of peptide abundance across tissue regions.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows by enabling H&E and immunofluorescence co-registration for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost capability for peptide MSI applicable across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved peptide detection from FFPE tissue.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via simple, manual steps requiring no automated instrumentation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing false negatives in peptide detection from archival samples.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by unlocking historical tissue collections for target validation studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on standard laboratory equipment including vacuum sublimation apparatus and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of FFPE handling and reagent preparation between pathology and analytics teams.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and fixation durations.
- Practical limitations include careful handling of explosive liquid nitrocellulose and precise volume control to prevent analyte delocalization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:29
Preparation of Reagents and Equipment
1:21
Preparation of Tissue Sections and Methylene Crosslink Hydrolysis
2:40
Tissue Digestion
3:57
Matrix Coating via Sublimation
5:26
Recrystallization and Instrumentation
6:20
Results: Correctly and Incorrectly Prepared Human Brain Tissue
7:07
Conclusion
