Name: ペプチド ベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶ ペプチド質量分析イメージングのためのホルマリン固定組織サンプル調製法。昇華ベースの手法で初心者も再現性高くワークフローを構築でき、コスト効率に優れた実験手順を習得できます。

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著者は、アルツハイマー病研究及びパークウェイに与えられるアーク探索補助金 (DP160102063) のための博士課程奨学金プログラムを通じてこの仕事の一部を資金調達のためシドニー医療学校財団とブルースと基礎を確認したいと思います。

注意: 適切な個人用保護具 (PPE) (例えば白衣、ニトリル手袋、安全メガネ等)の使用を含む、この手順を実行するときにすべての適用可能な安全注意が従う必要があります。
1. 試薬・機器の準備
<ol><li>
溶液の調製
	<ol>
<li>カルノワの液 500 mL を準備するミックス 6 氷酢酸、クロロホルム、100% エタノール (エタノール): きれいなガラス ショット ボトルで v/v/v 比率は 3:1。</li>
		<li>液体ニトロセルロース (NC) をするためには、40 mg/mL の最終的な集中のための穏やかな攪拌できちんとしたアセトン (西部にしみが付くことでよく使われる) NC 膜を溶解します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コーティング NC スライドの準備
	<ol>
<li>使用血液の準備のため使用されるものと同様の手法が病理20 NC を準備するため汚れはコーティング スライドです。</li>
		<li>導電性インジウムの錫の酸化物 (ITO) 顕微鏡のスライドの 1 つの端に液体の NC の 40 μ L をピペットします。通常のガラス顕微鏡スライドを使用して、表面張力の下でノースカロライナをも薄膜を作成するスライドにドラッグします。</li>
		<li>20 s し、室温で必要になるまで室温で乾燥する NC を許可します。これらの条件下でサンプルのストレージは組織維持され、ほこりの無料提供に明確なできます。 注: このメソッドの準備としてよりもっとよく知られている「薄膜」は、NC の粘度と表面張力にスライドに自己レベルの欠如に依存する均一なコーティングになります。唯一ケア、スライドの準備は早すぎる移動ではないとき取られるべき完全な報道ではなく、NC の縞模様が作成されます。 注意: 液体 NC は非常に迅速に乾燥、ソリューションを適切に普及している前に乾燥を避けるためにすぐに働くことが不可欠です。注意は、高エネルギー化合物であるそれとして液体状態で NC を処理し、放火爆発を防ぐために点火の元に連絡する必要がありますいないときにもすべき。NC も乾燥と皮膚や手袋をはめた手で長時間の接触に入って来ること冷たい火傷を引き起こすことが吸熱転移を経る。たびに、関連するすべてのリスクを最小限に抑える少量が準備されるべき (< 1 つの mL をお勧めします)。一度乾燥し、室温で安定しています。ただし、NC は大量に存在する場合は爆発的な残ることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カスタム ベーパーチャンバーの作成
	<ol>
<li>標準プラスチック シャーレ (94 mm 径で 3 mm 厚) の半分下に合うように十分な大きさのはさみのペアで厚めのあぶらとり紙の部分をカットします。</li>
		<li>センター、紙、ペトリ皿 (補足図 1) 内での位置が維持されるよう十分な余剰を残して顕微鏡スライドと同じサイズの長方形のストリップを残して、紙をカットします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ティッシュ セクションの準備
<ol><li>
FFPE 組織21。
	<ol>
<li>NC に標準的なベンチ マウントされたミクロトームとフロート マウントで 12 μ m の厚みでそれはプレコート伊藤スライド セクション目的組織ブロックを選択します。</li>
		<li>新鮮なキシレン、2 分間残留パラフィンを削除するスライドを水没し、操作 2 回を繰り返します。 注: パラフィン ブロックは特に広汎性または組織が比較的小さいパラフィン ブロックと比較して、サンプルがキシレンで洗濯前に大半を離れて溶融する 60 ° C では加熱することができます。</li>
		<li>傾斜溶剤シリーズのスライドを水没によって deparaffinized のサンプルを洗う: 70 %v/v エタノール/水、100% エタノール、カルノワの流体、100% エタノール、超純水、100% エタノール。各浸水の期間必要があります 30 秒、2 分を持続する必要がありますカルノワの流体を除く。 注意: カルノワの流体とキシレン必要があります保存および吸入した場合非常に有毒な発煙のフード使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ホルマリン固定凍結 (FFF) 組織 注: サンプルする必要があります既に凍結する、適切なサンプルの種類に応じて。<ol>
<li>20 分22のミクロトームの動作温度で組織ブロックを平衡します。 注: 平衡温度は組織の種類によって異なります。</li>
		<li>12 μ m と雪解けのマウントにミクロトームを使用して組織に事前に用意された NC セクション コーティング伊藤セクションにスライドさせます。</li>
		<li>暗闇の中でベンチに真空デシケータにスライドを格納します。 注: これらの条件の下で数週間のためのサンプルを格納できます。</li>
		<li>前述した FFPE 組織 (2.1.3) の傾斜溶剤シリーズのサンプルを洗います。 注: 必要はありませんキシレン deparaffinisation ステップのサンプルが埋め込まれていないようです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. メチレン架橋加水分解
<ol><li>上部に 20 ミリ モル トリス-HCl (pH 8.8) で満ちているプラスチック製のスライド ボックスにスライドのサンプル (FFF または FFPE) を読み込みます。シール ボックスとボックス下部に触れることができるように、水の 500 mL を含む水のお風呂にそれを置きます。70 kPa の圧力を達成することができる圧力鍋で 120 ° C で 15 分間それを熱します。</li>
	<li>スライドを取り外して冷ます、15 分間常温乾燥させます。</li>
</ol>4. 組織消化
<ol><li>加水分解し、一度ティッシュ セクションの端に液の 10 μ L 分注による超純水のトリプシン溶液 (1 mg/mL) の 10 μ L のサンプルをコートし、同じピペット チップを使用して、表面の下で組織の表面全体に液滴をドラッグ緊張。 注: 組織のエッジの枠を超えて酵素の拡散上にピペット チップ組織表面を傷つけない。</li>
	<li>常温乾燥するサンプルを許可します。</li>
	<li>一度乾燥し、スライド (補足図 2) のどちらかの端にオートクレーブ テープで構築済みの蒸気室 (組織下向き) の上部にあるサンプルをマウントします。</li>
	<li>600 μ L が均等にウェット指が表示されるまで、100% アセトニ トリルと 50 mM 重炭酸アンモニウム ペトリ皿の底の部分にあぶらとり紙指に慎重の 1:1 v/v ミックスを含む溶液をピペットします。</li>
	<li>紙指およびサンプル スライドを確保、半分が完全に、整列下部に蒸気室の上半分を置き、パラフィン フィルムの赤道周辺の商工会議所のシールします。</li>
	<li>完全な消化力を許可する 37 ° C の定温器のサンプルを一晩おきます。</li>
</ol>5. マトリックス昇華によるコーティング
<ol><li>かつて消化、5 桁の微量分析バランスのサンプル スライドの重量を量る。</li>
	<li>昇華装置の冷却の指の上にスライドをマウントし、蒸気室 (補足図 3) のとおり同じように銅テープで固定します。 注: スライドは冷却指で均等に連絡を確保するため、銅テープの層は水平な面に冷却の指の下に配置されます。これは行列も沈着につながるスライドは均等に冷却されることを保証します。</li>
	<li>商工会議所とマトリックス結晶の薄膜を作成する均等に広がりの下部にガラス シャーレに 300 mg の α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) マトリックスを配置します。</li>
	<li>技術を組み立て、馬蹄形クランプで 2 つの半分を固定します。220 ° C でレトルト スタンドに接続されている金属製のリングに置くことで予熱、砂浴上組み立てユニット 15-20 cm を中断します。</li>
	<li>真空源に商工会議所を接続し、真空を従事、5 分 ~ 25 mTorr に安定させることができます。</li>
	<li>パック氷の上に指を冷却し、50 mL の水を追加します。続行する前にさらに 5 分のために解決する装置を許可します。</li>
	<li>砂、チャンバーの底に完全に接触を確保、砂の表面に商工会議所を下げ、0.22 mg/cm2の理想的なコーティングを作成する 45 分のためにそれを残す 注意: ガラス室の致命的な障害で避難中、装置への損傷として高真空でガラスを処理結果ことができる場合は、注意をすべき。</li>
	<li>45 分後に金属製のリングを上げることによって砂浴からチャンバーを削除し、商工会議所をぶちまけます。 注: 商工会議所がベントされて、一度スライドする必要があります削除する空気中の水分が凍結指およびサンプル スライドを凝縮して開始されます非常に迅速に。</li>
	<li>スライドを削除し、目的のコーティングが達成されていることを確認するそれの重量を量る。 注: 場合が不足してコーティングを達成すると、プロセスを繰り返して昇華スライドの必要な塗膜厚さを達成するまで。</li>
</ol>6. 再結晶
<ol><li>・昇華し、一度説明以前 (組織下向き) として構築済みの蒸気室の上部にあるサンプルのスライドをマウントします。</li>
	<li>溶液の均一なコーティングをしてシャーレの底の部分であぶらとり紙の上に慎重に水に酸「100% アセトニ トリルと 0.1% v/v トリフルオロ酢酸の 1:1 (v/v) ミックス 600 μ L をピペットします。</li>
	<li>商工会議所を組み立てる、完全に合わせ、1 h の 37 ° C の定温器のまま紙タブや顕微鏡スライドを確保します。 注意: は、商工会議所をシールしないでください。 注: 再結晶、一度行列の通常黄色の色合いが白に変更より少なく光沢がある、および表示も非常に。これはその結晶が正しく実行されたことを示します。</li>
	<li>サンプルは、分析の準備が整いました。</li>
</ol>7 計装
<ol><li>デジタル イメージを作成するフラットベッドスキャナーのスライドをスキャンします。</li>
	<li>質量分析計にサンプルをロードし、適切なソフトウェア プラットフォームを使用して分析します。</li>
	<li>750 3,500 Da、望ましい結果に適用されているスポットの解像度の質量範囲で肯定的なイオン リフレクトロン モードのサンプルを分析します。ほとんどの場合、20-50 μ m のラスターの幅が十分では 10 μ m、しかしわずかに使用される15。 注意: MALDI UV レーザー電離放射線の源は、直接表示すべき。レーザー計測器は、操作の前にシールド内で含まれていることを確認します。</li>
</ol>

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</ol>

利害の対立や商業的な関心を開示する著者があります。

このプロトコルは、検体の非局在化を排除しながらイオン化可能な分子種の生成を最大化するために設計されました。重要な要因を含む行列、サンプルを消化したり昇華24; 後再結晶を適用するとき、同じ基本原則を使用してすなわち、蒸気も沈着マトリックスまたはそれ以外の場合、作成および管理する必要があります。再結晶と均等にサンプルの下に、消化の溶剤洗浄をピペッティングどこよりもより多くの溶剤蒸気を受け取る個々 の領域を防ぎます。これは目に見える結露の形成を予防する重要な全体的にサンプルが均等に消化され、再結晶したことの保障し同様、表面の分子の非局在化を阻害します。それは、あまりにも少ない比較的低強度と種の多様性が表示されます行列のも沈着を達成するために不可欠です、あまりにも強度と25種の多様性を低下させる、サンプルからイオンを抑制します。行列も沈着を達成するために中断された顕微鏡スライドのフット プリントの真下でも、薄い均一なサイズのマトリックス結晶層が置かれることを確認します。レイヤーが凹凸や薄すぎるのか、行列の昇華もゆっくり進むが不均一な<sup cla...

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングは、二十年1、2、生体分子を含む各種の分析のイメージ ベース技術として採用されている: 脂質3、ペプチド2 ,4タンパク質2、5、代謝物6、7N 型糖鎖8、および合成分子治療薬9,10など。この手法の有用性を示す出版物の数は、最後の 10 年間6,11,12,13以上大幅成長しています。脂質などの特定の分子の化学的性質は容易にイオン化し、こうして必要とする少し前の準備3MALDI MSI を介して分析する比較的簡単です。ペプチドなどより困難な目標は、効果的にこれらの分子をイオン化するために必要な手順が、広範かつ一般に複雑な14。現在、アドレスすることを目指して、このユニークな視覚技術15の組織を準備に採用されている方法論における再現性を示す非常に少数の出版物があります。この理由のため観測をコンパイルや最適化を実装、単一に簡単に実装できる、方法論、ホルムアルデヒドからペプチドの解析のためには少しの変更が必要な架橋組織ソース14。
本稿では、検出とホルマリン固定凍結 (FFF) とホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) ティッシュ セクションから生成されたペプチドの空間マッピングの検証、低コストの再現の方法論を説明しました。この方法論を必要としないか、または任意の特殊な計測3に依存。具体的には、ペプチド; を分析に必要な特殊なサンプル準備の多くの側面に取り組む抗原検索16マトリクス コーティングなどの手順。私達のプロトコルには、安価な装置と試薬、本来なら代替ロボット装置17をできられない人より広いコミュニティにアクセス可能なこの方法がそれにまた利用します。
マニュアル サンプル調製法の開発の後ろの推論は 2 倍だった: 第一に、装置の使用は 〜 1 μ m 長さ18より一般的なスプレーで何かは不可能では、マトリックス結晶の一貫性と均一なコーティングを作成しますテクニック。第二に、コストを比較的小さく設定: カスタム装置の総コストは <$ 1500 豪ドル我々 は、費用対効果の面でに注意、ロボット機械の関与がない場合、サンプルあたりの価格ははるかに安い。昇華の使用報告されている以前は、しかし、我々 の知識を最大限に試料調製をこのプロセスを説明するステップバイ ステップの方法論がない報告も、文献に記載されています。
このプロトコルは、MALDI の質量分析計へのアクセスがあるし、興味19の生体分子に関連する空間情報の生成に専念している研究者を支援するものです。要するに、MALDI MSI は審査組織の形は抗体に依存しないまたは2の汚れを。

<table><tbody><tr><td>クライオミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>CM3050</td><td>組織の準備と切片用。</td></tr><tr><td>酸化インジウム錫顕微鏡は</td><td>、ブルカー</td><td>8237001</td>をスライドさせます <td>組織の準備と切片用。</td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>組織の準備と切片用。</td></tr><tr><td>圧力鍋</td><td>カンブルック</td><td>KPR620BSS</td><td>ティッシュの準備と切片用。</td></tr><tr><td>昇華剤</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>昇華手順用。CG-3038とデザインが似ていますが、カスタムメイドでした&nbsp;</td></tr><tr><td>サンドバス</td><td>NA</td><td>NA</td><td>昇華手順用。特定の会社からではなく外部から供給された折り畳まれたアルミホイルに保持された上質な川の砂</td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>CLS70165100</td><td>昇華手順用。</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>昇華手順用。古い質量分析計のスペアパーツとして供給されています&nbsp;</td></tr><tr><td>コールドトラップ</td><td>ケムグラス</td><td>CG-4510-02</td><td>昇華手順用。</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>ジョン・モリス</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>昇華手順用。</td></tr><tr><td>プラスチック製ペトリ皿</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z717223</td><td>昇華手術用。</td></tr><tr><td>37度;Cインキュベーター</td><td>NA</td><td>NA</td><td>昇華手順用。該当なし、インキュベーターは非滅菌で30年以上経過しています&nbsp;</td></tr><tr><td>あぶらとり紙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>昇華処理用。</td></tr><tr><td>ニトロセルロース&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>N8395</td><td>スライドの洗浄用。</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>650501</td><td>スライドの洗浄用。</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>214736</td><td>スライドの洗浄用。</td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>スライドの洗浄用。</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>スライドの洗浄用。95%ストックエタノールからラボで作られています&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C2432</td><td>スライドの洗浄用。</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>ARK2183</td><td>スライドの洗浄用。</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8.8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>タンパク質分解性切断用。粉末を1Mにした後、32% HClで平衡化してPH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q Ultra-Pure Water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>タンパク質分解開裂用。サートリアス浄水システムによる社内での浄化</td></tr><tr><td>ビルカーボネートアンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>タンパク質分解性切断用&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>タンパク質分解性切断用&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>再結晶用。</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>1.00029</td><td>再結晶用。</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸(TFA)&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>302031</td><td>再結晶用。</td></tr></tbody></table>

ペプチド ベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング ワークフロー

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

マトリックス支援レーザー脱離イオン化の使用は、質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングが急速に広がり、この手法を分析し薬と脂質から N 型糖鎖分子のホスト。様々 な試料前処理技術がありますが、このタイプの質量分析の最も困難な課題の 1 つのままホルムアルデヒド保存組織由来ペプチドの検出です。このため、作成し、イオン化可能なペプチドの最大数を誘発しながら、サンプルに含まれる空間情報を保持する強力な手法を最適化します。めざしていますコスト効果的でシンプルな方法でこれを達成するために自動計測を使用して場合に発生することができます潜在的なバイアスまたは準備エラーがなくなります。最終的な結果は、再現性と安価なプロトコルです。

場合、このプロトコルは総傷やその他の変形 (図 1) なし組織形態を明確に表すイメージを生成します。正しく実行されたサンプルの準備のための理想的な検証はされている分子を変更することによって別の物理的な構造を区別する能力 (図 2)。
サンプルは正しく準備されているかを判断する良いガイドは非局在化またはマトリックス集計の有無をチェックするには身体組織の境界を超えて拡張ペプチド署名は、分子はサンプル準備中に移動している完璧なインジケーターです。・ オルークとパドゥーラの詳細で説明されて (2017)15。
作り出されたペプチド スペクトルは選ばれた質量範囲<sup cla...

このプロトコルでは、ホルマリン固定組織イメージング質量分析向けの昇華ベース準備の再現性と信頼性の高い方法について説明します。

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

この手順の全体的な目標は、ペプチド質量分析イメージング用の組織サンプルを再現性よく調製することです。この方法により、質量分析の初心者ユーザーは、長い経験的測定を経ることなく、独自のイメージング質量分析ワークフローを開発できます。この手法の主な利点は、再現性が高く、実装が簡単で、費用対効果の高い方法論を使用していることです。ニトロセルロース被覆スライドを調製するには、導電性酸化インジウムスズ顕微鏡スライドの一方の端に40マイクロリットルの液体ニトロセルロースをピペットで移します。通常のガラス顕微鏡スライドを使用して、表面張力下のニトロセルロースをスライド全体にドラッグして、均一な薄膜コーティングを作成します。ニトロセルロースを室温で20秒間乾燥させ、その後、室温で必要になるまで保存します。次に、標準的なプラスチック製のペトリ皿の下半分に収まる大きさの厚い吸い取り紙をカットして、カスタムベイパーチャンバーを作成します。紙をカットして、顕微鏡のスライドと同じサイズの長方形のストリップを中央に残します。紙がペトリ皿内の位置を維持するように、十分な余剰を残します。FFPE組織の場合、テキストプロトコルで説明されているように、切片をニトロセルロースプレコートITOスライドにフロートマウントします。スライドを新鮮なキシレンに浸して、残留パラフィンを2分間除去します。脱パラフィンされたサンプルを、容量70%のエタノール水溶液と続いて100%エタノールからなる等級付けされた溶媒シリーズにスライドを30秒間浸して洗浄します。次に、スライドをカーノイの液体に2分間沈めます。最後に、スライドを一連の100%エタノール、超純水、および100%エタノールに30秒間沈めます。サンプルスライドをプラスチック製のスライドボックスにロードし、上部に20ミリモルトリスHCOを充填します。箱を密封し、500ミリリットルの水が入った水浴に入れ、箱が浴槽の底に触れるようにします。次に、圧力鍋で120°Cでボックスを15分間加熱すると、70キロパスカルの動作圧力を達成できます。スライドを取り外して冷まし、周囲温度で15分間乾燥させます。加水分解したら、まず10マイクロリットルの溶液を組織切片の端にピペッティングして、超純水に10マイクロリットルのトリプシン溶液でサンプルをコーティングします。次に、同じピペットチップを使用して、表面張力下で液滴を組織の表面全体にわたってドラッグします。サンプルを周囲温度で乾燥させた後、スライドの両端にオートクレーブテープを使用して、以前に構築したベイパーチャンバーの上部にサンプルを取り付けます。100%アセトニトリルと50ミリモルの重炭酸アンモニウムを1対1の容量で混合した溶液600マイクロリットルを、ペトリ皿の底部にある吸い取り紙の指に慎重にピペットで移します。ピペッティングは非常に重要です。ピペッティングを誤ると、マトリックスと表面アナロイドが非局在化し、サンプルに含まれる空間情報が破壊されるためです。ベイパーチャンバーの上半分を下半分に置き、ペーパーフィンガーとサンプルスライドが完全に揃うようにして、赤道周りのチャンバーをパラフィンフィルムでシールします。サンプルを摂氏37度のインキュベーターに一晩放置して、完全に分解します。分解後、サンプルスライドを5桁の微量分析天びんに載せておきます。スライドを昇華装置の冷却フィンガーに取り付け、ベイパーチャンバーについて説明したのと同じ方法で銅テープで固定します。チャンバーの底にあるガラスシャーレに300ミリグラムのCHCAマトリックスを入れ、均等に広げてマトリックス結晶の薄い層を作ります。昇華器を組み立てます。そして、馬蹄形クランプで2つの半分を固定します。組み立てたユニットを、摂氏220度に予熱した砂浴から15〜20センチメートル上に吊り下げ、レトルトスタンドに接続された金属リングに入れます。チャンバーを真空源に接続し、真空をかみ合わせ、約25ミリトールまで5分間安定させます。冷却する指を上部に氷で詰め、50ミリリットルの水を加えます。装置がさらに5分間落ち着くのを待ってから、先に進みます。チャンバーをスタンドの表面に下げ、砂がチャンバーの底部に完全に接触するようにします。45分間放置すると、0.22ミリグラム/平方センチメートルの理想的なコーティングが作成されます。45分後、金属リングを上げて砂浴からチャンバーを取り外し、チャンバーを通気します。昇華したら、以前と同様に、以前に構築したベイパーチャンバーの上部にサンプルスライドを取り付けます。アセトニトリルとトリフルオロ酢酸を水中に混合した1対1の容量の溶液を600マイクロリットルの溶液をペトリ皿の底部の吸い取り紙に慎重にピペットで移し、均一なコーティングを確保します。次に、チャンバーを組み立て、ペーパータブと顕微鏡スライドが完全に揃っていることを確認します。チャンバーを摂氏37度のインキュベーターに1時間放置します。フラットベッドスキャナーでスライドをスキャンして、デジタル画像を作成します。サンプルを質量分析計にロードし、適切なソフトウェアプラットフォームを使用して分析します。最後に、テキストプロトコルで説明されているようにサンプルを分析します。ここに示されているのは、50ミクロンで画像化された正しく処理された組織標本であり、良好なマクロ構造と白質と灰白質の明確な違いを示しています。サンプルの比較が成功すると、異なる組織位置で明確な分化が見られます。ここでは、白質領域で表されるように、白質領域で1, 085の質量電荷比で表されるペプチドのアップレギュレーションの明確な領域があります。対照的に、この不適切に準備されたサンプルは、大規模な非局在化を示しています。3つのパネルに存在する分子のパターンは、生物学的領域間に明確な定義がないことや、表示される分子の存在量に違いがないことを明確に示しています。このビデオを見た後、ペプチドイメージング分析用のサンプルを調製する方法について、非常に良いアイデアが得られるはずです。適切な手順を踏めば、この方法は2日間で8時間以内に行うことができ、一晩で消化することができます。この方法論を準備する際には、各ステップで注意することが重要です。組織に物理的な損傷が発生すると、サンプルに含まれる空間情報が破壊されます。この方法論のアイデアは、私たちが初めて独自のIMS宇宙調査を開始し、他の決定的な方法論が公開されていないことに気付いたときにありました。わずかな変更を加えるだけで、私たちの方法論は、タンパク質、ペプチド、脂質、およびその他の低分子の分析に適用できます。この手順に続いて、免疫蛍光法やヘマトキシリンおよびエオシン染色などの他の組織学的手法をサンプルに適用して、イメージング質量分析データの基準点を取得できます。液体ニトロセルロースなどの爆発性の可能性のある化学物質を扱う場合は、正しい安全手順を維持することが重要です。作業量を最小限に抑え、廃棄物をすぐに処理することは非常に重要です。

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Biochemistry

生物化学

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ペプチドベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージングワークフロー

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