Name: キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶキネティック蛍光ベースのCa²⁺動員試金法で、Gタンパク質共役受容体（GPCR）のアゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別する方法です。CXCR4を用いた細胞ベースアッセイにより、創薬研究に有用なスクリーニング技術を習得できます。

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著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーン、Geert Schoofs を感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。

注: 1 と 2 のセクションで説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。
1. U87 のメンテナンス。CD4.hCXCR4 セル
<ol><li>加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコで細胞を成長します。 注: このプロトコルで使われる培養細胞のラインは安定に発現する分化 4 のクラスター (CD4) と人間 U87 膠芽腫細胞株 CXCR4 と前述の17をされています。CD4 と CXCR4 の細胞表面発現をフローサイトメトリーによる常時監視し、表現のレベルは常に一定 (~ 100 %cd4+と 〜 100 %cxcr4+細胞)。受容体発現レベルを調査する流れ cytometry プロシージャの使用されているセルの行の世代の詳細な説明は、このプロトコルの範囲内ではありません。<ol>
<li>80-85% の confluency にサブカルチャーのセルです。細胞培養する前に部屋の温度 (RT) に到達するすべての試薬を許可します。</li>
		<li>セルから条件培を外し、5 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でセル単一層を洗います。</li>
		<li>0.25% トリプシン-EDTA の 3 mL を追加し、単層細胞に均等に配布します。トリプシン-EDTA の過剰を削除し、セル開始をデタッチするまで、37 ° C で最大 5 分を孵化させなさい。</li>
		<li>完全な新鮮な成長媒体 (ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10% 胎仔ウシ血清 (FBS) + 0.01 M HEPES + 適切な選択エージェント) の 10 mL を追加します。上下に軽くピペッティングにより細胞を再懸濁します。50 mL の滅菌チューブに細胞懸濁液を転送します。</li>
		<li>選択したメソッドを使用して実行可能なセルの数をカウントします。U87 膠芽腫細胞の場合生存率は一般的に達する 〜 100%。 注: セルの番号は、いくつかの方法で決定できます。我々 は定期的にトリパン ブルー染色 (材料の表を参照) に基づく自動細胞解析装置を使用してその標準処理手順、しかし他のマナーによると同様に動作するはずです。</li>
		<li>コート t75 フラスコ培養用フラスコの 25 ミリリットル新鮮な成長培地の最終巻に 2 × 106または 3 x 106 (実行可能な) セルを追加し、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。 注: 3 x 10 の6セルを使用するかどうか、電池が 2 日後 80-90% の confluency に達するでしょう。2 x 10 の6セルを使用している場合彼らが 3 日後に同じ密度に到達します。細胞の成長率は必要があります他のセルの行を使用する場合にまず経験的に定められます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 +動員アッセイ用細胞の播種
<ol><li>細胞継 (0 日目) で、コートを黒壁付きのポリスチレン 96 ウェルのプレートの日 (材料の表を参照) を下細胞付着を容易にするために 0.1% ゼラチン液と。 注: 塗装版とは、市販 (材料の表を参照) を使用している場合は、ゼラチンで 96-ウェル プレートのコーティングを省略可能性があります。各セルライン プロトコルで続行する前に調査の下で手動コーティングの代わりにあらかじめコーティング プレートの使用を評価することをお勧めします。<ol>
<li>ゼラチン 1 g を 100 mL の PBS 1% 解を得るために追加することによってゼラチン溶液を準備します。さらに使用する前に PBS で 10 倍に希釈します。ゼラチンの溶解度を高めるためには、熱の 37 ° c. への解決策</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートのウェルあたり 0.1% ゼラチン溶液 100 μ L を追加します。室温 2 時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一方で、コーティングの 96 ウェル プレートでシードにセルを準備します。<ol>
<li>細胞培養用フラスコからをデタッチし、新鮮な培地にそれらを再停止しなさい、それらを数えるトリパン ブルー染色法を用いたします。</li>
		<li>室温 400 × g で 5 分間 50 mL のチューブに細胞をスピンします。</li>
		<li>新鮮な培地に細胞を再懸濁します (DMEM + 10 %fbs + 1 %hepes、抗生物質) 106 (実行可能な) 細胞/mL x 0.1 の細胞密度を得るため。</li>
	</ol>
</li>
	<li>透明な底の黒い壁板から、板の上を反転させて組織の乾燥ゼラチン溶液を削除します。200 μ L/ウェル余分なゼラチンを削除し、再びプレートを裏返して PBS を追加します。</li>
	<li>ゼラチン コーティング 96 ウェル プレートのウェルあたり (0.2 x 10 の5セルに対応) 細胞懸濁液 200 μ L を分注 (今から 1 つこのプレートは呼ばれます「測定プレート」として)。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2で一晩プレートを孵化させなさい。</li>
</ol>3. 蛍光 Ca2 +細胞の読み込み-敏感な染料
<ol><li>1 日目に実行実際 Ca2 +動員アッセイ、蛍光 Ca2 +とシードのセルの読み込みから始まる-バインド染料蛍光 2 AM。<ol>
<li>40 mL HEPES (1 M) を追加することにより 200 mL ハンクの平衡塩溶液 (HBSS、10 x、フェノール赤なし, ない重炭酸ナトリウム) にアッセイバッファーを準備します。純水 2 L の最終巻を入手し、4 g ウシ血清アルブミン (BSA) を追加するを追加します。電磁攪拌による BSA を溶解します。(NaOH) と 7.4 に pH を調整し、ソリューションをフィルターします。 メモ: 次のすべての手順の中に「アッセイバッファー」と呼ばれる、同じバッファーが使用されます。</li>
		<li>蛍光 Ca2 +の貯蔵液 (ジメチルスルホキシド (DMSO) 4 mM) の準備-敏感な染料蛍光 2 AM。光に過度の暴露を避けます。解散 1 mg 蛍光 2 AM (分子量: 1,061 g/mol) 235.6 μ L DMSO で。</li>
		<li>蛍光色 2 AM の実用的なソリューションを準備します。1 つの 96 ウェル アッセイ プレート ミックス蛍光 2 AM 原液 (4 mM) の 12.5 μ L と 12.5 μ L 非イオン性界面活性剤 (例えば、プルロニック f-127) ポリオール ソリューション (20% 重量/体積、DMSO の材料表を参照してください)。15 mL チューブ 11 mL アッセイバッファーにこの混合物の 22 μ L を追加します。蛍光色 2 午前の最終濃度は、4 μ M です。 注: ノニオン界面活性剤は、蛍光 2 AM と、結果、セルの負荷を高めるために水の溶解度を改善するために、分散剤として使用されます。DMSO の界面活性剤の可溶化、熱の 37 ° C および均一な解を得るため定期的にミックスでサンプルを実行します。</li>
		<li>プレートをひっくり返すとペーパー タオルの乾燥によって 96 ウェル測定板で以前シード細胞から成長培地を削除します。</li>
		<li>100 μ L/ウェル マルチ チャンネル ピペットを使用して色素溶液を読み込むを追加し、暗闇の中で RT で 45 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 準備 96 ウェル ポリプロピレンの板ケモカイン リガンド cxcl 12 または調査中で化合物を含む
<ol><li>丸底ポリプロピレン (PP) 96 ウェルのプレート (材料の表を参照) を取得します。<ol>
<li>Cxcl 12 の原液を許可 (1 mg/mL) と室温平衡に調査中の化合物の原液 注: [cxcl 12 のストック溶液を調製純水 0.01 %tween20 添加し、使い捨ての因数として-20 ° C で保存します。</li>
		<li>アッセイバッファーに cxcl 12 溶液 x 5 の準備 (31.25 に匹敵する 250 の ng/mL nM) と 5 (アッセイバッファー) のそれぞれの化合物の濃縮希釈倍。</li>
		<li>定義済みプレート レイアウトに従って適切な 96 ウェル プレートに溶液を調剤します。調剤 75 μ L/ウェルのプレート cxcl 12 を含む (「ケモカイン プレート」) 分配 50 μ l/ウェルのプレート (「複合プレート」) 化合物を含みます。 注: 両方最終的になる化合物と cxcl 12 希釈測定板の調剤時に 5 倍。また、ケモカイン プレートと同様、両方の複合板にアッセイバッファーのみを含むネガティブ コントロール井戸を含めることが重要です。また肯定的な制御の井戸が含まれてする必要があります (つまり、井戸のケモカイン プレートに cxcl 12 が複合板の対応する井戸にアッセイバッファー)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. プロトコルの設定を蛍光マイクロ プレート リーダー
注: このプロトコルで使用される蛍光マイクロ プレート リーダー材料表で呼ばれます。
<ol><li>まず、蛍光プレート リーダーのクーラー ユニットに切り替えてからと蛍光リーダー自体に。ほんの数分を開始し、オープン システムのソフトウェアができます。</li>
	<li>次の手順が含まれています] メニューのドラッグ アンド ドロップを使用して試金のプロトコルを作成します。<ol>
<li>「設定」ボックスで励起波長と 'Read_Mode' を選択: 470-495 nM;発光波長: 515-575 nM。 注: 選択した波長が Ca2 +の使用に適した-敏感な染料 fluo2。</li>
		<li>デバイスのソース 2 の位置に置かれる複合板の化合物の自動混合の「TF とミックス」(流体) ボックス (手順 6.4 を参照).各ウェルに自動的に吸気混合 3 回で 15 μ L のソリューションを選択します。液体の表面の下の 20 μ L をピペット チップの高さを調整します。吸引と調剤を 50 μ L/秒の速度を設定します。 注: ピペット チップの高さはピペット チップの下に残っているボリュームです。たとえば、複合板の井戸は、50 μ L を含む場合、30 μ L の高さは液体の表面の下の 20 μ L に対応します。複合ソリューションをミックスして、混合の速度、ピペットの位置のボリュームは、混合時にヒントし、数サイクルの混合のすべてが調整できるソフトウェアを使用しています。</li>
		<li>「流体転送」ボックスで定義を 20 μ l それぞれの化合物プレートからよく測定プレートに転送されます。20 μ L ピペット チップ位置以下の液体表面のすなわち、化合物の吸引中に高さ 30 μ L、高さ 60 μ L 測定板の調剤時に。誤嚥を 50 μ L/秒の速度と 25 μ L/秒での吐出の速度を設定します。 注: 複合板を含む 50 μ L/ウェル ソリューションの (手順 4.1.3 を参照)、30 μ L の高さが液体の表面の下の位置 20 μ L に対応するため。測定プレート 80 μ L/ウェル アッセイバッファーが含まれます (手順 6.3 を参照)、60 μ L の高さがヒントの同様の位置に対応するため。</li>
		<li>「TF と読み取り」ボタンをを選択します。最初の間隔中に、化合物の測定プレートに塗布する前に 10 の読み取りを記録し、50 を読み取るその後 1 の s. 定義の読み取り間隔で 60 の読み込み (蛍光測定) を選択します。30 の読み取り間隔が 2 番目の間隔を定義する s と 18 の読み取り。 注: この手順中に蛍光測定されます速度論的 (定義された時間間隔) での ~ の合計 10 分。</li>
		<li>3 回プロトコルに「洗浄のヒント」ボタンがあります。各洗浄工程内流体の種類を選択: 流体 (純水) または液 B (70% エタノール)、洗浄サイクル (1) ポンプの数速度 (高速) とストローク (5) それぞれの間に数ステップを洗います。 注: 最初と最後洗浄ステップ流体 A で使用されます、2 番目の洗浄手順液 B を使用します。</li>
		<li>「一時停止 Pipettor」関数にはが含まれます。300 のため一時停止する pipettor を設定 s。 注: プロトコルでこのステップを含めることにより、蛍光プレート リーダー デバイスに統合されて、pipettor の頭を一時停止 5 分プロトコルを続行する前に。</li>
		<li>デバイスのソース 3 の位置に位置するケモカイン プレートに cxcl 12 ソリューションの自動混合できるように"TF とミックス"ボックス (手順 6.4 を参照)。各ウェルに自動的に吸気混合 3 回で 15 μ L のソリューションを選択します。吸引と混合の間に液体の表面の下のピペット先端 20 μ L を配置します。吸引と吐出速度は、50 μ L/秒に設定されます。 注: これらのパラメーターを調整することができますステップ 5.2.2 も同様。</li>
		<li>その後「転送流体」ボックスで定義それぞれからその 25 μ l ケモカインのプレート測定プレートに転送されます。位置のヒント 20 μ L 液体下面すなわち、75 μ L/ウェルを含むケモカイン プレートから吸引中に高さ 55 μ L で (手順 4.1.3 を参照)、および測定プレートに調剤中に高さ 80 μ L で。誤嚥を 50 μ L/秒の速度と 25 μ L/秒での吐出の速度を設定します。</li>
		<li>「TF と読み取り」ボタンをがあります。最初の区間中 5 読み取り測定プレートに cxcl 12 を調剤する前に記録され、140 を読み取りその後を 1 s. 定義の読み取り間隔で 145 の読み込みを選択します。6 s と選択の読み取り間隔が 2 番目の間隔を定義する 20 の読み取り。 注: 一緒に撮影プロトコル全体を通して 243 読み取り (蛍光測定) が記録されます: ステップ 5.2.4 および段階 5.2.9 165 で 78。</li>
		<li>5.2.5 をステップ、プロトコルに「洗浄のヒント」ボタンの 3 回を含めると似ています。 注: プロトコルの最後でこの手順を含むヒントをヒントを変更せずに別の分析を実行する再利用できるをことができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C で「段階温度設定」ボタンをクリックし、37 ° C を選択してデバイスの温度を設定します。</li>
</ol>6. 蛍光分析の実行
<ol><li>45 分のバッファーを読み込むと測定後プレートを培養して (3.1.5 のステップを参照)、板の上を反転してバッファーを削除し、組織上で乾燥させます。</li>
	<li>アッセイバッファーの 150 μ L/ウェルを追加することによってシードの細胞を洗浄し、2 分間インキュベートします。</li>
	<li>板の上を反転して再度バッファーを削除します。マルチ チャンネル ピペットにアッセイバッファーの 80 μ L/ウェルを追加します。</li>
	<li>すべてのプレートを入れて彼らの適切な位置にあるデバイス: ソース 2 の位置に複合板、ソース 3 の位置にケモカイン プレートと読み取り位置測定プレート。ソース 1 のヒントの位置に黒のヒントのボックスを置きます。デバイスのドアをシャット ダウンし、プロトコルを続行する前に 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>板の上の背景の相対的な光の単位 (RLUs) と蛍光差異を決定する「プロトコル信号テスト」ボタンを選択します。新しいウィンドウがポップアップ表示されます。「信号をテスト」を選択します。 注: この手順中に背景 RLUs は蛍光リーダー デバイスの光学コンパートメントに統合された ICCD カメラによって決定されます。Ca2 +の励起に起因するこれらの RLUs-発光ダイオード (Led) による機密性の高い染料 (蛍光-2) (LED 出力波長 470 495 nm)。8,000-10,000 RLUs の値は、このアプリケーションに適しています。RLUs、必要に応じて、適合できる励起強度 (休館ただし強度を選択)、またはカメラのゲート (選択ゲート オープン) を変更することによって。板の上の差異は理想的に 7.5% 未満をする必要があります。</li>
	<li>8,000-10,000 RLUs のバック グラウンド値を取得した場合は、「更新」を選択します。主なプロトコルを保存するには、[保存] ボタンをクリックします。 注: これによりプロトコル信号テストから設定に実施される主なプロトコル。</li>
	<li>「実行」ボタンを押して測定を実行します。</li>
</ol>7. データ分析と品質
<ol><li>分析が完了した後は、システムのソフトウェアの「分析」ボックスを開きます。<ol>
<li>「修正を構成する」と「ベース ライン経由での応答」を選択に移動します。1、測定 5; 終わり測定開始するベース ライン 1 を定義します。各ウェル測定 1 と 5 の間の平均蛍光が計算されます。 注: 特定のすべてのさらなる測定もこの井戸固有ベース ライン 1 で分かれています。<ol>
<li>測定 83 まで測定 78 で開始するベース ライン 2 を定義 (測定 83 後 cxcl 12 が分配される; 再び平均蛍光計算各間も次のすべての測定に測定 78、83、この補正係数を適用測定 83)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>チェック ボックスをアクティブにする「パーセンテージで表示」と「背景を引く」。</li>
		<li>「キネティック除去を構成する」に進みます。Cxcl 12 による Ca2 +応答化合物の阻害効果の評価、243 (すなわち、最終測定) 測定 (すなわち、cxcl 12 の調剤後最初の測定) 84 から始めて最大値最小値を選択します。 注: 選択の最大最小基準 84 の測定と測定の間に最小値と最大応答の違いによって 243 が報告されます。11 測定 78、間最大最小を選択すると、終わるベースライン 1 のベースラインを基準として最小値と最大応答の違いが報告されます。この値使用できます化合物の潜在的な敵対活動を分析、議論を参照してください)。</li>
		<li>データは、システムのソフトウェアの視覚化されます。必要な場合は、追加の分析とその他の一般的な解析ソフトウェア パッケージの可視化用の生データをエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

Ca2 +の動員アッセイ記載以前の識別し、CXCR417のターゲット受容体拮抗薬の分類に貴重なツールであること示されています。ただし、関連ケモカイン受容体 CCR5 の示すようにこのメソッドことができますより一般的にその起動時に、ゾル性細胞質 Ca2 +放出を引き起こす他の Gpcr の大規模なグループに適用することも予想されます。(例えば、セル番号めっきで、蛍光色素を細胞の読み込み) プロトコルのいくつかの手順がするアッセイを転送する前に再最適化する必要があります CCR5 の場合全く同じ実験条件が適用されますが、一方良好な信号対雑音比を得るために他の Gpcr。ここで重要な問題はまた適切な培養細胞ホストの関心と Ca2 +経路の機能的結合の GPCR の高度な表現を許可する選択です。CXCR4、場合 U87 ひと膠芽腫細胞のため選ばれた: (1) CXCR7 の内因性表現の欠如 (関連ケモカイン受容体 CXCR4 として同じアゴニストを占有する)、(2) カップルの Ca2 ...

Gpcr は、細胞外リガンド結合に伴うシグナル伝達カスケードを活性化する細胞表面タンパク質の重要なスーパーファミリーです。彼らは多様な細胞内シグナル伝達経路、最終的に生体反応1,2 の開始で起因するペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン、脂質などの刺激の大きい変化によってアクティブにできます。.また、Gpcr が場合すべてではない発達的および生理学的プロセスの多くでは、関与している、多くの人間の病気は機能不全の GPCR シグナリングまたは受容体発現に関連付けられています。Gpcr したがって医学1,3で最も検証された薬理学的ターゲット中です。
通常、GPCR 創薬探索ワークフローは細胞スクリーニング アッセイなど小さな分子、モノクローナル抗体と特定の GPCR の活性を調節することができるペプチド化合物の識別を有効にすると起動します。ほとんどは、GPCR 創薬アッセイの多くの異なる種類が存在そのような化合物を検索する、半ば-に高スループットス クリーニング キャンペーンと互換性があります。最もよく使われるアッセイは、受容体結合実験蛍光または発光ベースのいわゆる二次メッセンジャーの (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (AMP))、表現型レベルの変動を検出の試金スクリーニング アッセイと β アレスチン募集4をの試金します。特定タイプの試金のための選択は複数の要因によって決まるかもしれないが、または、特定の GPCR シグナリングのプロパティに関する事前の知識によって決まります。アゴニスト GPCR に結合は、ヘテロ三量体 G 蛋白の α サブユニットにグアニジン二リン酸 (GDP) グアニジン三リン酸 (GTP) のための交換の触媒構造変化を誘導します。その後 Gα-GTP サブユニットは Gβγサブユニットから分離し、両方のサブユニット、さらにシグナル伝達経路を開始します。加水分解 GTP 分子と Gα会のそれに続く再 GDP と Gβγサブユニットが復元の G 蛋白質の使用頻度の低い構造5,6に。基づく Gαサブユニットの配列類似性で G タンパク質の種類が定義され (GsG は私Gq、G12/13)7。Gαを介してシグナル伝達サブユニットを与える (Gs) を介して増加などいくつかの典型的な応答に上昇またはサイクリック AMP 生産と細胞内 Ca2 +動態 (Gq) 経由の (G私) を介して減少5 ,7。Gβγサブユニットは、細胞内エフェクター経路を誘発することがあります。G は私の活性化の時に、例えば、-結合 Gpcr、Gβγがホスホリパーゼ C (PLC β) イノシトール三リン酸 (IP3) を生成する7 細胞内ストアからの Ca2 +放出をトリガーするを直接刺激できます。.受容体の活性化、次の Gpcr は GPCR キナーゼ (GRKs) β-arrestins との相互作用を促進するリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達を終了し、受容体の脱感作と最終的に内面化に 。Β arrestins は G タンパク質シグナル8に依存しないその他のシグナル伝達経路を引き起こすことができる多分子複合体を形成することがあります。
ケモカイン受容体、G私の亜科内-結合 CXCR4 は GPCR 創薬のための有望なターゲットとして多くの関心を引き起こした。ひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の 1 の主要な共受容体としての確立された役割を与えられたウイルスや感染症, CXCR4 をターゲット化合物最初抗 HIV 薬候補9として開発されました。最近では、証拠の成長するボディを指摘している重要な役割 CXCR4 の腫瘍もよく検証された治療上のターゲットを作る腫瘍や癌の転移で10。CXCR4 は、高いひと癌とコントロール腫瘍細胞の生存、増殖、移動および腫瘍関連血管新生10の 20 以上の種類で表されます。CXCR4 アンタゴニストの異なった化学クラス説明11,12, AMD3100 は、リンパ腫の治療中に使用される幹細胞動員エージェントとしての診療所で使用するため承認されています小さな分子のみがされていた骨髄腫患者13,14。臨床試験は、継続的な安全性と他のいくつかの CXCR4 アンタゴニスト腫瘍12に重点が異なる疾患での効果を評価します。CXCR4 アンタゴニストの多くの潜在的なアプリケーションを考えると、改善された薬物動態的特性、バイオアベイラビリティを改善した、または可能性があります少ない副作用と新規物質の探索が必要です。
ここで、キネティック蛍光ベースのアッセイは、主に使用 CXCR4 を妨げることができる化合物をスクリーニングを説明。このメソッドの蛍光測定に基づいてその内因性アゴニスト、ケモカイン リガンド (以前として知られている間質細胞由来因子 1 α (cxcl 12 CXCR4 アクティベーション時に誘発される細胞内 Ca2 +濃度の一時的な増加SDF1-α))、および潜在的な特定の混合物によってこの cxcl 12 による Ca2 +応答抑制。このアッセイ人間 CXCR4 受容体を安定に発現する U87 ひと膠芽腫細胞を使用します。同時にこれらの細胞は、CXCR7、また連結 cxcl 1215,16,17関連ケモカイン受容体の内因性表現を欠いています。CXCR7 以前も示されている CXCR4 とヘテロを形成できるとそれによってこの後者の受容器18の信号の特性を調節すること。細胞内 Ca2 + CXCR4 による媒介のレベルの変動は、CXCR4 を読み込みによって監視される蛍光 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) エステル、細胞膜透過性の高い親和性蛍光 Ca2 +による細胞の+ -色素を結合します。蛍光色 2 AM は 490 で励起されることができます単一波長の蛍光分子 520 でその発光蛍光を測定しながら nm nm。この発光蛍光 Ca2 +結合、Ca2 +の間の広いダイナミック レンジを増加-バインドし、非連結状態。蛍光信号の増加は一時的なもので、数分の時間間隔内で発生する、その後崩壊します。受容体活性化のレベルと蛍光放出さらに相関のピーク高さ。アッセイのピペッティングの手順の標準化を可能にする統合ピペッティング システムを所有している激化 CCD (ICCD) カメラを装備して蛍光マイクロ プレート リーダーを用いて自身を分析 (材料の表を参照).さらに、マイクロ プレートのすべての井戸の蛍光信号の同時測定は、使用される蛍光リーダーのもう一つ重要な利点です。最初の調査 (例えば、小分子固定濃度、希釈系列のパネル) 化合物は蛍光 2 AM に追加される試金の一部ロード CXCR4+ U87 細胞が続いて、~ 10 分潜伏期間中には、化合物の潜在的な敵対効果継続的にリアルタイムで測定されます。その後、内因性アゴニスト (すなわち、cxcl 12) CXCR4 を介した細胞内 Ca2 +のレベルの一時的な増加を換起するセルに追加されます。アッセイのこの部分の間にテストされた化合物の潜在的な敵対的活動を評価できます。図 1として概略試験の一般的なワークフローを説明します。
この Ca2 +動員アッセイは、識別し、競争力のある CXCR4 アンタゴニスト (すなわち、バインドし、受容体を刺激する内因性アゴニストを防ぐ化合物) の抑制の効力を決定に主に使用されていますがそれも受容体アゴニストを識別することができ、さらに、化合物のアロステリック サイト (すなわち、内因性アゴニストによって占められる orthosteric 結合部位とは異なる地形的サイト) で結合することによりその機能を発揮します。化合物の後者のカテゴリーには、アロステリック アゴニストおよび PAMs と NAMs19,20があります。PAMs がこの応答を強化する一方、特定の受容体拮抗薬として NAMs cxcl 12 による Ca2 +応答を阻害するが、(また見なさい議論セクション)。このメソッドは、少なくとも最小限の最適化の努力で他の Gpcr に適用できるが予想されるが、アッセイは、特にターゲット CXCR4 を記載、彼らは細胞内 Ca2 +のリリースを介して信号する場合。

<table><tbody><tr><td>Fluo-2 AM</td><td>Abcam</td><td>ab142775</td><td>蛍光Ca2+敏感染料</td></tr>プル<tr><td>ロニックF-127</td>シ<td>グマ</td><td>P2443-250G</td><td>プルロン酸</td></tr><tr>ゼ<td>ラチン</td><td>G9391</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMD3100</td><td>シグマ</td><td>A5602-5mg</td><td>特定のCXCR4拮抗薬</td></tr><tr><td>マラビロック</td><td>AnorMed</td><td></td><td>抗レトロウイルス薬、CCR5拮抗薬</td>の親切な贈り物</tr><tr><td>ケモカイン配位子 CXCL12</td><td>PeproTech</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>ケモカイン配位子 CCL5</td><td>PeproTech</td><td>300-06</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Σ</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10 x)、カルシウム、マグネシウム、フェノール赤なし</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14065-049</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %)、フェノールレッド</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ、50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ (T75)</td><td>Corning</td><td>353024</td><td></td></tr><tr><td>ブラックプレート、96ウェル、透明底、蓋付き</td><td>Costar/Fisher Scientific</td><td>10530753</td><td>アッセイプレート(96ウェル)、細胞播種用</td></tr><tr><td>ポリプロピレン(PP)プレート</td><td>Thermo Scientific (VWR)</td><td>732-2661</td><td>コンパウンドプレートとケモカインの調製に使用プレート、丸底</td></tr><tr><td>FLIPR Tetra ハイスループット細胞スクリーニングシステム</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>ピペットヘッドとICCDカメラを内蔵した蛍光プレートリーダー</td></tr><tr><td>FLIPR Tetra LEDモジュール 470-495 nm</td><td>分子デバイス</td><td>0200-6128</td><td>蛍光Ca2+高感度染料の励起用発光ダイオード</td></tr><tr><td>FLIPR Tetra Emission Filter 515-575 nm</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-6203</td><td>蛍光色素</td></tr><tr><td>FLIPR Tetra 96 Head</td><td>Molecular Devices</td><td>0310-4536</td><td>96ウェルピペッターヘッド</td></tr>と互換性のある蛍光フィルター、蛍光プレートリーダー <tr><td>ScreenWorks</td><td>Molecular Devices</td><td></td> ソフトウェアパッケージに内蔵 FLIPR Tetra Vi-CELL Beckman Coulter <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>細胞生存率アナライザー</td></tr><tr><td>でのデータ分析と可視化に使用Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td><td>Corning</td><td>3340</td><td>アッセイプレートの手動コーティングの代替品となる可能性のあるプレコート96ウェルアッセイプレートです。</td></tr></tbody></table>

キネティック蛍光ベースの ca2 +動員試金 g タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

彼らは多くの疾患に関与している、よく検証された治療的介入の対象としては G タンパク質共役受容体 (Gpcr)、製薬業界にとって非常に重要です。小さく総合的な分子、受容体の機能を阻害する具体的を含む、リード化合物の発見は新薬開発の重要な最初のステップは、敏感な具体的で、堅牢な細胞ベースのアッセイに頼る。ここで、によって運動アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) の活性化に誘発される細胞内の Ca2 +放出を抑制する受容体の拮抗薬を識別するために主に設計されている蛍光読み出しと説明、内因性リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)。この方法の主な利点は、また組み込みの敵対プロパティ (すなわち、化合物の細胞内 Ca2 +濃度がない場合 cxcl 12 の増加を誘発) 又は化合物に恵まれている化合物のスクリーニングできます。アロステリック結合部位との相互作用を介して受容体の機能を調節すること (すなわち、正と負のアロステリック変調 (Pam と NAMs、それぞれ))。ダウン側に蛍光化合物は、アッセイの読み出し、それにより信頼性の高いデータの解釈を妨げると干渉する可能性があります。最も可能性の高いこのアッセイとして実装できます、最小限の適応するの活性化は、細胞内 Ca2 +のリリースにつながる他の多くの Gpcr のジェネリック医薬品検出アッセイ。

U87 で細胞内 Ca2 +動員に cxcl 12 刺激の影響。CD4.CXCR4+と U87。CD4 細胞は、Ca2 +動員アッセイで評価されました。プロトコル (図 1) の最初の分注ステップ中に通常追加されるテスト混合物の 20 μ L、代わりにアッセイバッファーに追加された蛍光 2 AM U87 を読み込まれます。CD4.CXCR4+細胞測定プレート。2 番目の調剤手順では、濃度の異なる cxcl 12 (0.2 102.4 nM、最終濃度) 測定プレートで分配しました。蛍光、Ca2 +リリースの用量に依存する増加と相関の用量に依存して増加を示した (図 2 a)。ここでは、マイナス コントロールのサンプルを表す測定プレートに追加されたアッセイ バッファーのみ追加した両方でそれらの井戸 (すなわち、0 nM cxcl 1...

説明アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) を識別するために設計されています-エージェントを阻害するまたは競争または、アロステリックに CXCR4 活性化による細胞内 Ca2 +放出を刺激します。

キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

この細胞ベースのアッセイの全体的な目標は、Gタンパク質共役受容体を介した細胞内カルシウム動員を刺激または阻害できる分子を特定し、特性評価することです。この方法は、受容体を介した細胞内カルシウム体を修飾する分子のスクリーニングに使用できるため、Gタンパク質共役受容体創薬のための貴重なアッセイになる可能性があります。この手法の主な利点は、アゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を持つ分子を同じアッセイ内で同定できることです。このアッセイは、多くのヒト疾患で役割を果たす治療標的として有望なGタンパク質共役受容体に作用する新規薬剤候補の発見に役立つ可能性があります。細胞継代の日に、透明な底部を持つ黒壁のポリスチレン96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液をコーティングし、プレートを室温で2時間インキュベートします。ゼラチンが固化している間に、トリプシンEDTA溶液を使用して、培養フラスコの底から目的の細胞を持ち上げ、細胞が分離したら、細胞を50ミリリットルの円錐管内の新鮮な増殖培地に再懸濁します。カウント後、遠心分離によって細胞を回収し、新鮮な増殖培地でペレットを1ミリリットルあたり10〜5番目の生存細胞濃度の1倍に再懸濁します。プレートの準備ができたら、余分なゼラチン溶液を捨て、実験用ティッシュでプレートを乾燥させます。次に、ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄し、洗浄液をウェルあたり200マイクロリットルの細胞と交換して、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベーションします。翌朝、プレートを軽くたたいてウェルから増殖培地を捨て、ペーパータオルでプレートを逆さまに乾かします。次に、各ウェルの細胞をウェルあたり100マイクロリットルのローディング色素溶液で標識し、プレートを室温の暗所で45分間インキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、ケモカインプレートにウェルあたり75マイクロリットルのCXCL12を、化合物プレートの各ウェルに目的の化合物を50マイクロリットル加えます。次に、蛍光プレートリーダーのクーラーユニットの電源を入れ、続いてプレートリーダー自体の電源を入れます。システムが起動するまで数分待った後、プレートリーダーソフトウェアを開きます。アッセイプロトコルを設定するには、設定タブで読み取りモードを選択し、ローディング色素の適切な励起波長と発光波長を選択します。コンパウンドプレート内のコンパウンドを自動的に混合するための「mix with transfer fluid」タブを選択します。Transfer Fluidタブで、測定プレートに移すコンパウンドプレートの各ウェルに20マイクロリットルを設定し、ピペットチップを液体表面から20マイクロリットル下に配置します。吸引速度を毎秒50マイクロリットルに、ディスペンス速度を毎秒25マイクロリットルに設定し、トランスファーフルードで読み取りをクリックします。最初のインターバルでは、リードインターバル時間を1秒にして60リードを選択し、コンパウンドが測定プレートに分注される前に10リードを記録し、その後に50リードを完了します。読み取り間隔時間を 30 秒、読み取り回数 18 回で 2 番目の間隔を設定します。プロトコールには 3 つのチップ洗浄を選択し、各洗浄ステップに適切な洗浄液、1 回の洗浄サイクル、高速ポンプ速度、および 1 回の洗浄につき 5 回のストロークが含まれるように設定します。ピペッターの一時停止機能を使用して、ピペッターの一時停止を 300 秒に含め、Mix with Transfer Fluid 設定を使用して、ケモカインプレート内で CXCL12 溶液を自動的に混合できるようにします。後続の移送流体タブで、測定プレートに移すケモカインプレートの各ウェルから25マイクロリットルを設定し、先端を液体表面の20マイクロリットル下に配置します。吸引速度を毎秒50マイクロリットルに設定し、ディスペンス速度を毎秒25マイクロリットルに設定します。[Transfer Fluid] ボタンを使用して、最初の間隔を 145 回の読み取りと 1 秒の読み取り間隔に設定します。2 番目の間隔を 6 秒の読み取り間隔と 20 回の読み取りに設定します。さらに3つのウォッシュチップサイクルを選択します。次に、[ステージ温度の設定]をクリックし、デバイスの温度を摂氏37度に設定します。ローディング色素インキュベーションの最後に、測定プレートからバッファーを廃棄し、プレートを実験組織上で乾燥させます。アッセイバッファーのウェルあたり150マイクロリットルで細胞を洗浄し、2分後にバッファーを80マイクロリットルのアッセイバッファーと交換します。測定プレートを読み取り位置に、コンパウンドプレートをソース2の位置に、ケモカインプレートをソース3の位置に、黒いチップのボックスをソース1の位置に置きます。デバイスを閉じて[protocol signal test]をクリックし、プレート上のバックグラウンド相対光単位と蛍光分散を決定します。ポップアップウィンドウでテスト信号を選択します。8, 000 から 10, 000 の相対光単位の背景値が取得された場合は、更新を選択し、保存をクリックしてメインプロトコルを保存します。次に、run を押してアッセイを開始します。このグラフでは、カルシウムの放出の用量依存的な増加と相関する蛍光の用量依存的な増加が観察できます。CXCL12誘導蛍光のレベルが増加すると、ケモカインの追加添加後の最初の測定とプロトコルの最終測定との間のベースラインに対する最小応答と最大応答の差に基づいて、用量応答曲線を生成できます。対応する機能的ケモカイン受容体CXCR4を欠損した細胞を用いた場合、高濃度でもCXCL12による蛍光カルシウム関連応答は誘発されず、CXCL12誘発測定の受容体特異性が実証された。この細胞ベースのアッセイの主な用途は、プレインキュベーション後に、応答を阻害しない制御の非活性化合物と比較して、細胞内のCXCL12誘導性カルシウム動員を用量依存的に阻害する小分子を同定することです。低分子の阻害効力を決定するために、非線形回帰を使用して阻害分子の用量反応曲線を生成できます。このアッセイは、他のGタンパク質共役受容体の研究に使用でき、さらなる最適化はまったくまたは最小限で、また、別のケモカイン受容体であるCCR5をその天然ケモカインアゴニストCCL5で刺激したときに蛍光の用量依存的な増加が観察されたこの実験でも使用できます。この手法を習得すると、受容体の活性化時に細胞内カルシウムイオンの動員を介してシグナルを送る他の多くのGタンパク質共役受容体の研究に使用できます。このビデオを見れば、この細胞アッセイを使用してCXCL4ケモカイン受容体のアゴニストとアンタゴニストを同定する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

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Medicine

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Gタンパク質依存性内向き整流Kと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニングの手順...

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

このビデオは、CXCR4ケモカイン受容体を発現する膠芽腫細胞を含む細胞アッセイを示しています。このアッセイでは、カルシウム感受性色素を使用して、薬剤の相互作用による蛍光変化を測定し、細胞シグナル伝達ダイナミクスに関する洞察を提供します。...

CXCR4相互作用因子の同定のための細胞アッセイ

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。...

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

ここで説明する蛍光に基づくカルシウム動員アッセイは、オーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の機能的に活性化するリガンド（単数または複数）の同定のための培地スループット逆薬理スクリーニングシステムである。...

蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Gタンパク質共役受容体によるGタンパク質の選択的活性化を検出する簡単な方法は、細胞シグナル伝達における未解決の課題です。ここでは、GPCRとGタンパク質ペプチドをペアワイズテザリングして、生細胞の制御された濃度でのコンフォメーション変化を調べることにより、Fӧrster共鳴エネルギー移動(FRET)バイオセンサーを開発しました。...

ライブ細胞懸濁液の蛍光光度アッセイでFRETセンサーを用いて測定したGタンパク質選択的なGPCRの立体配座

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)...

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

GPCR-β-アレスチン相互作用は、GPCR創薬における新興分野である。このような生きたシステムの相互作用を監視するには、正確で正確で簡単に設定する方法が必要です。我々は、リアルタイム生細胞におけるGPCR-β-アレスチン相互作用を監視する構造補体アッセイを示し、あらゆるGPCRに拡張することができる。...

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

GPCRは、魅力的な薬剤の標的であることを考えると、GPCRリガンドスクリーニングは、リード化合物の同定や脱孤児化研究に不可欠です。これらの取り組みに向けて、TEVベースのレポーターアッセイを用いて約300...

β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

このプロトコルは、Gタンパク質共役型受容体リガンド刺激による生HEK293細胞におけるGタンパク質活性化のリアルタイム測定のためのBRITベースのバイオセンサーの使用について説明しています。ここでは、β2-アドレナリン受容体とカンナビノイド1型受容体を例として、いくつかのGタンパク質サブタイプおよびさまざまなGPCRにわたるセンサーの効率を実証します。...

生細胞におけるGタンパク質共役受容体活性を測定するためのBRITベースのGタンパク質バイオセンサー

学ぶキネティック蛍光ベースのCa²⁺動員試金法で、Gタンパク質共役受容体（GPCR）のアゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別する方法です。CXCR4を用いた細胞ベースアッセイにより、創薬研究に有用なスクリーニング技術を習得できます。

キネティック蛍光ベースの Ca^{2 +}動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

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