キネティック蛍光ベースの Ca^{2 +}動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

この細胞ベースのアッセイの全体的な目標は、Gタンパク質共役受容体を介した細胞内カルシウム動員を刺激または阻害できる分子を特定し、特性評価することです。この方法は、受容体を介した細胞内カルシウム体を修飾する分子のスクリーニングに使用できるため、Gタンパク質共役受容体創薬のための貴重なアッセイになる可能性があります。この手法の主な利点は、アゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を持つ分子を同じアッセイ内で同定できることです。

このアッセイは、多くのヒト疾患で役割を果たす治療標的として有望なGタンパク質共役受容体に作用する新規薬剤候補の発見に役立つ可能性があります。細胞継代の日に、透明な底部を持つ黒壁のポリスチレン96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液をコーティングし、プレートを室温で2時間インキュベートします。ゼラチンが固化している間に、トリプシンEDTA溶液を使用して、培養フラスコの底から目的の細胞を持ち上げ、細胞が分離したら、細胞を50ミリリットルの円錐管内の新鮮な増殖培地に再懸濁します。

カウント後、遠心分離によって細胞を回収し、新鮮な増殖培地でペレットを1ミリリットルあたり10〜5番目の生存細胞濃度の1倍に再懸濁します。プレートの準備ができたら、余分なゼラチン溶液を捨て、実験用ティッシュでプレートを乾燥させます。次に、ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄し、洗浄液をウェルあたり200マイクロリットルの細胞と交換して、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベーションします。

翌朝、プレートを軽くたたいてウェルから増殖培地を捨て、ペーパータオルでプレートを逆さまに乾かします。次に、各ウェルの細胞をウェルあたり100マイクロリットルのローディング色素溶液で標識し、プレートを室温の暗所で45分間インキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、ケモカインプレートにウェルあたり75マイクロリットルのCXCL12を、化合物プレートの各ウェルに目的の化合物を50マイクロリットル加えます。

次に、蛍光プレートリーダーのクーラーユニットの電源を入れ、続いてプレートリーダー自体の電源を入れます。システムが起動するまで数分待った後、プレートリーダーソフトウェアを開きます。アッセイプロトコルを設定するには、設定タブで読み取りモードを選択し、ローディング色素の適切な励起波長と発光波長を選択します。

コンパウンドプレート内のコンパウンドを自動的に混合するための「mix with transfer fluid」タブを選択します。Transfer Fluidタブで、測定プレートに移すコンパウンドプレートの各ウェルに20マイクロリットルを設定し、ピペットチップを液体表面から20マイクロリットル下に配置します。吸引速度を毎秒50マイクロリットルに、ディスペンス速度を毎秒25マイクロリットルに設定し、トランスファーフルードで読み取りをクリックします。

最初のインターバルでは、リードインターバル時間を1秒にして60リードを選択し、コンパウンドが測定プレートに分注される前に10リードを記録し、その後に50リードを完了します。読み取り間隔時間を 30 秒、読み取り回数 18 回で 2 番目の間隔を設定します。プロトコールには 3 つのチップ洗浄を選択し、各洗浄ステップに適切な洗浄液、1 回の洗浄サイクル、高速ポンプ速度、および 1 回の洗浄につき 5 回のストロークが含まれるように設定します。

ピペッターの一時停止機能を使用して、ピペッターの一時停止を 300 秒に含め、Mix with Transfer Fluid 設定を使用して、ケモカインプレート内で CXCL12 溶液を自動的に混合できるようにします。後続の移送流体タブで、測定プレートに移すケモカインプレートの各ウェルから25マイクロリットルを設定し、先端を液体表面の20マイクロリットル下に配置します。吸引速度を毎秒50マイクロリットルに設定し、ディスペンス速度を毎秒25マイクロリットルに設定します。

[Transfer Fluid] ボタンを使用して、最初の間隔を 145 回の読み取りと 1 秒の読み取り間隔に設定します。2 番目の間隔を 6 秒の読み取り間隔と 20 回の読み取りに設定します。さらに3つのウォッシュチップサイクルを選択します。

次に、[ステージ温度の設定]をクリックし、デバイスの温度を摂氏37度に設定します。ローディング色素インキュベーションの最後に、測定プレートからバッファーを廃棄し、プレートを実験組織上で乾燥させます。アッセイバッファーのウェルあたり150マイクロリットルで細胞を洗浄し、2分後にバッファーを80マイクロリットルのアッセイバッファーと交換します。

測定プレートを読み取り位置に、コンパウンドプレートをソース2の位置に、ケモカインプレートをソース3の位置に、黒いチップのボックスをソース1の位置に置きます。デバイスを閉じて[protocol signal test]をクリックし、プレート上のバックグラウンド相対光単位と蛍光分散を決定します。ポップアップウィンドウでテスト信号を選択します。

8, 000 から 10, 000 の相対光単位の背景値が取得された場合は、更新を選択し、保存をクリックしてメインプロトコルを保存します。次に、run を押してアッセイを開始します。このグラフでは、カルシウムの放出の用量依存的な増加と相関する蛍光の用量依存的な増加が観察できます。

CXCL12誘導蛍光のレベルが増加すると、ケモカインの追加添加後の最初の測定とプロトコルの最終測定との間のベースラインに対する最小応答と最大応答の差に基づいて、用量応答曲線を生成できます。対応する機能的ケモカイン受容体CXCR4を欠損した細胞を用いた場合、高濃度でもCXCL12による蛍光カルシウム関連応答は誘発されず、CXCL12誘発測定の受容体特異性が実証された。この細胞ベースのアッセイの主な用途は、プレインキュベーション後に、応答を阻害しない制御の非活性化合物と比較して、細胞内のCXCL12誘導性カルシウム動員を用量依存的に阻害する小分子を同定することです。

低分子の阻害効力を決定するために、非線形回帰を使用して阻害分子の用量反応曲線を生成できます。このアッセイは、他のGタンパク質共役受容体の研究に使用でき、さらなる最適化はまったくまたは最小限で、また、別のケモカイン受容体であるCCR5をその天然ケモカインアゴニストCCL5で刺激したときに蛍光の用量依存的な増加が観察されたこの実験でも使用できます。この手法を習得すると、受容体の活性化時に細胞内カルシウムイオンの動員を介してシグナルを送る他の多くのGタンパク質共役受容体の研究に使用できます。

このビデオを見れば、この細胞アッセイを使用してCXCL4ケモカイン受容体のアゴニストとアンタゴニストを同定する方法を十分に理解できるはずです。