Name: ジカ特定診断エピトープの探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶジカウイルス特異的ペプチドの探索法。高密度ペプチドマイクロアレイを用いてIgM・IgG抗体を検出し、感染時期を特定する診断技術を習得できます。他の新興感染症への応用も可能です。

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現在のサポートは、NIDCRR44 DE024456 から SBIR (中小企業技術革新研究) 管理サプリメント補助金によって提供されます。NIDCR から進化した NIDCR HIV 助成金は、HIV の検証ポイント ・ オブ ・ ケア診断の開発の u01 で DE017855 を付与します。我々 は感謝して彼女のテクニカル サポートと親切なサポートのためシルク Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) を認めます。我々 はまた、李 COR オデッセイ イメージング システムの NYU Langone 医療センターを感謝します。

これらのデータ、ニューヨーク大学歯学部で進行中の研究調査の一部であり、ニューヨーク大学医学部、IRB の制度検討委員会によって承認された # H10 01894。本研究で使用される臨床サンプルは、従来の診断とアクセス許可から、ワズワース センターのニューヨーク州保健省、アルバニー、ニューヨーク デ識別のサンプルです。
1. 特定のインキュベーション トレイで ZIKV 高密度ペプチド マイクロ アレイ スライドをインストール
<ol><li>パウダー フリーの手袋を使用して端をスライド ガラスを処理します。ガラス スライドの寸法は、75.4 mm 25.0 mm、厚の 1 mm です。マイクロ アレイ面とインキュベーション トレイにスライドを配置します。</li>
	<li>マイクロ アレイの印刷面に下向きのシールの光沢のある面を置きます。良い位置を確保するため、シールとベース プレートのネジ穴が重なります。</li>
	<li>マイクロ アレイの商工会議所を作成には、シールの上にトレイの上の部分を配置します。</li>
	<li>締め付けによって均等に蝶ネジ 1 つの別の後続いて右下左上から交互に手でトレイにスライドを固定します。インキュベーション トレイのふたを配置します。</li>
</ol>2. 背景の相互作用検出: 染色二次抗体のマイクロ アレイ
注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (標準およびブロック バッファー、希釈した二次抗体) を入金するのにピペットを使用します。
<ol><li>標準的なバッファー (1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、0.05% Tween 20、pH 7.4 では、0.45 μ m フィルターでフィルタ リング) とマイクロ アレイを孵化させなさい (合計 2,000 μ L/マイクロ アレイのボリューム) 140 rpm で軌道シェーカーで室温 (RT) で 15 分。</li>
	<li>標準的なバッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。マイクロ アレイ スライドの破損を防ぐために空白のスライドを持つ空のスライド ホルダーを入力します。</li>
	<li>140 rpm で軌道シェーカーで RT で 60 分のブロック バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) をマイクロ アレイをブロックします。</li>
	<li>ブロックのバッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。</li>
	<li>二次抗体、抗ひと IgM 螢光色素共役とマイクロ アレイを孵化させなさい、染色で希釈 1: 5,000 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) が 140 で軌道シェーカーで暗闇の中で常温 30 分 (標準的なバッファー内のバッファーをブロック 10%) をバッファーrpm。</li>
	<li>二次抗体を削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。</li>
	<li>3 マイクロ アレイを洗う x、標準的なバッファー (マイクロ アレイ μ L 2,000/140 rpm で軌道シェーカーで RT の総体積洗浄あたり 1 分。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。</li>
	<li>スライド 2 を浸す作りたて浸漬バッファー (1 mM トリス、pH 7.4) x, (200 mL の合計容積)。</li>
	<li>スライドの表面に触れることがなくスライドの下部に上部から非常に慎重に余分な水分を吸引して、約 1 分の慎重に、マイクロ アレイを乾燥します。マイクロ アレイ スキャナー リーダーのスライドを分析します。</li>
</ol>3. 血清をホストするマイクロ アレイの露出
注意: は、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 血清検体の潜在的な感染性のための研究所安全性条件の下でこの手順を実行します。クラス II 生物学的安全キャビネット (BSC) 内で動作します。
<ol><li>30 分 56 ° C で血清サンプルと 16,000 rcf134 ° C で 5 分間遠心分離を不活性化します。 注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (染色、標準的なバッファーと希釈血清) を入金するのにピペットを使用します。</li>
	<li>縮尺 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の希釈から始まる染色バッファーの血清サンプルを希釈します。使用するまで 4 ° C でそれを維持します。</li>
	<li>染色バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) とマイクロ アレイ 140 rpm で軌道シェーカーで RT で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>染色バッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。</li>
	<li>140 rpm で軌道シェーカー 4 ° C で一晩希釈血清サンプルのマイクロ アレイを孵化させなさい。</li>
	<li>希釈血清サンプルを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。</li>
	<li>3 マイクロ アレイを洗う x、標準的なバッファー (マイクロ アレイ μ L 2,000/140 rpm で軌道シェーカーで RT の総体積洗浄あたり 1 分。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。</li>
</ol>4. 二次抗体とラベル付きコントロール抗体染色
注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (標準的なバッファー、希薄化後の二次とラベル抗体) を入金するのにピペットを使用します。
<ol><li>染色バッファーで二次抗体を希釈します。 注: 使用抗ひと IgM 螢光色素共役抗体または抗ひと IgG 螢光色素共役抗体染色バッファーで 1:5,000 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の希釈。</li>
	<li>ミックス コントロール ラベル抗体 (モノクローナル抗-共役系螢光色素を HA) の縮尺 (2 000 μ L/マイクロ アレイの全容積) 以前染色バッファーで希釈した二次抗体染色バッファーで希釈。</li>
	<li>マイクロ アレイを用いた 140 rpm で軌道シェーカーで暗闇の中で常温 30 分で孵化させなさい。</li>
	<li>希釈した二次とラベル抗体のミックスを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。</li>
	<li>標準バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の 3 倍を洗います。各洗浄は 140 rpm で軌道シェーカーで 1 分です。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。</li>
</ol>5. マイクロ アレイのスキャン
<ol><li>スライド 2 を浸す作りたて浸漬バッファー (1 mM トリス、pH 7.4) (200 mL の合計容積) に x。</li>
	<li>慎重に、マイクロ アレイをドライ スライドの表面に触れることがなくスライドの下部に上部から非常に慎重に吸引で約 1 分。</li>
	<li>スキャナーの指示に従ってマイクロ アレイをスキャンします。印刷面をスキャナーの上にスライドを配置します。</li>
	<li>新しいプロジェクトを作成し、スキャンする領域を選択します。スキャナーとしてのパラメーターを設定: 解像度: 21 μ m、700 と 800 nm チャンネルの強度: 7.0、スキャン品質: 媒体およびオフセット: 0.8。</li>
	<li>取得し、16 ビット グレースケール TIFF ファイル形式としてスキャンの raw 画像を保存します。</li>
</ol>6 特定のソフトウェアを使用してマイクロ アレイ解析
<ol><li>Raw 画像 (TIFF イメージ) を開きます。アレイ グリッド ファイルを開きます。</li>
	<li>コンピューターのマウスまたはキーボードの矢印キーでスキャン画像を配列グリッドに合わせます。</li>
	<li>各スポットの信号の強さ、背景値、および対応するペプチド配列を含む読み出しファイルを作成する特定のソフトウェアで「定量化選択」を選択します。 注意: この出力ファイルは、追加の分析とグラフ作成のスプレッドシート ・ プログラムにインポートもできます。</li>
</ol>7. マイクロ アレイ ストレージ
<ol><li>酸素遊離窒素またはアルゴン ガス下の 4 ° C で暗闇の中で密封されたマイクロ アレイを格納します。</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ジカ ウイルス蛋白質シーケンス (フランス ポリネシアひずみ) の全体を含む高密度ペプチド マイクロ アレイを利用したプロトコルを考案しました。マイクロ アレイは、印刷 3,423 異なる重複線形ペプチドによって製造されました。各ペプチド 15 アミノ酸とシーケンス (すなわち、14 残重複) 最も近い隣人から 1 つだけ残基によって変化します。短い重複を印刷することができます、エピトープ マッピングは長く重複とより正確です。各ペプチドは、信頼性を高めるため重複でプリントしました。
あらかじめ染色可能な背景の相互作用を検出し、サンプルの特定の信号からそれらを区別するために二次抗体のマイクロ アレイを持つプロセスを開始することが欠かせません。特定のブロック バッファーを使用してもウシ血清アルブミン (BSA) または乾燥ミルクの粉は減らされた信号強度につながるような他のブロック バッファーとして重要です。ZIKV IgM 抗体のための検証済み血清サンプルされた縮尺でマイクロ アレイと培養したが、信号は検出されなかった。1: 500 の低希釈でその後インキュベーション...

デング熱とチクングニア ウイルス感染1ベクトル、地理的分布と症状で共有ために臨床症状に基づくジカ ウイルス (ZIKV) の診断が困難します。妊娠中に ZIKV に感染している女性の妊娠における有害転帰のリスクを考えると、3 つのウイルスを区別することが重要です。現在の分子診断テストが特定、のみ便利です血液や唾液で急性感染症2,3の比較的短い期間の間に。血清学的アッセイは、感染4のこの最初の期間の外の診断に不可欠です。
ZIKV 特定の血清学的アッセイの開発が困難になる 2 つの理由: 最初に、人間の免疫システムの応答にジカ抗原は現在知られていない;そして第二に、保存された発現アミノ酸抗体の交差反応を誘導します。私たちの目的は、診断で使用するユニークな ZIKV 特定ペプチドを発見するだった。カバーのバクテリオファージ、細菌などを含む全体の蛋白質画面ペプチド ライブラリに異なるアプローチが開発され、酵母表層ディスプレイ5,6,7,8,9、 10。当社の戦略により、迅速かつ安価な高スループットの血清学的上映11,12高密度ペプチド マイクロ アレイを使用して血清学的現在を改善するために識別されたペプチドを使用ことができますその後ZIKV 感染症の検出のための試金。
このプロトコルは、高密度ペプチド マイクロ アレイ (図 1) を用いたジカ ウイルス特定診断ペプチドの探索を有効。 にします。高密度ペプチド マイクロ アレイは、ペプチドのレーザー印刷技術を使用して製作されました。3,423 アミノ酸残基から成る全体 ZIKV 蛋白質順序はフランスのポリネシアのひずみに基づいて (GenBank: KJ776791.2)、14 アミノ酸残基の重複の重複で 15 線形残基のブロックの標準的なガラス スライドをプリントした、6,846 ペプチド スポットの合計。全体ジカ タンパク質配列ペプチドに加えて、マイクロ アレイを利用インフルエンザ血球凝集素内部統制 (HA) ペプチド。
ジカ検証正ワズワース中心 (アルバニー、ニューヨーク) から得られた血清サンプルは特定の免疫グロブリン M (IgM) および免疫グロブリン G (IgG) 反応性ペプチドを識別するために使用されました。サンプルで一晩インキュベート後、マイクロ アレイだった二次螢光色素共役抗体 (抗ひと igm 抗体または抗ひと IgG) で染色し、マイクロ アレイ スキャナー解析。マイクロ アレイを製造する同じ会社によって提供される特定のソフトウェア スポット強度とペプチド アノテーションの定量化を行った。

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP カスタムペプチドマイクロアレイ</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>カスタムペプチドマイクロアレイ:当社のマイクロアレイには、ジカウイルスタンパク質配列全体が含まれています</td></tr><tr><td>PEPperCHIP インキュベーショントレイ 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP 染色キット (680 nm) (抗HA、DyLightラベリング)</td> <td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>Windows</td></tr><tr><td>Rockland Blocking buffer</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IgM (mu chain) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shakerデバイス</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 デジタルマイクロタイターシェーカー</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ジカ特定診断エピトープの探索

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

高密度ペプチド マイクロ アレイは、単一の標準顕微鏡スライドの 6000 以上のペプチドのスクリーニングを許可します。このメソッドは薬剤の発見、治療標的の同定、開発を適用ことができます診断の。ここでは、高密度ペプチド マイクロ アレイを用いた特定ジカ ウイルス (ZIKV) 診断ペプチドを発見するためのプロトコルを提案する.ZIKV 感染は 14 aa 残重複 3,423 ユニークな 15 直線のアミノ酸 (aa) 残基に変換全体 ZIKV タンパク質を含む高密度ペプチド マイクロ アレイと孵化させるを検証ひと血清サンプルで重複して印刷されます。同じアレイ内で異なる二次抗体で染色、免疫グロブリン M (igm 抗体)、免疫グロブリン G (IgG) 抗体が血清中に存在するペプチドを検出しました。これらのペプチドは、さらに検証実験のために選ばれました。このプロトコルではデザイン、処理、および高密度ペプチド マイクロ アレイの分析に続いて戦略について述べる。

説明されたプロトコルを使用して得られた結果は、図 2に示すと図 3。事前二次抗ひと IgM (データは示されていない) とマイクロ アレイを汚した場合、背景の相互作用はみられなかった。抗ひと igm 抗体染色結果背景緑色蛍光強度、ホスト血清サンプル (図 2) では IgM とこれらのペプチドの結合を示す上記のいくつかの領域。IgG の検出 (赤い蛍光性信号) は、のみいくつかペプチド (図 2) を明らかにしました。
マイクロ アレイを製造する同じ会社によって提供される特定のソフトウェアは、スキャンした後、マイクロ アレイを分析します。作成された読み出しファイルには、各スポットの信...

このプロトコルでは高密度ペプチド マイクロ アレイを用いたジカ ウイルス特定診断ペプチドを発見する手法について述べる。このプロトコルは、他の新興感染症に立ち向かえない適合できます。

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

この実験の全体的な目標は、ジカウイルス抗体を検出するための診断アッセイで使用するジカウイルス特異的ペプチドを同定することです。ウイルスは約10日で血液から消えますが、抗体は何年も持続するため、これは非常に重要です。この方法により、ジカウイルスプロテオーム全体のマイクロアレイを利用して抗原とエピトープを同定し、感染者の血清サンプル中にIgM抗体またはIgG抗体を捕捉するペプチドを同定することができます。初期の抗体であるIgMとその後の抗体であるIgGの両方を検出する主な利点は、臨床医に感染のタイムラインを提供することです。そして、これは妊娠中の女性にとって特に重要です。このプロトコルは、ジカウイルス感染の原因についての洞察を提供しますが、そのタンパク質配列がわかっている場合は、その病原体に特異的なマイクロアレイを使用して、他の病原体に適用することができます。パウダーフリーの手袋を使用して、スライドガラスの端で取り扱います。スライドガラスの寸法は75.4mm×25.0mm、厚さは1mmです。スライドをマイクロアレイ表面を上にしてインキュベーショントレイに置きます。空のスライドホルダーに空白のスライドを埋めて、マイクロアレイスライドが壊れないようにします。シールの光沢のある面を下に向けて、マイクロアレイの印刷面に置きます。良好な位置を確保するために、シールとベースプレートのネジ穴を重ねます。トレイの上部をシールに載せて、マイクロアレイチャンバーを作成します。つまみネジを手で交互に均等に締めて、スライドをトレイに固定します。左上から始めて、右下に進みます。ふたをインキュベーショントレイに置きます。マイクロアレイの表面を傷つけないようにするには、マイクロアレイを慎重に取り扱うことが不可欠です。溶液は、マイクロアレイチャンバーの隅に追加され、その後、除去されます。マイクロアレイを乾燥させることも、良好なスキャン画像を得るために重要です。マイクロアレイをマイクロアレイあたり2, 000マイクロリットルの標準バッファーと室温で140rpmの軌道シェーカーで15分間インキュベートします。マイクロアレイチャンバーの角からピペットで吸引して標準バッファーを取り出し、140rpmのオービタルシェーカーで室温で60分間ブロッキングバッファーでマイクロアレイをブロックします。マイクロアレイチャンバーの角からピペットで吸引して、ブロッキングバッファーを除去します。染色バッファーで1:5, 000に希釈した抗ヒトIgM蛍光色素標識二次抗体をマイクロアレイに加えます。次に、マイクロアレイを室温で30分間、暗所で140rpmのオービタルシェーカー上でインキュベートします。ピペットを使用して、マイクロアレイチャンバーの角から吸引することにより、二次抗体を除去します。マイクロアレイを2000マイク

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

12ウェルプレートを用い、1ウェルあたり1 x 10⁵個の未感染Vero細胞を2 mlの容量で播種する。翌日、無血清培地を用いて、低タイターおよび高タイターのウイルス接種液（感染多重度（MOI）を0.01および0.1とし、1ウェルあたり400 µl）を3連で調製する。模擬感染（モック感染）には、無血清培地のみ（1ウェルあたり400 µl）を使用する。接種したプレートを37 °C、5% CO₂条件下で4〜6時間インキュベートする。1時間ごとにプレートをゆっくりと左右に傾け、接種液を広げる。インキュベーション終了後、接種液を血清添加培地（1ウェルあたり2 ml）に交換する。48時間および96時間の時点で、免疫細胞化学（ICC）用のサンプルを回収する。メタノール固定した細胞を用いてICCを行う。固定した細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、ICCブロッキングバッファー（PBS含有3%ヤギ血清、3%ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1% Triton-x 100）でブロッキングする。マウスモノクローナル抗dsRNA抗体J2（1...

免疫細胞化学によるジカウイルスdsRNA複製中間体の検出

ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。...

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。...

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ジカ ウイルス (ZIKV) のための Ifnar1-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官の抗原特異的 T 細胞応答を評価するためのプロトコルを説明します。このメソッドは、有効性評価の貴重なも ZIKV...

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染症の定量化、ひと初代細胞、ひと血清を用いたデング ウイルスに対する耐性が既存のジカ...

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

このプロトコルの目的は、感染後にマウスの複数の器官からジカウイルスを分離および定量化することによってウイルス性疾患を調査するために使用される技術を実証することです。...

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

本研究では、ハイスループットスクリーニング形式でジカウイルス複製の阻害剤をスクリーニングするための、レビコンベースおよびウイルス酵素ベースのアッセイで使用されるプロトコルについて説明する。...

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。...

アルボウイルスに対する抗体応答の検出のためのマルチプレックス血清学的アッセイ

学ぶジカウイルス特異的ペプチドの探索法。高密度ペプチドマイクロアレイを用いてIgM・IgG抗体を検出し、感染時期を特定する診断技術を習得できます。他の新興感染症への応用も可能です。

ジカ特定診断エピトープの探索

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