ジカ特定診断エピトープの探索

この実験の全体的な目標は、ジカウイルス抗体を検出するための診断アッセイで使用するジカウイルス特異的ペプチドを同定することです。ウイルスは約10日で血液から消えますが、抗体は何年も持続するため、これは非常に重要です。この方法により、ジカウイルスプロテオーム全体のマイクロアレイを利用して抗原とエピトープを同定し、感染者の血清サンプル中にIgM抗体またはIgG抗体を捕捉するペプチドを同定することができます。

初期の抗体であるIgMとその後の抗体であるIgGの両方を検出する主な利点は、臨床医に感染のタイムラインを提供することです。そして、これは妊娠中の女性にとって特に重要です。このプロトコルは、ジカウイルス感染の原因についての洞察を提供しますが、そのタンパク質配列がわかっている場合は、その病原体に特異的なマイクロアレイを使用して、他の病原体に適用することができます。

パウダーフリーの手袋を使用して、スライドガラスの端で取り扱います。スライドガラスの寸法は75.4mm×25.0mm、厚さは1mmです。スライドをマイクロアレイ表面を上にしてインキュベーショントレイに置きます。

空のスライドホルダーに空白のスライドを埋めて、マイクロアレイスライドが壊れないようにします。シールの光沢のある面を下に向けて、マイクロアレイの印刷面に置きます。良好な位置を確保するために、シールとベースプレートのネジ穴を重ねます。

トレイの上部をシールに載せて、マイクロアレイチャンバーを作成します。つまみネジを手で交互に均等に締めて、スライドをトレイに固定します。左上から始めて、右下に進みます。

ふたをインキュベーショントレイに置きます。マイクロアレイの表面を傷つけないようにするには、マイクロアレイを慎重に取り扱うことが不可欠です。溶液は、マイクロアレイチャンバーの隅に追加され、その後、除去されます。

マイクロアレイを乾燥させることも、良好なスキャン画像を得るために重要です。マイクロアレイをマイクロアレイあたり2, 000マイクロリットルの標準バッファーと室温で140rpmの軌道シェーカーで15分間インキュベートします。マイクロアレイチャンバーの角からピペットで吸引して標準バッファーを取り出し、140rpmのオービタルシェーカーで室温で60分間ブロッキングバッファーでマイクロアレイをブロックします。

マイクロアレイチャンバーの角からピペットで吸引して、ブロッキングバッファーを除去します。染色バッファーで1:5, 000に希釈した抗ヒトIgM蛍光色素標識二次抗体をマイクロアレイに加えます。次に、マイクロアレイを室温で30分間、暗所で140rpmのオービタルシェーカー上でインキュベートします。

ピペットを使用して、マイクロアレイチャンバーの角から吸引することにより、二次抗体を除去します。マイクロアレイを2000マイクロリットルで1分間、マイクロアレイあたりの標準バッファーで1分間、室温で140rpmのオービタルシェーカーで洗浄します。実証済みの手法を使用して標準バッファーを取り出し、洗浄を2回繰り返します。

次に、スライドを200ミリリットルの新しく調製した浸漬緩衝液に2回浸します。スライド表面に触れないように、スライドの上部から下部にかけて余分な液体を非常に慎重に吸引することにより、マイクロアレイを約1分間慎重に乾燥させます。このビデオの後半で示すように、マイクロアレイスキャナーリーダーでスライドを分析します。

血清サンプルを摂氏56度で30分間不活化します。.次に、サンプルを16, 000 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。サンプルは使用まで摂氏4度に保ちます。

次に、マイクロアレイを染色バッファーと室温で15分間、140rpmのオービタルシェーカーでインキュベートします。マイクロアレイチャンバーの角からピペットで吸引して、染色バッファーを除去します。血清サンプルと染色バッファーを1:1, 000の希釈液から希釈します。

希釈したサンプルをマイクロアレイと140rpmのオービタルシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。実証された手法を使用して希釈した血清サンプルを取り出します。その後、前と同じようにマイクロアレイを3回洗浄します。

二次抗体を染色バッファーで希釈します。抗ヒトIgM蛍光色素標識抗体または抗ヒトIgG蛍光色素標識抗体を1:5, 000の希釈で染色緩衝液で使用します。次に、コントロール標識抗体を染色バッファー中で1:1000の希釈で、希釈した二次抗体と混合します。

マイクロアレイと室温、暗所で30分間インキュベートし、140 rpmのオービタルシェーカーでインキュベートします。希釈した二次抗体と標識抗体の混合物を、マイクロアレイチャンバーの角からピペットで吸引して取り出します。次に、マイクロアレイを標準バッファーで3回洗浄します。

各洗浄は、140rpmのオービタルシェーカーで1分間行われます。最後に、前回と同様にマイクロアレイチャンバーから洗浄バッファーを取り出します。マイクロアレイスキャンを行うには、スライドを新たに調製した200ミリリットルの浸漬バッファーに2回浸します。

スライド表面に触れないように、スライドの上部から下部に向かって非常に慎重に吸引することにより、マイクロアレイを約1分間乾燥させます。スキャナーの指示に従ってマイクロアレイをスキャンします。スライドを印刷面を上にしてスキャナーに置きます。

新しいプロジェクトを作成し、スキャン領域を選択します。スキャナーのパラメーターを、解像度21ミクロン、700ナノメートルと800ナノメートルのチャンネルの両方で強度7.0、スキャン品質を中程度、オフセット0.8で設定します。スキャン描画画像を16ビットグレースケールTIFファイル形式で取得して保存します。

データを分析するには、生の画像を開きます。次に、配列グリッドファイルを開きます。コンピュータのマウスまたはキーボードの矢印キーを使用して、アレイグリッドをスキャンイメージに合わせます。

特定のソフトウェアで選択の定量化を選択すると、各スポットのシグナル強度、バックグラウンド値、および対応するペプチド配列を含む読み出しファイルが作成されます。最後に、マイクロアレイを4°Cの暗闇で密閉し、無酸素窒素またはアルゴンガス下で保管します。ここに示されているのは、1:250に希釈した特定のジカウイルス血清サンプルとインキュベートした後、マイクロアレイを抗ヒトIgGで染色した生の蛍光画像です。

HA制御ペプチドはマイクロアレイを組み立てます。IgGに強く反応するペプチドは、ズームパネルに表示されます。同様に、ここに示されているのは、1:250に希釈した特定のジカウイルス血清サンプルとインキュベートした後、マイクロアレイを抗ヒトIgMで染色した生の蛍光画像です。

ここでも、HA制御ペプチドがマイクロアレイを組み立てます。IgMに強く反応するペプチドは、ズームパネルに表示されます。ここに示されているのは、宿主血清サンプルペプチド中のIgMと反応する代表的なジカウイルスエピトープコンセンサス配列です。

エピトープコンセンサス配列のペプチドは赤で強調表示され、蛍光強度が最も高いペプチドは太字でマークされています。このビデオを見れば、高密度ペプチドマイクロアレイの処理方法について十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば24時間で実行できます。

この手順を試みるときは、マイクロアレイの表面を傷つけないように、マイクロアレイを慎重に取り扱うことを忘れないでください。この手順に続いて、ELISAや表面プラズモン共鳴結合アッセイなどの他の方法を実行して、同定されたペプチドがジカウイルス抗体に特異的に結合し、他のフラビウイルス抗体には結合しないかどうかを判断できます。この技術の開発により、診断学分野の研究者が血清や唾液検体を用いた診断ペプチドの発見に道を開くことになります。

ジカウイルスのような感染性病原体を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、血清サンプルの熱不活化やバイオセーフティレベル2の施設での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。