Name: 生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶ、フィーダーフリー系を用いたマウスナチュラルキラー細胞の大量培養法。骨髄由来細胞から高純度NK細胞を産生し、遺伝子サイレンシングとがん免疫療法研究に応用する革新的な手法です。

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本研究は研究-香港中文大学 (2016.035) と香港の学者の研究助成評議会の香港 (GRF 468513、12 r CUHK3/CRF) と革新と技術香港ファンド (ITS InP/164/16、ITS/227/15 ITS-InP/242/16)、直接助成金によって支えられました。プログラム。
H. Y.L. 設計しすべての実験を監督し、原稿の準備に貢献しました。午後-高橋啓介実験データを分析、原稿の準備に貢献しました。P. C. T.J.Y. ・ FC、t. j. s. c.、h.、Q.-m. w.、G. Y.L. 動物試料を収集し、動物実験に参加したと。X.-相対湿度、j. s. k. エフティが原稿を準備するに貢献したと。

プロトコル細胞 (BM NK) の取得と骨髄由来 NK を区別するは、以前に公開された方法20,21,22に基づいています。マウスですべてのプロシージャによって、動物倫理実験委員会 (AEEC) 香港の中国大学を承認されています。
1. OP9 条件付き媒体の作製
<ol><li>20 %fbs、100 U/mL ペニシリン G および加湿雰囲気空気/CO2の 37 ° C で、100 μ g/mL ストレプトマイシンを含むアルファ MEM でマウス間質細胞株 OP9 を文化 (95%: 5%)。<ol>
<li>検定、種子 2 x 106 OP9 細胞各 75 cm2培養用フラスコの中の 15 ml のセルをカウントします。48 h のカルチャです。</li>
		<li>文化では、80% の合流点に達すると、10 ml の PBS のフラスコを洗ってフラスコあたり (FBS と抗生物質) なしプレーン アルファ MEM 培地 20 mL を加えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h で培養用フラスコから OP9 条件媒体を収集、0.25 μ m ポリエーテルサルホン (PES) フィルターと細胞の残骸をきれいおよび 4 ° c (使用 2 週間以内) を保持します。</li>
</ol>2. マウス骨髄細胞の分離
<ol><li>ボーラスの過剰摂取 (100 mg/kg、腹腔内投与) と 12 週齢の c57bl/6 j マウスを安楽死させます。呼吸の不足によって死を確認し、骨間の接合でメス切断大腿骨骨を収穫し、穏やかなスクラッチでブレードと残りの筋肉を削除します。</li>
	<li>チルドの滅菌アルファ-MEM を含む 50 mL 遠心管中骨を置き、バイオ セーフティ キャビネットで次の手順を実行します。</li>
	<li>アルファ MEM 媒体を廃棄し、30 の 70% エタノールで骨をすすいでください s。</li>
	<li>残りのエタノールをクリーンアップするために二度氷冷滅菌 PBS で骨を洗います。</li>
	<li>5 mL の氷冷 PBS を含むモルタルの骨を転送し、優しく杵で骨を fragmentize (それらを粉砕していない)。</li>
	<li>PBS に骨髄細胞を解放する杵を旋回で骨を軽く揺り動かしなさい。新しい 50 mL の遠心管に PBS 含んでいる骨髄細胞を収集します。</li>
	<li>骨片の色で白色の点灯になるまで 4 回の 2.6 ステップを繰り返します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 465 x g でチューブを遠心分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>18 ml の滅菌蒸留水のペレットを再懸濁します、放置 30 s 赤の血液細胞を削除します。</li>
	<li>冷たい 10 の 2 mL を加えて反応を停止する X PBS をフィルター処理混合物分離の赤い血液細胞を削除する 70 μ m セル ストレーナー。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 465 x g でチューブを遠心分離します。20 mL の氷冷 PBS でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>2 回目 2.11 のステップを繰り返すことによって細胞を洗浄します。</li>
	<li>100 mm 滅菌シャーレ OP9 ステップ 1.2 から条件付き媒体の 10 mL と 20 を添加した細胞ペレットに転送 %fbs と 0.5 ng/mL の混合物マウス IL-7、30 ng/mL マウス SCF と 100 U/mL マウス flt3L。</li>
	<li>2.13 のステップと同じ中式と 5 x 105実行可能なセル/mL (トリパン ブルー排除で検定による細胞数) の密度で新しい培養容器に 5% CO2 2 h. 転送の 37 ° C で皿未接続の細胞を孵化します。、と 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>4 日目、OP9 条件培地に培養条件の変更は、FBS とマウス IL-2 の 2,000 U/mL 20% で補完。</li>
	<li>更新の培養培地ごとに 3 日間。成熟 NK 細胞は日 7 によって得られる、セクション 4 のように修飾できます。</li>
</ol>3. siRNA を介したサイレンシング NK 細胞の分化の
<ol><li>プレミックス製品のマニュアルによるとトランスフェクション エージェントと siRNA またはナンセンス制御 (NC)。</li>
	<li>0 日目から任意の時点でのステップ 3.1 を実行します。</li>
	<li>追加、50 nM の siRNA またはステップ 2.14 からセルに NC の混合物。</li>
	<li>実験の終了点までの (例えば0、4、および 7 日) すべての中のリフレッシュ ステップ 3.1 を繰り返します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーを用いた NK 細胞分化の解析
<ol><li>適切な時点で分化細胞の懸濁液を収集し、氷冷 PBS で洗浄します。</li>
	<li>製品マニュアルに従ってセル固定バッファーでセルを固定します。</li>
	<li>氷冷 PBS の固定セルを洗浄し、フロー フローサイトメトリー染色バッファー含む Cy3 標識抗マウス NKp46 の 100 μ L で 1 × 106細胞との 1: 100 希釈倍率で抗マウス CD244 抗体を PE 共役を再懸濁します。</li>
	<li>サンプル 2 時間室温で暗闇の中を汚します。</li>
	<li>300 μ L の PBS、ステンド グラス サンプルを再懸濁します、FACS データを取得し、Cytobank プラットフォーム20 (http://cytobank.org/) で分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本研究では骨髄由来マウス NK 細胞の培養を生産するための手法を説明しました。オリジナル システム21,22細胞フィーダーは正常に OP9 細胞分化システムの安定性を大幅に増加したの条件の中に置き換えられます。さらに、システムは高い量を作り出すことができる、成熟 NK の純度培養し、体内の細胞の試金は、NK 細胞による疾患のトランスレーショナルリサーチと同様、解明を容易にすることができます。
この方法は、TGF-β 1 ががん開発23NK 細胞の抑制におけるシグナル伝達の調節的役割を調査するため使用されています。フィーダー細胞からの影響があったと抑制する阻害剤と同様に、siRNA による遺伝子ノックダウンの効率は大幅に改善します。フィーダー細胞 OP9 ノックダウンまたは23体外ターゲット遺伝子の抑制...

癌の進行、腫瘍微小環境1、2、宿主由来の免疫細胞、例えば、NK 細胞などに大きく依存します。いくつかの研究は、腫瘍内 NK 細胞は腫瘍進行3,4と負の相関を示した。さらに、臨床研究は、NK 細胞養子療法ががん5,6,7,8,9のための可能な戦略であることを示した。NK 細胞を用いたがん免疫療法は最近固形腫瘍に対する治療の選択肢として提案したが、免疫サイトカインの分泌と固形腫瘍の微小環境における配位子のアクティブ化のための課題が存在10,11。変換増殖因子 β (TGF-β) 細胞がん化の抑制の役割を果たすことが示唆されているが逆説的に癌細胞はまた腫瘍開発12,13,14をサポートする TGF-β 1 を生成,15. インターフェロン応答性の制御を介した CD16 インターフェロン γ (IFN-γ) 生産の in vitro16,17、NK 細胞の細胞障害活性を抑制することができます TGF-β シグナル 18。
腫瘍微小環境における TGF-β シグナルの混乱は、がんを除去するための可能な方法もありますが、完全に TGF-β シグナルをブロックになります、その抗炎症機能による自己免疫疾患の開発によって証明されるよう副作用全身性炎症を含む、心血管の欠陥や自己免疫マウスで19をモデル化します。したがって、TGF β を介した免疫抑制の動作メカニズムを理解することは、ガン治療のためのアクセス可能な治療上のターゲットの同定に します。
NK 細胞の発達に必要な分子のイベントを明らかにするには、ウィリアムズらは20NK へ骨髄造血幹細胞と分化細胞の培養システムを確立しました。このシステム主として NK 細胞、NK 細胞21の新規前駆体の同定を含む機構の解明が容易になります。しかし、骨髄前駆細胞はフィーダー層20,21, OP9 細胞をサポート システムで培養する必要があります、この異種細胞集団は主遺伝子撹乱のそれ以上の適用を制限ツール(例えば、siRNA による遺伝子サイレンシング) NK 細胞に特に適用されます。
ここでは、さらにウィリアムズら20の生体外でシステムを変更することによって開発されている無料の送り装置システムについて述べる。我々 のシステムで OP9 管間質フィーダー細胞に必須ではありません、OP9 条件付きのメディアが最近 NK 細胞培養、およびこれの分化に影響を与えずに使用を導く TGF-β は経由で癌の進行を促進することを明らかにする代わりに腫瘍微小環境22E4bp4 依存性 NK 細胞の発達を抑制します。この新しいシステムは、正常に特定条件下で NK 細胞の分化の分子機構を解明するため背景無料メソッドを提供します (例えば、高い TGF-β 1、siRNA による遺伝子サイレンシングなど)。生体外で。

<table><tbody><tr><td>OP9細胞株</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CRL-2749&trade;</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, ヌクレオシドなし</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスFLT3-リガンド</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー染色バッファー&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE標識抗マウス CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3標識抗マウス NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>ナンセンス制御 (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3&盛り;</td></tr></tbody></table>

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

ナチュラル キラー (NK) 細胞は自然免疫系に属する、ファーストラインの抗がん免疫の防衛;腫瘍微小環境における抑制し、基になるメカニズムはまだあまり知られていません。NK 細胞の一貫性と信頼性の高いソースの欠如は、NK 細胞免疫の研究の進捗状況を制限します。フィーダー無料条件下でマウスの NK 細胞の骨髄由来の高い質と量を提供できる生体外でシステムを報告する.もっと重要なことは、また、このシステムを使用して正常に E4bp4 依存性 NK 細胞の成熟を阻害 siRNA による遺伝子サイレンシングを示します。したがって、この新規培養NK 細胞システムの差別化は、免疫研究のための生体材料ソリューションです。

代表の結果を取得するには、次の記載されているプロトコル。フィーダー無料分化システム 11 日間全骨髄細胞の懸濁液類栽培日 0 (図 1A) の総細胞数と比較して 7 日目で増殖率の大幅な増加が観察されました。細胞質に原子力比率が高いと顆粒の豊富な細胞質形態と成熟 NK 細胞 (図 1B) 6 日目で発見されました。
TGF-β 1/Smad3 は NK 細胞の分化、細胞が E4bp4 mRNA (siE4bp4、図 2に示すように、E4bp4 mRNA レベルを効果的に抑制する) またはナンセンスに対する siRNA を導入させた骨髄におけるシグナル伝達の調節作用を解明するためにコントロールを 0 日目と 4...

ここでは、解明in vitroとin vivoの分化のフィーダー フリー システムを使用して、マウスの NK 細胞の遺伝子サイレンシングを量産するためのプロトコルを提案する.

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

この新しいフィーダーフリーシステムの全体的な目標は、in vitroおよびin vivoアッセイ用の高純度ナチュラルキラー細胞を大量生産する方法を提供することです。この方法は、ナチュラルキラー細胞の発生やがん免疫など、自然免疫学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、この新しいフィーダーフリーシステムが、生成されたナチュラルキラー細胞の純度を大幅に向上させることができることです。これにより、in vitroおよびin vivoでの以下のアッセイが大幅に容易になります。この技術の適応は、マウスのナチュラルキラー細胞の大量生産が癌患者の骨髄から生成され、個人免疫療法のための分析および改変のために可能であることから、ナチュラルキラー免疫にまで及ぶ。一般に、この方法に不慣れな個体は、負荷相の成長を受けているOP9細胞から消費培地を収集する必要があるため、苦労します。骨髄の指導手順を学ぶのが難しいため、この方法の顔のデモンストレーションは重要です。なぜなら、骨は生存率を維持するために最適な時間でエタノールで滅菌する必要があるからです。この手順を開始するには、培養フラスコからOP9細胞を採取します。FBSを添加してトリプシンの消化を止めます。OP9細胞を採取し、重力465倍で5分間遠心分離します。この後、細胞ペレットを再懸濁します。血球計算盤を使用して、細胞をカウントします。次に、75cm四方の培養フラスコに15ミリリットルのα-mem培地に10〜6個の細胞を2回播種し、48時間インキュベートします。細胞が80%コンフルエントになったら、10ミリメートルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、抗生物質を含まない20ミリリットルのプレーンα-mem培地とウシ胎児血清を細胞に加えます。24時間インキュベートします。翌日、OP9で馴染ませた培地をフィルターで取り除き、4°Cで保存します。1キログラムあたり100ミリグラムのペントバルビトン腹腔内注射をして、12週齢のマウスを安楽死させます。.呼吸不足を確認した後、サージカルナイフで大腿骨を切除します。残った筋肉を刃物で優しく引っ掻くようにして取り除きます。冷やした滅菌済みのα-mem培地で満たされた50ミリリットルの遠心チューブで骨を移し、バイオセーフティキャビネットに保管します。次に、α-mem培地を排出し、骨を70%エタノールで30秒間洗浄します。再度、氷冷した滅菌リン酸緩衝生理食塩水で骨を2回洗い、残っているエタノールを取り除きます。洗浄後、骨を5ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水を含む乳鉢に移し、乳棒で骨を断片化します。乳棒を優しく渦巻いて、骨髄細胞をリン酸緩衝生理食塩水に放出します。骨髄細胞を含むリン酸緩衝生理食塩水を新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、チューブを重力の

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免疫学と感染症

ここでは、効率的に拡大し、精製ヒトNK細胞の数が多いし、その機能を評価する方法を説明します。...

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このビデオでは、フィーダー細胞株を使用して末梢血単核細胞(PBMC)から直接ナチュラルキラー(NK)細胞を増殖させる技術を示しています。PBMCは、膜結合インターロイキン-21(mIL-21)を発現する遺伝子改変リンパ芽球フィーダー細胞と共培養され、培養物にはサイトカインインターロイキン-2(IL-2)およびインターロイキン-15(IL-15)が補充されます。このリガンドのカクテルが一緒になって、高純度のNK細胞の長期増殖につながります。...

末梢血単核細胞からのナチュラルキラー細胞のEx Vivo増殖

このプロトコルは、開発、展開、およびヒトES細胞やiPS細胞から派生したNK細胞のin...

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

この研究では、Flt3リガンドの存在下で、一般的なリンパ系前駆細胞とAC-6フィーダー細胞を共培養することにより、効率的にpDCを生成できるin vitro培養システムを紹介します。...

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

ここでは、マウスの脾臓から大量のマウス不変ナチュラルキラーT細胞を生成するために使用できる適応プロトコルを紹介します。このプロトコールは、脾臓iNKT細胞を限られた数の動物および試薬を用いてin...

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

我々は、マウス脾臓から不変ナチュラルキラーT(iNKT)細胞を濃縮し、インビトロおよびインビボ研究に適した数にそれらを拡大するための迅速かつ堅牢なプロトコルを記述する。...

インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

ここでは、末梢血ナチュラルキラー(PBNK)、肝臓組織からのNK細胞、末梢血単核球(PBMC)または臍帯血(CB)に由来するキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を拡大する方法を紹介します。このプロトコルは、増殖したNK細胞の最適化された純度に加えて、221-mIL-21フィーダー細胞を使用したNKおよびCAR-NK細胞の増殖を実証します。...

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。...

ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

ナチュラルキラー細胞由来の細胞外小胞(NK-EV)は、がんのバイオ医薬品として有望な可能性を秘めています。この方法論に基づく研究では、高純度のNK-EVを大量に連続的に生産および分離するように設計された、スケーラブルなクローズドループバイオ製造ワークフローを示しています。インプロセス制御試験は、バイオマニュファクチャリングのワークフロー全体で実施され、EVが製品リリースの品質基準を満たしていることが確認されます。...

ナチュラルキラー細胞由来の細胞外小胞ベースのがんバイオ医薬品を製造および単離するためのスケーラブルなバイオマニュファクチャリングワークフロー

本プロトコルは、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞およびサイトカイン誘導キラー(CIK)細胞を含む採用細胞療法(ACT)製品の拡張のためのスケーラブルな手法を、ガス透過性急速増殖(G-Rex)デバイスを用いたもので、臨床的に関連性の高い環境で効率的かつ堅牢な成長を示しています。...

GMPスケーラブルデバイスにおけるCAR-Tおよびサイトカイン誘導キラー細胞の効率的かつ迅速な生成

学ぶ、フィーダーフリー系を用いたマウスナチュラルキラー細胞の大量培養法。骨髄由来細胞から高純度NK細胞を産生し、遺伝子サイレンシングとがん免疫療法研究に応用する革新的な手法です。

生体外でマウスのナチュラルキラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

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