Name: 有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶ有機塩素系農薬（B-HCH）曝露下のHepG2細胞におけるミトコンドリア機能評価法。ATPレベル、酸素消費率、膜電位測定により環境毒素の代謝障害メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は中国国立自然科学財団(グラント81573174、81570574)によって支援されました。江蘇省優秀青少年基金(SBK2014010296);中国教育省の研究プロジェクト(213015A);江蘇高等教育機関(PAPD)の優先的な学術プログラム開発、江蘇高等教育機関の主力主要な発展;環境化学・環境毒性学の国家キー研究所のオープンプロジェクトプログラム(KF2015-01)。

すべての実験と実験プロトコルは、関連するガイドラインと規制に従って行われ、南京医科大学の地元の倫理委員会によって承認されました。
1. TEMによるミトコンドリア超構造
<ol><li>HepG2細胞の収集<ol>
<li>100 mm の皿の種 HepG2 細胞。37°C、5%CO2で2保管。</li>
		<li>1.5 mLEPチューブに0.25%EDTAを有する消化細胞。</li>
		<li>室温(RT)で3分間1000 x g で遠心分離機。上清を捨てます。</li>
		<li>4-6 x 105 HepG2細胞を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットを用いて5%グルタルアルデヒド(溶媒:二重蒸留水)を1 mL加え、4°Cで2時間インキュベートします。</li>
	<li>リン酸緩衝液の4 mL(Na22HPO4、KH22PO4、NaClおよびKCl、pH 7.4を含む)の4つの変化に加えて洗浄し、それぞれ15分。4ピペットでリン酸バッファーを吸い出します。</li>
	<li>200 μmの1%オスミウム(溶媒:二重蒸留水)を加え、4°Cで2時間黒色サンプルにインキュベートします。 注意: オスミウムは非常に有毒で揮発性の物質です。それは慎重に薬物キャビネットで操作する必要があります。</li>
	<li>リン酸緩衝液1 mLの2つの変更、それぞれ5分で加えて洗浄します。リン酸緩衝液を吸い出す。</li>
	<li>2%ウラニル酢酸溶液中の染色(溶媒:二重蒸留水および酢酸)を1.5mLEPチューブで2時間用。</li>
	<li>脱水して50%アセトン、70%アセトン、90%アセトン(溶媒:二重蒸留水)を通して、2つの絶対アセトンの変化、それぞれ15分を経て沈下する。</li>
	<li>2滴でアセトン(100%)/埋め込み剤(1:1)でRTで1.5時間浸透。Epon812埋め込み剤は、レシピは次のとおりです: A: Epon812, 62 mLとDDSA, 100 mL;B:Epon812、100 mLおよびMNA 89 mL。A:B=2:8(v:v、冬)、A:B=1:9(夏期はv:v)。埋め込み金型に埋め込む(チェックグリッド付きのソフトプラスチックプレート)。</li>
	<li>37°Cで12時間、45°Cで12時間、60°Cで48時間培養します。</li>
	<li>ウルトラ薄切片マシンとTEM(2μmおよび500 nm)で、超薄型セクション(最大面積は0.5mm×0.3mmを超えることはできません)を準備し、観察します。</li>
</ol>2. ミトコンドリア蛍光強度検出
<ol><li>シード 2x 104 6 ウェルプレートの HepG2 細胞。24時間にβ-HCHを加えます。</li>
	<li>無水DMSOを加えるため、1 mMミトコンドリア緑色蛍光プローブの最終濃度を作り出します。</li>
	<li>6ウェルプレートのウェルごとに1 mLミトコンドリア緑色蛍光プローブ溶液(最終濃度:200nM)を加え、37°Cで45分間インキュベートします。</li>
	<li>ミトコンドリアグリーン蛍光プローブ溶液を取り出し、イメージング前に37°Cで作りたての細胞培養培地(DMEM)を添加します。</li>
	<li>ミトコンドリアグリーン蛍光を蛍光顕微鏡(10x)で観察します。検出時の最大励起波長は490nm、最大発光波長は516nmです。</li>
</ol>3. 細胞の ATP レベルのアッセイ
<ol><li>6ウェルプレートにHepG2細胞をシードします。24時間にβ-HCHを加えます。</li>
	<li>ルシファーゼ-ルシフェリンATPアッセイキットから6ウェルプレートの各ウェルに200 μLのライシスバッファーを追加します。4°Cで5分間12,000 x g で遠心分離機、新しいチューブにピペットで上清を収集します。</li>
	<li>ATP検出試薬を1:5の比で、ATP検出バッファーとして希釈します。</li>
	<li>標準曲線決定を準備する:ATP標準溶液の0.5 mMを10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μMにATP溶解バッファーで希釈します。</li>
	<li>RTで5分間の96ウェルプレートに100μLのATP検出バッファを追加し、セルの上澄み液を100μL加え、ルミノメーター(化学発光検出器)で検出します。標準曲線を使用して ATP 濃度(nmol/L)を計算します。</li>
	<li>BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度をマルチモードリーダーで検出します。<ol>
<li>標準曲線決定の準備:タンパク質標準溶液の5 mg/mLを0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mLに二重蒸留水で希釈します。</li>
		<li>96ウェルプレートにセルの上清1μLを加え、19μLの二重蒸留水を加えます。</li>
		<li>各ウェルに対して200 μLのBCA検出ソリューションを追加します。37°Cで30分間インキュベートします。562 nm のマルチモード リーダーで OD (光密度) 値を検出します。標準曲線を使用してタンパク質濃度(mg/mL)を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>mgタンパク質濃度あたりのATP含有量を補正します(単位:ATP濃度/タンパク質濃度、nmol/mg)。</li>
</ol>4. JC-1によるミトコンドリア膜電位(MMP)評価
<ol><li>6ウェルプレートに播種HepG2細胞を収集します。1.5 mL EPチューブに0.25%EDTAを有する消化細胞、1000 x g で3分間遠心分離し、上清を捨てて細胞を収集する。</li>
	<li>蒸留水を8mLに50μL(200X)に加え、混合します。JC-1検出液として2mLの染色性染色バッファーを追加します。</li>
	<li>細胞培養培地の0.5mLとJC-1検出溶液の0.5 mLを37°Cで20分間混合して細胞をインキュベートする。</li>
	<li>遠心分離機 600 x g で 3 分 4 °C. 上清を捨てます。</li>
	<li>JC-1(1X)染色バッファーの1mLの2変化でリンス、遠心分離機は600xgで3分間g4°Cで3分間。 そして上清を捨てる。</li>
	<li>JC-1(1X)染色バッファーの0.5 mLで細胞を懸濁し、フローサイトメトリーを介して分析し、緑色および赤色の蛍光を検出する。JC-1ポリマーが検出されたら、励起光を490nmに、発光光を530nmに設定します。JC-1ポリマーが検出されたら、励起光を525nmに、発光光を590nmに設定します。</li>
</ol>5. 酸素消費率(OCR)測定
<ol><li>ヘプG2細胞を細胞培養マイクロプレートに96ウェルの濃度で、4500個の細胞/100μLの密度で播種します。24時間後に各ウェルで覆われた細胞を確認してください。</li>
	<li>前の文献13に従って、調製された試薬の適切な容積を適切な注入ポートに加える。ポートA:25 μL 1 μMのオリゴマイシン(ATPカプラ)ポートB:25 μL 0.75 μM FCCP(電子スロットル制御、ETCアクセラレータ)ポートC:μM抗ミシンA/ロテノーネ(ミトコンドリア阻害剤Aおよびミトコンドリア阻害剤B)の25 μL 0.5。</li>
	<li>使用できる状態になるまで、CO2 のない37°Cインキュベーターにカートリッジを保管してください。</li>
	<li>各ウェルから実行媒体を取り除き、新しいDMEMに追加することで、セルプレートの中程度の変更を行います。各ウェルの最終ボリュームは180 μLです。</li>
	<li>細胞プレートを、アッセイ前に1時間CO2 を使用しない37°Cインキュベーターに保管してください。</li>
	<li>ソフトウェアによって自動的にOCRを記録します。<ol>
<li>OCRソフトウェアを開きます。</li>
		<li>[アプリ] ドロップダウン メニューで [セル ミトストレス テスト キット] を選択します。</li>
		<li>[アプリの開始] ボタンをクリックします。</li>
		<li>[ストレス テストの実行] ボタンをクリックします。セルストレス テストのセットアップ画面が表示されます。</li>
		<li>次の手順を実行します。<ol>
<li>[セルシード番号] ボックスにウェル当たりのシードセル数を入力します。</li>
			<li>[平均基底 OCR] ボックスに平均 OCR を入力します。</li>
			<li>各試薬の最終作業濃度を入力し、試薬を注入します。 注: 細胞のシード濃度を最適化する際に最適化アッセイを実行する前に、セルの平均基底OCR値を検出しておく必要があります。</li>
			<li>[次へ] ボタンをクリックします。グループ情報画面が表示されます。</li>
			<li>色を選択し、名前を与え、適切な井戸をクリックして、未割り当ての井戸にグループを割り当てます。 注: 異なるグループは、細胞水戸ストレステストを実行する前に、異なる治療として定義されています。マイクロプレートのすべてのウェルは、ストレステストが実行されたときに同じ試薬注射を受けます。</li>
			<li>[次へ] ボタンをクリックします。[ストレス テストインジェクション レイアウト] 画面が表示されます。</li>
			<li>[開始] をクリックします。ストレス テストがアナライザーで実行されるようになりました。実行が終わったら、ソフトウェアのポイントに従って、カートリッジとセルプレートを取り外して廃棄します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79(2015).</li>
<li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li>
<li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+persistent+organic+pollutants%3A+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li>
<li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hydrogen+affects+body+composition%2C+metabolic+profiles%2C+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li>
<li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified%2C+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li>
<li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+%28IDH1%29+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li>
<li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes%3A+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339(2017).</li>
<li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells%3A+Implications+for+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li>
<li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853(2017).</li>
<li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5216043/">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295(2016).</li>
<li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li>
<li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li>
<li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+kinase+2+%28GRK2%29+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li>
<li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319(2017).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li>
<li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li>
<li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li>
<li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

検出プロトコルの成功に不可欠なのは、表現型からメカニズムまで研究をカバーしてきた様々な実験方法の使用である。本研究では、ヘプG2細胞をペニシリンおよびストレプトマイシンおよび10%胎児ウシ血清でDMEMで培養した。細胞が合流率40~50%に達すると、β-HCH(0,10,100 ng/mL)を加え、24時間インキュベートした。代表のPPSによる肝細胞の超構造変化を示すTEMをまず用いたβ-HCHは、ミトコンドリア構造の障害を示す(図1)。)さらに、蛍光染色アッセイ(図2)、ルシファーゼ-ルシフェリンATPアッセイ(図3)、JC-1アッセイ(図4)) <...

健康に対する有機塩素農薬(OMP)の影響、例えば生殖障害、免疫毒性、代謝変化は、以前に検討された1、2、3。2,3細胞代謝を検出し、ミトコンドリア機能障害を発見する方法は、科学者がミトコンドリア機能の役割を理解することを可能にしました (すなわち.、 ミトコンドリア STAT3レベル、 乳酸、 ピルビン酸、 乳酸とピルビン酸比、 コエンザイム Q10、 ミトコンドリア陽子漏れ、生体精エネルギー、生物発生、および動力学) 老化、肥満、糖尿病、心血管機能、癌、および安全毒性4,,55,6,,7.本論文では、オプスによるミトコンドリア機能障害の評価方法について述べている。
HepG2細胞をヒトの内部暴露に相当する用量で24時間の代表的なOCPであるβ-ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。まず、TEMを適用して、核、ミトコンドリア、小胞体8などの肝細胞の超構造を観察した。通常の顕微鏡と比較して、TEMは、細胞および細胞成分(細胞株または組織)の2Dおよび3D超構造、形態、化学組成、ならびに現代の科学技術において極めて重要な役割を果たす天然または人工材料の機能を探求することを可能にする。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。水戸トラッカーグリーンは、生細胞ミトコンドリア特異的蛍光染色に使用できるミトコンドリア緑色蛍光プローブです。肝細胞におけるミトコンドリアを、ミトトラッカーグリーン溶液とミトコンドリア蛍光強度で染色し、数とパターンを共焦点顕微鏡9で観察した。ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、生細胞を染色するために使用することができる。ローダミン123またはJC-1と比較して、ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、ミトコンドリア染色のミトコンドリア膜電位に依存しない。ATPレベルはルシファーゼ-ルシフェリンキットによって決定され、タンパク質濃度によって正規化された。ATPアッセイキットは、一般的な溶液、細胞または組織のATPレベルを検出するために使用することができます。このキットは、エネルギーを提供するためにATPが必要な場合、蛍光を生成するために蛍光を生成するために蛍光を触媒ホタルルシファーゼをベースにしています。ホタルルシメラーゼとフルオレセインが過剰である場合、ある濃度範囲では、蛍光の発生はATPの濃度に比例する。さらに、このキットはATPの化学発光を最大限に活用するために特別に設計されていた。ATPは、最も重要なエネルギー分子として、細胞の様々な生理学的または病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ATPレベルの変化は、細胞機能、特にミトコンドリアエネルギー産生の欠陥を反映することができる。通常、アポトーシス下で、 壊死またはいくつかの毒性状態で, 細胞の ATP レベルは 10.JC-1のMMPアッセイキットは、細胞、組織、精製されたMMPを迅速かつ敏感に検出するための蛍光プローブとしてJC-1を使用するキットです。アポトーシスの早期発見に使用できます。カチオン色素JC-1は、緑と赤色の蛍光比の変化によって示されるフローサイトメトリー下で分析することができるMMPを検出するために使用される蛍光プローブです。MMPが高いとき、JC-1はミトコンドリアのマトリックスに凝集してポリマー(J-凝集体)を形成し、赤色蛍光を生じる。MMPが低いと、JC-1は蓄積できず、緑色蛍光11を生成する単量体を形成する。したがって、赤と緑の蛍光の比率は、MMPのレベルを反映することができます。細胞のOCRは、正常な細胞機能12の重要な指標である。ミトコンドリア機能を研究するためのパラメータとみなされます。細胞糸球菌ストレステストキットは、ミトコンドリア機能の主要パラメータを分析するための安定した方法を提供します。このキットは、細胞ミトコンドリアストレステストを行うための標準的な方法と同様に、品質管理と予測試薬を提供します。これは、すべての細胞タイプを検出するために使用することができます, プライマリ細胞を含みます, 細胞株, 浮遊細胞, また、小島, 線虫, 酵母と単離ミトコンドリア.
OCR測定は、細胞の生理的状態または変化に関する貴重な洞察を提供することができる。これは、呼吸ベースライン、陽子漏れ、最大呼吸、ATPターンオーバーおよび予備容量を検出するために細胞外フラックス分析装置で決定された。簡単に言えば、OCRのベースライン測定の後、OCRはオリゴマイシン(ATPカプラ)、FCCP(ミトコンドリア酸化リン酸化アンカプラー)および抗マイシンA/ロテノーネ(酸素消費の阻害剤)に順次添加した後に検出された。
インビトロでの肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するためのより具体的なプロトコルの開発を促進するために、ここでは、ミトコンドリアの損傷関連有害な結果を研究する際に、TEM、共焦点顕微鏡、ルミノメーター、フローサイトメトリーおよび細胞外フラックス分析による実験を提示する。

<table><tbody><tr><td>透過型電子顕微鏡&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>高コントラスト、高分解能イメージング、低線量観察・イメージング、低温観察、優れた分析性能、利便性と性能の自動化</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Greenは、生細胞のミトコンドリア特異的蛍光染色に使用できるミトコンドリア緑色蛍光プローブです。</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>デザインはコンパクトで安定しており、光路は最短で、高い光精度、創造的な技術、洗練されたスキャン技術が一緒になって、完璧な3次元の標本画像を生成します。</td></tr><tr><td>エンハンスドATPアッセイキット</td><td>Beyotime</td><td>S0027</td><td>エンハンスドATPアッセイキットは、一般的な溶液、細胞、または組織中のATP(アデノシン5'-三リン酸)レベルを検出するために使用できます。細胞と組織サンプルを分割してサンプル調製を完了することができ、検出感度は最大0.1nmol / L、化学発光は30分間持続できます。</td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>ベルトルト</td><td>・セントロ LB 960</td><td>ルミノメーターは化学発光検出器で、試験サンプル自体は光で、刺激する必要はありません。ルミノメーターは、化学発光を検出する装置です。</td></tr><tr><td>BCAプロテインアッセイキット</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>BCAプロテインアッセイキットは、タンパク質濃度を検出するために最も一般的に使用される方法の1つです。</td></tr><tr><td>マルチモードリーダー</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>マルチモードリーダーは、タンパク質の同意を検出するために使用します。</td></tr></tbody></table>

有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

本論文では、肝細胞における環境有機塩素農薬(OSP)による代謝障害の原因をより深く理解するための、肝ミトコンドリア機能の検出に関する詳細な方法を紹介する。ヘプG2細胞は、一般集団における内部曝露の等価用量で24時間のβ−ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。肝細胞における超構造を透過電子顕微鏡(TEM)で調べ、ミトコンドリアの損傷を示した。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。ミトコンドリア緑色蛍光プローブで染色後のミトコンドリア蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した。ルシフェリン-ルシメラーゼ反応を用い、ATPレベルを決定した。MMPを、カチオン色素JC-1によって検出し、フローサイトメトリー下で分析した。OCRは細胞外フラックス分析装置で測定した。要約すると、これらのプロトコルは、ミトコンドリアの損傷を調査するために肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するのに使用された。

β-HCHに曝露したHepG2細胞のミトコンドリアクリステは著しく損傷を受けた。散在したミトコンドリアは、比較的異常なミトコンドリア建築で、著しく膨張し、不規則な形状、およびミトコンドリア尾根が消失した軽度であった(図1)。
ミトコンドリアを表す平均ミトコンドリアグリーン蛍光強度は、β-HCH(図2)に曝露されたHepG2細胞およびATPレベルで減少した(図3)。蛍光強度とATPレベルは、暴露濃度の増加に伴って徐々に減少した。潜在的に、ミトコンドリア数の減少、またはミトコンドリアの損傷により、観察されたミトコンドリア蛍光強度を引き起こし、その結果ATPの産生が減少した。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

ATPレベルや酸素消費率などの分野の機能にも重要な質問に答えるメッサーです。新しいまたは1ページ古い、この技術は、それが実行しやすいことであり、それは細胞ミトコンドリア機能の特別な評価のために多くです。この実験を開始するために、ガラス底ペトリ皿に20,000個のHepG2細胞をシードする。インキュベーターにβ-ヘキサクロルシクロヘキサンまたはB-HCHを摂氏37度、CO2を5%24時間加えます。DMEM細胞培地に無水DMSOを添加してミトコンドリアグリーン蛍光プローブ溶液を1ミリモル調製した。その後、ガラス底ペトリ皿の細胞にこの溶液の皿当たり1ミリリットルを追加します。そして、摂氏37度で45分間インキュベートします。インキュベーション後、ミトコンドリア緑色蛍光プローブ溶液を細胞から取り出します。37°C DMEM細胞培養培地で作りたての1皿につき1ミリリットルを加えます。ミトコンドリアで緑色蛍光を検出するには、共焦点顕微鏡で細胞を観察します。細胞ATPのレベルを評価するために、6つのウェルプレートに20,000 HepG2細胞に播種する。β-HCHを加え、摂氏37度で24時間インキュベートします。各ウェルの細胞に200マイクロリットルのライシスバッファーを加えます。摂氏4度で5分間Gの12,000倍で遠心分離機を、テキストプロトコルに記載されているように上清の収集を進める。プレートに100マイクロリットルのATP検出バッファーを追加します。収集した細胞上清の100マイクロリットルを室温で96ウェルプレートに加え、テキストプロトコルに記載されているようにルミノメーターで細胞ATPを検出する。ミトコンドリア膜電位の評価のために、前に述べたようにβ-HCHを添加して6つのウェルプレートでHepG2細胞を増殖させる。0.5ミリリットル0.25%EDTAで37°Cで1分間消化して細胞を収集します。1ミリリットルDMEMを加え、消化を止め、消化した細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブをGの1000倍の3分間遠心し、上清を捨てます。細胞ペレットを0.5ミリリットルの細胞培養培地と0.5ミリリットルのJC1ミトコンドリア膜電位色素で希釈します。そして、摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、チューブを600倍Gで摂氏4度で3分間遠心し、次にテキストプロトコルに従って細胞ペレットを洗浄する。洗浄したペレットを遠心した後、上清を取り除く。そして、ペレットをJC1染色バッファーの0.5ミリリットルに再懸濁した。フローサイトメトリーを介してJC1染色細胞を分析し、緑色および赤色の蛍光を検出します。JC1モノマーが検出されたら、励起光を490ナノメートル、発光光を530ナノメートルに設定します。JC1ポリマーが検出されたら、励起光を525ナノメートル、発光光を590ナノメートルに設定します。酸素消費率を分析するために、ヘプG2細胞を96ウェル細胞培養プレートに4,500細胞/ウェル当たり100マイクロリットルの密度で播種します。摂氏37度で24時間のインキュベーションの後、各ウェルの細胞が培地で覆われていることを確認してください。OCRソフトウェアを実行する前に、テキストプロトコルに記載されているように、カートリッジと細胞培養プレートをマイクロプレートに細胞外フラックスアナライザにロードします。OCRソフトウェアを開き、アプリのドロップダウンメニューでセルの「ミトストレステストキット」を選択し、アプリの開始ボタンをクリックします。次に、[ストレス テストの実行] ボタンをクリックします。細胞ストレステスト画面が表示されたら、細胞の播種数ボックスにウェル当たりの細胞播種数を入力し、基底細胞OCRボックスでの平均OCRを平均値に入力します。各試薬の最終作業濃度を入力し、試薬を注入します。次のボタンをクリックします。グループ情報画面が表示されたら、色を選択して名前を付けることで、割り当てられていないウェルにグループを割り当てます。その後、適切な井戸をクリックします。次のボタンをクリックし、表示されるストレス テストインジェクション レイアウト画面で、[開始] をクリックして、アナライザでストレス テストを実行します。実行が完了したら、ソフトウェアの指示に従い、カートリッジとセルプレートを取り外して廃棄します。β-HCHに曝露したHepG2細胞におけるミトコンドリア緑色蛍光染色の平均強度が低下した。これは、ミトコンドリア数の減少と農薬濃度の増加と一致する損傷したミトコンドリアの増加があることを示しています。さらに、HepG2細胞におけるATPレベルはβ-HCH曝露の濃度の増加とともに減少し、これらの細胞におけるミトコンドリアの機能低下を示す。ミトコンドリア膜電位、またはMMPに対するJC1染色後、フローサイトメーターは、無傷のHepG2細胞において高赤色緑色JC1蛍光を示した。これは、高いMMPの兆候である赤色蛍光JC1凝集体の存在によるものであった。β-HCHで処理した細胞において、緑色のJC1モノマーの存在により赤緑色JC1蛍光が低下し、低MMPの徴候である。最後に、β-HCH曝露の濃度の増加に伴って酸素消費率も低下し、この農薬が適切なミトコンドリア機能を損なうことをさらに示す。ああ、まあ、この手順を試みて、しかし、それをテストするために適切なセルを見ることを忘れないでください。その開発後、これは間違いなくそれに関連する医学的役割の関連する生物を探求する基本的な機能の分野での研究のための道を開きます。このビデオを見た後、あなたは、不足シート機能の下で、量や品質、容量、今メンバーまたは潜在的なを検出する方法をよく理解している必要があります。

experimental-protocol-for-detecting-mitochondrial-function

Research

JoVE Journal

Environment

環境

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

デノボ脂質生成およびβ脂肪酸酸化は、肝細胞に脂肪肝疾患を含むいくつかの代謝障害に摂動された経路を主要な代謝経路を構成しています。ここでは、マウス初代肝細胞の単離を実証し、β - 脂肪酸の酸化および脂質生成の定量化について説明します。...

マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意

モデル生物Caenorhabditis elegansにおけるミトコンドリア阻害剤の影響のin...

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

本稿では、異物による酸化ストレスの検討のため住セルイメージ投射の遺伝子にコードされた蛍光レポーターの使用について説明します。この実験的アプローチでは、毒性学的酸化ストレス検査に用いられる従来の欠点の多くを回避しながら比類のない時空間分解能、感度、特異性を提供しています。...

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。...

がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

腸と肝オルガノイドを有する微小生理学的システム(MPS)をアセトアミノフェン(APAP)に曝露した。本稿では、MPSにおけるオルガノイド産生法およびAPAP薬物動態学的および毒性学的特性評価法について説明する。また、結果を検証するために必要な組織機能分析についても説明します。...

薬物薬物動態および毒物学的評価のための腸/肝臓微生理学的システム

新鮮な腫瘍ホモジナートにおけるミトコンドリア酸化リン酸化と電子移動能を評価する実用的なプロトコルと分析手法を開発しました。このプロトコルは、がんの開始、進行、および治療応答に寄与する様々なミトコンドリア機能を調査するために容易に適応することができる。...

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。...

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

このプロトコルは、植物中のトリアゾール系農薬の代謝産物の総合的な細胞毒性を評価する新しい方法を説明しています。...

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

この研究では、呼吸測定および酵素アッセイを介してミトコンドリア機能に対する生体異物の影響を研究するための方法論を紹介します。さまざまな種における電子伝達鎖の調節を調べ、昆虫ベクター媒介性疾患に対する標的生物農薬開発に関する洞察を提供します。...

単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察

学ぶ有機塩素系農薬（B-HCH）曝露下のHepG2細胞におけるミトコンドリア機能評価法。ATPレベル、酸素消費率、膜電位測定により環境毒素の代謝障害メカニズムを解明する。

有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

さらに動画を探す