Name: バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶバイオ層干渉法によるhEAG1イオンチャネルとPIP2の相互作用測定法。少量のタンパク質で高スループットなリガンドスクリーニングが可能です。イオンチャネル創薬研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、バイオ ID センターと医学と工学 (YG2016QN66)、国家自然科学基金、中国の (31271217)、および基本的な研究プログラムの中国国家 (2014CB910304) では上海交通大学横断的研究費によって支持されました。

注: 遠位 C 末端のフラグと hEAG1 続いて HEK 293 t 細胞への DNA 配列を含む pCDH レンチ ウイルス プラスミドを株で継続的にタグ付きのフラグ hEAG1 チャネル蛋白質を表現する HEK 293 t 細胞ラインを構築、ピューロマイシン耐性選択前述15を。
1. 親和性の浄化 HEK 293 t 細胞からの hEAG1 チャネル蛋白質のタグ付きのフラグ
<ol><li>暖かい水 (37 ° C) にすぐに液体窒素から hEAG1 チャネルを発現する安定細胞を解凍します。10 cm 皿 (約 5 × 106凍結細胞) の細胞を播きます。セルの成長ダルベッコ変更されたワシの (DMEM) で一晩中 8 mL の 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、4 mM L グルタミンを添加した、次の日に媒体を変更します。</li>
	<li>細胞の割合が高い安定した養殖システムで hEAG1 チャンネルを表現を確認する蛍光顕微鏡を用いた HEK 293 t 細胞の GFP 蛍光を確認してください。指数関数的に 1 ml 室温と thenadd 消化で終了する血清を含む培養液 2 mL で 1 分の 0.25% トリプシンの成長細胞を trypsinize します。細胞懸濁液の 400 μ L を完全 DMEM 培地 15 mL を含んでいる 15 cm 皿に転送します。合計で 4 つの 15 cm 料理を準備します。</li>
	<li>
2-3 日培養細胞の約 90% に到達した後、これらの細胞を収穫の confluency。
	<ol>
<li>細胞から成長培地を外し、生理食塩水リン酸緩衝の 4 mL で 2 回洗浄し (1 x PBS、pH 7.4 を =)。</li>
		<li>洗浄後に、PBS を破棄します。</li>
		<li>15 mL チューブにピペットの 1 mL と廃電池セルこすりと転送を使用して各料理の 2 mL の 1x PBS に細胞をこすり取る。</li>
		<li>4 ° C で 420 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>デカントし、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>氷と渦徹底的にライセート 10 分ごとに 30 分の換散バッファー (10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、10 mM の NaCl、1 NP 40%, pH 7.0 では、含まれている完全なプロテアーゼ阻害剤) の合計 4 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>細胞ライセートの 4 ° C で 12,000 × g で 10 分間遠心します。</li>
		<li>5 mL チューブに上清を転送する即時の使用のため氷の上保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
反フラグ M2 の親和性の樹脂を準備します。
	<ol>
<li>徹底的に反フラグ M2 の親和性のゲルのボトルはゲル粒子の均一懸濁を確認する穏やかな逆転によって (ストア バッファー 50% 懸濁液として供給) 樹脂を中断します。</li>
		<li>すぐに冷えた 1.5 mL チューブに懸濁液の 400 μ L を転送します。</li>
		<li>30 の 8 s、4 ° C で 000 x g の懸濁液を遠心し、ストア バッファーを洗浄するために慎重に上澄みを廃棄します。</li>
		<li>樹脂を 500 μ L 1 × PBS を追加し、1 mL ピペットでペレットを中断します。30 の 8 s、4 ° C で 000 x g の懸濁液を遠心分離し、慎重に培養上清中の PBS を破棄します。これらを繰り返し洗浄ステップ格納されたバッファーをクリアします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 μ L タンパク質抽出上清樹脂ペレット、ペレットを中断し、新しい冷蔵 5 mL チューブに懸濁液を転送するステップ 1.3.8 で準備を追加します。もう一度確認の左ゲルビーズにこの手順を繰り返します。左のタンパク質抽出物を混合物に追加します。</li>
	<li>フラグの融合蛋白質をキャプチャする 4 ° C で 8 回転でシェーカーで一晩の混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>1 で 10 分間、4 ° C で 000 x g 12 時間培養後の混合物を遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1 × PBS の 500 μ L の 3 回餌を洗浄します。即座の使用のための氷の上におきます。</li>
	<li>
3x フラグ ペプチド溶出フラグ hEAG1 蛋白質。
	<ol>
<li>3 X フラグ溶出ソリューションを準備します。500 μ L の原液で 3 X フラグ ペプチドを溶解 (0.5 M トリス-HCl、1 M 塩化ナトリウム、pH = 7.5) 8 μ g/μ L の濃度で。</li>
		<li>200 ng/μ L の最終的な集中の解決策になるに PBS の 390 μ L に 10 μ L 3 x フラグ溶出液を追加します。</li>
		<li>1.8 のステップで準備ゲルビーズに 3 x フラグ溶出液の 400 μ L を追加します。</li>
		<li>4 ° C で 2 h の 8 回転でシェーカーでサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>遠心分離機の 30 用樹脂、8 時 s 000 x g。</li>
		<li>上清を新しい 1.5 mL チューブに転送、即座の使用のための 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 集中の試金と浄化確認フラグの融合 hEAG1 BCA タンパク質アッセイ キットと西部にしみが付くことによって
<ol><li>製造者の指示によると BCA タンパク質アッセイ キットを使用して浄化された蛋白質の集中を定めます。</li>
	<li>西部の分析の 30 μ L のサンプルを使用して、確認前述15反フラグ抗体を使用して興味の蛋白質を精製されていた。</li>
</ol>3. バリの試金のためビオチンと精製チャネル蛋白質のラベル付け
<ol><li>PBS で原液をビオチン 5 mg/mL を準備します。各テスト (2 バイオ センサー)、PBS で浄化された蛋白質の望ましい N ターミナル ビオチン化を達成するために 20 μ g 精製蛋白質にビオチンの 3 倍モル超過分を追加します。</li>
	<li>暗闇の中、少なくとも 30 分間氷の上でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>サンプル希釈 (SD) バッファーを準備: PBS の 0.02% ポリソルベート 20、0.1% ウシ血清アルブミン (BSA、pH 7.4)。</li>
	<li>限外ろ過 SD バッファーに精製されたチャネル蛋白質のバッファーを変更するを実行します。30 kDa の分子量カットオフと限外濾過装置を使用して、SD バッファーの追加、および 12,000 のサンプルを遠心分離によって非連結のビオチンを削除 4 ° C で 10 分間の g x</li>
	<li>フィルター デバイスに 200 μ L SD バッファーを追加限外ろ過装置、遠心分離機管から、見出されたを削除し、4 ° C で 10 分間、12,000 × g でサンプルを遠心分離少なくとも 3 回、この操作を繰り返します。</li>
	<li>交換バッファーを収集するには、サンプルでは、逆に 1.5 mL チューブに 4 ° C で 5 分間、2,000 × g で遠心分離それらフィルター デバイスに挿入します。即座の使用のための氷のサンプルを保ちます。</li>
</ol>4 PIP2ソリューションの試金のための準備
<ol><li>前述の17として氷の上で 30 分間 sonicating 脱イオン H2O の PIP2 (1 mM) の原液を準備します。-20 ° C でガラス瓶でソリューションを格納し、積極的なボルテックス実験の直前に最終濃度に希釈します。</li>
</ol>5. バリ アッセイ
<ol><li>機器の電源をマシンは、少なくともバリ調査の前に 30 分間、機器を prewarm に「準備完了」の状態を確認する「計測器ステータス」ウィンドウを確認してください。</li>
	<li>実験ウィザードで「新しい動力学実験」を選択してデータ集録ソフトウェアを開く前に楽器のドアが閉じているかどうかを確認します。</li>
	<li>バッファー、負荷、およびサンプルを選択する右クリックで 96 ウェル プレートで使用する井戸を定義します。サンプル井戸、ビオチン化フラグ融合 hEAG1 タンパク質の濃度の単位として入力する必要があります (10 μ g、0.09 μ M) の臼歯。</li>
	<li>ベースライン、読み込み、離合集散を含む試金のステップを定義します。試金のステップを選択し、それぞれの列をダブルクリックします。アッセイ定義の複製制御センサーを設定されています。1,000 rpm に設定します。基準ステップ 1 分と読み込み、協会、および解離、5-10 分をそれぞれ選択します。室温 (約 24 ° C) でテストを実行します。 注: 2 つの主な手順があります: ロード センサーにビオチン化チャネル蛋白質と低分子化合物との相互作用の試金。彼らが継続的に進むことができる (ベースライン、読み込み、ベースライン、協会および解離)。また、最初の読み込みが失敗したそのとき、試験化合物を無駄にしないように個別に進むことが。</li>
	<li>センサーが含まれておりセンサー トレイにセンサーの位置を示す「塗りつぶし」をクリックして列をクリックします。</li>
	<li>間違いをチェックし、それらを修正する戻るすべての計画手順を確認します。</li>
	<li>データ ファイルの場所を設定し、アッセイを開始するために"Go"をクリックします。 注: センサー必要 prewetted SD バッファーで少なくとも 10 分のためこの手順が行われている場合、「実験開始遅延」設定をスキップする必要があります。いない場合は、センサーを prewetting 前に 600 秒遅延を設定します。</li>
	<li>トレイの底に黒 96 ウェル プレートを入れて、プレートの A1 コーナーをプレートを座席にトレイの切り込みに挿入します。センサーをロードする井戸、200 μ L/ウェル アッセイバッファーの 2 行 A 井と 2 行 B 96 ウェル プレートの井戸に追加します。</li>
	<li>サンプル プレートとして別の黒 96 ウェル プレートを準備し、B 列に 200 μ L SD を行内のステップ 5.3 でのプログラミング中に割り当てられたコントロールまたはビオチン標識の hEAG1 タンパク質溶液 (10 μ g) として井戸を埋めます。 注: は、気泡を導入することを避けるため。</li>
	<li>装置のドアを開けるとセンサー トレイを挿入し、それぞれ左と右のプレート ホルダーにプレートのサンプルします。左プレート ホルダーと右のプレート ホルダーの右上隅に"A1"マーカーの形状に基づいて正しくセンサー トレイとサンプル プレートの位置を確認してください。扉を閉じて、分析を開始します。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>データ分析ソフトウェアを開き、分析データが含まれているフォルダーをロードします。処理メニュー インターフェイスに入るための「処理」をクリックしてと、カラフルな生運動曲線を見ることができます。</li>
	<li>ステップ 1の下で:「データ選択」、「センサーの選択」をクリックします。「センサー トレイ #1」、は、SD バッファーで湿っただけセンサー井戸をクリックしてし、""の参照センサー"へ"センサー タイプを変更するを右クリックします。' サンプル プレート マップ"、すべての非特異的結合井戸を指定し、「よくタイプ変更を""よくを参照"を右しますクリック。</li>
	<li>ステップ 2 の「減算」の前ボックスにチェックして、「二重基準」を指します。</li>
	<li>ステップ3:「Y 軸合わせ」配置のステップとして「ベースライン」を選択します。「時間範囲」、最後の 10 を入力その基準の s (すなわちから: 0.1: 59.8)。</li>
	<li>ステップ4:「間ステップ補正」選択「に揃える基準」協会と解離のステップ間の信号変化を最小限に抑える。</li>
	<li>ステップ5:「プロセス」、ほとんどの場合サビツキー ・ ゴーレイ フィルター処理関数を選択し、「プロセス データ」を進みます。</li>
	<li>詳細なデータ分析手順 7 でその他のソフトウェアを使用して生データを保存:「保存結果」。</li>
	<li>
クリックして"分析 |カーブ フィット」。
	<ol>
<li>選択ステップを「分析」、「協会 |解離」。「モデル」、1:1 を選択します。 注: 我々 は我々 の元のデータにも装着過適合の下での可能性を避けるため 1:1 モデルを選択 1:2 または 2:1 の自由度の高いモデル。その他のオプションです、適当に他のフィッティング解析試料の異なるバインディング モデルを選択できます。</li>
		<li>「フィット」グローバル (フル) を選択します。「グループ化」、「色」を選択します。「Rmax リンクされていないセンサー」最大信号応答 (Rmax) の独立したフィッティングを許可するを選択します。</li>
		<li>「フィット カーブ!」をクリックして、非線形回帰分析を開始します。ヒルの式と 1 つの指数関数は、我々 の研究で使用されました。</li>
		<li>クリックして"データのエクスポート |レポートを保存するには"フィッティング結果を保存します。クリックして、または「データ エクスポート |フィッティング結果をエクスポート"他のソフトウェアとさらにグラフ作成とデータ解析の生データを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes%3A+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li>
<li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Property-based+design%3A+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).</li>
<li>Papo, N., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+peptide+membrane+interaction+using+surface+plasmon+resonance%3A+Differentiation+between+pore+formation+versus+membrane+disruption+by+lytic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides.</a> Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).</li>
<li>Fechner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%21+Label-free+detection+of+small+molecule-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).</li>
<li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Bio-Layer+Interferometry+for+the+analysis+of+protein%2Fliposome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+Interferometry+for+Measuring+Kinetics+of+Protein-protein+Interactions+and+Allosteric+Ligand+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects.</a> J. Vis. Exp. (84), e51383(2014).</li>
<li>Occhiodoro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+ether-a-go-go+potassium+channel+expressed+in+myoblasts+at+the+onset+of+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion.</a> Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).</li>
<li>Pardo, L. A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1%3A+An+emerging+oncological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li>
<li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li>
<li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li>
<li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1+K%2B+Channel%3A+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li>
<li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PREP%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li>
<li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K%2B+channels+for+phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li>
<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there?</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function%3A+How+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659(2017).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

膜イオン チャネルは、さまざまな心血管および神経学的疾患18を含む人間の病気の治療のため現在知られている医薬品の 13% 以上の主要な治療上のターゲットとして検証されています。パッチ ・ クランプ記録、小分子とイオン チャネルの機能を測定するため黄金の標準は、広くイオン チャネル リガンドのスクリーニングに使用されています。ただし、小さな分子は他の蛋白質またはチャネルと相互作用する細胞間経路に関する法律でしたので小さな分子に直接チャネルまたはない19、バインドかどうかを示すような電気生理学的アプローチができません。広く放射性リガンド結合アッセイ法そして他の一般的に使用されるラベル無料バイオ センサーの方法と比較して、バリは相対的なシンプルな配置、制限関連づけフェイズに近いアッセイ デザインを通して高の面で重要な利点体内システムの固定された蛋白質 (数 μ g) の少量の必要性は、速度論的データ5,6,<s...

ターゲット小分子と細胞表面でアクセス可能なイオン チャネル蛋白質リガンドのスクリーニングと生物学的製剤の発見1,2,3の途方もない可能性を提供しています。したがって、適切なツールは、イオン チャネルおよび小さい分子および彼らの対応する関数との相互作用に必要です。パッチ ・ クランプ記録は、イオン チャネル機能アッセイにユニークでかけがえのない技術実証されています。ただし、他の技術を必要とする小さな分子がイオン チャネルを直接対象かどうかを決定します。伝統的に、放射性リガンド結合アッセイ法はイオン チャネル タンパク質・小分子間結合の動態を観察していました。ただし、この技法の使用法は、限られたその要件を満たすのため放射性分類および検出。また、研究で小さなリガンドのラベルに必須のステップは知られている特定のリガンドなしイオン チャネルの多くの種類で使用できなくなります。NMR 分光法、x 線回折、マイクロ スケール働く (MST)4表面プラズモン共鳴 (SPR) などいくつかの無料のラベルのテクニックは、小さなタンパク質分子間相互作用を測定するために使用されています。しかし、通常の試金のこれらのタイプは、実物大の蛋白質、ダイナミクス、低いスループット、および高コスト5の低解像度を得ることが困難なのため十分な情報を提供できません。これらの手法とは対照的バイオ層干渉 (結合) の表面の小さな蛋白質のサンプル量を固定化した小さなタンパク質分子間相互作用を検出するためのこれらの欠点を克服するための新しいラベル無料方法論として浮上しています。バイオ センサーと光の変化を測定、6、7を通知します。有望なバイオ センサー プラットフォームとしてのバリの方法を既に実行してひと抗体 CR80208などの可溶性タンパク質の天然水で小さな分子の相互作用を観察して、詳細な試金プロシージャで報告されている、前9条。新しい治療上のターゲット発見のためイオン チャネル蛋白質の重要な役割が認識されているがバリに基づくイオン チャネル蛋白質小分子の相互作用アッセイは記載されていません。
人間ゴーゴー エーテル アラカルトチャンネル (hEAG1) は癌細胞および多くのがんや神経疾患10、11、チャネルの潜在的な治療ターゲットとなる中枢神経系の様々 な種類で表されます。 12,13,14。私たちの研究室で電気生理学的調査は、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2) hEAG1 チャネル15の抑制効果を確認しました。テスト PIP2バリ手法による hEAG1 との相互作用は特に特定のリガンドを欠けているこれらのチャネルのイオン チャネル蛋白質小分子化合物相互作用の他のタイプのためのモデルとしてすることができます直接私たちの結果に基づいています。バリ アッセイの指示に従って我々 は hEAG1 蛋白質ビオチン化を準備し、それらを固定化したストレプトアビジン (SA) の表面にバイオ センサーのヒント続く相互作用それら PIP2ソリューションとの間の直接結合を観察するために、蛋白質および脂質。HEAG1 タンパク質表面、表面の層の厚さに PIP2の添付ファイルが増加した後直接相関スペクトルのシフトとリアルタイム16で測定することができます。拘束運動は、協会ステップで正のシフトと解離の手順で負のシフトにより決定できます。この原則によると我々 は体外機能的状態を維持するために親和性の浄化法を用いた HEK 239T 安定発現システムから機能的な hEAG1 イオン チャネル蛋白質を精製し、結合の動態を測定濃度の異なる2、ピップし、電気生理学的測定15に見られる semblable 速度論的データが得られました。バリからの結果と電気生理学的測定との間に対応は初めてイオン チャンネル膜蛋白質小分子相互作用の適切な分析ツールとしてのバリの適性を示します。

<table><tbody><tr><td>DMEM/高グルコース培地</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>1697550</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>150 mm X 25 mm</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute</td><td>Amresco</td><td>E109</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610440</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600332</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン-20-ソルビタン モノラウレート</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma</td><td></td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAGペプチド</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&eacute;Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェアPall</td><td>/ Fort&eacute;バイオ</td><td>バージョン7.1</td><td></td></tr><tr><td>データ分析ソフトウェア</td><td>ポール/フォート&eacute;バイオ</td><td>バージョン7.1</td><td></td></tr>バイオ<tr><td>センサー/ストレプトアビジン</td><td>ポール/フォート&eacute;Bio</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>マイクロタイタープレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>遠心機</td><td>ThermoFisher</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 染色済みタンパク質ラダー</td><td>ThermoScientific</td><td>318120</td><td></td></tr><tr><td>限外ろ過装置</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC503008</td><td>30 kDa</td></tr><tr><td>ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2)</td><td>Sigma</td><td>P9763</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗フラグ M2 抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>1:2000 希釈ヤ</td></tr><tr><td>ギ抗マウス HRP 標識二次抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>1:5000 希釈</td></tr><tr><td>強化 BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>04693159001</td><td></td></tr><tr><td>アマシャムイメージャー600 イメージングシステム</td><td>GEヘルスケアバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロットシステム</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

バイオ層干渉 (結合) アッセイは、タンパク質とタンパク質・小分子相互作用を測定するための貴重なツールです。ここでは、まず人間の EAG1 の相互作用を研究する新ラベル無料技術のアプリケーションを示す低分子 PIP2(hEAG1) チャネル蛋白質。hEAG1 チャネルは、がんや神経疾患のいくつかの種類に関与するいくつかの機能獲得変異でその異常発現のための潜在的な治療上のターゲットとして認識されています。我々 は哺乳類の安定発現系から hEAG1 チャネル蛋白質を精製し、PIP2バリとの相互作用を測定します。HEAG1 タンパク質と PIP2間のバインドの動態の測定に成功は、バリ アッセイであるイオン チャネルの薬理学の新規低分子リガンドのスクリーニングに使用可能性のある高スループット アプローチについて説明します。

HEK 293 t 細胞安定発現 hEAG1 からフラグの融合 hEAG1 チャネル蛋白質を精製しました。この融合タンパク質の機能は、パッチ ・ クランプ法による実証されています、品質と浄化された蛋白質の特異性は西部のしみ (図 1) で確認しました。精製チャネル蛋白質は、リアルタイムのバリ アッセイを用いたビオチン化 (PIP2) 脂質相互作用分析を実行します。バリ バインディング アッセイの構成を図 2に示します。HEAG1 と PIP2間の標準的なバインド曲線を図 3に示します。この例では、3 μ M PIP2 (PIP2の構成は補足の図 1に示すように)、PBS バッファーに溶解しているし、(非特異的結合を減算する二重基準減算プロトコルを使用して信号を解析センサーと ...

ここのプロトコルでは、小分子脂質リガンド ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) と精製 hEAG1 イオン チャネル蛋白質の相互作用について説明します。測定は、バリでした小分子イオン チャネル リガンドのスクリーニングのための潜在的な方法であることを示します。

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

このバイオレイヤー干渉法またはBLIアッセイの全体的な目標は、精製されたhEAG1イオンチャネルタンパク質と低分子脂質との間の潜在的な相互作用を測定することです。この方法は、目的の小分子がこのイオンチャネルと直接相互作用できるかどうか、相互作用の速度論は何かなど、イオンチャネル薬理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、手間がかからず、高スループットの方法であることです。必要なのは、固定化タンパク質の量だけです。一般に、この分析法に不慣れな人は、アッセイを成功させるためには、タンパク質発現、精製、標識、正確に調整されたセンサー、データ解析など、複数のステップが必要なため、苦労するでしょう。hEAG1を発現するHEK293 T細胞を2〜3日間培養した後、増殖培地を取り出して細胞を回収し、4ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。PBSを廃棄します。細胞を皿ごとに2ミリリットルのPBSにスケープし、1ミリリットルのピペットを使用して細胞を15ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を重力420倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清をデカントし、4ミリリットルの溶解緩衝液を使用してペレットを再懸濁します。懸濁液を氷上で30分間インキュベートし、10分ごとにライセートを完全にボルテックスします。次に、細胞溶解物を重力の12,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清を5ミリリットルのチューブに移し、すぐに使用できるように氷の上に置いておきます。抗FLAG M2アフィニティー樹脂を調製するには、抗FLAG M2フィニティゲルのボトルがゲルビーズの均一な懸濁液であることを確認するために、樹脂を穏やかに反転して樹脂を完全に懸濁します。すぐに400マイクロリットルの懸濁液を冷やした1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、懸濁液を重力8,000倍、摂氏4度で30秒間遠心分離し、上澄みを慎重に廃棄して貯蔵バッファーを洗い流します。樹脂ペレットを再懸濁するには、500マイクロリットルのタンパク質抽出物上清を樹脂に加え、懸濁液を新しい冷却された5ミリリットルのチューブに移します。さらに500マイクロリットルのタンパク質抽出物を元のチューブにピペットで入れて残りのビーズを収集し、抽出物を5ミリリットルのチューブに移します。混合物をシェーカーで8rpm、摂氏4度で一晩インキュベートし、FLAG融合タンパク質を樹脂に結合させます。次に、混合物を重力の1, 000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルの1 x PBSで3回洗浄します。すぐに使用できるように氷の上に置いてください。390マイクロリットルのPBSに10マイクロリットルの3 x FLAG溶出溶液を添加し、最終濃度を200ナノグラム/マイクロリットルにします。次に、400マイクロリットルの3 x FLAG溶出溶液を、あらかじめ調製したゲルビーズに加えます。サンプルを8rpm、4°Cの振とうインキュベーターで2時間インキュベートします。次に、レジンを重力8000倍で30秒間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、すぐに使用できるように摂氏4度で保管します。製造元の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを使用し、精製されたタンパク質の濃度を測定してください。次に、30 μLのサンプルを抗Flag抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用し、目的のタンパク質が精製されたことを確認します。精製したタンパク質をビオチンで標識するには、PBS中のビオチンストック溶液1ミリリットルあたり5ミリグラムを調製します。2つのバイオセンサーの各試験で、精製タンパク質20μgに3倍モル過剰のビオチンを添加して、PBS中の精製タンパク質の好ましいN末端ビオチン化を達成します。サンプルを氷上で暗所で少なくとも30分間インキュベートします。未結合のビオチンとバッファーを除去するには、タンパク質をSDバッファーに交換します。タンパク質を30キロダルトンの分子カットオフを備えた限外ろ過装置に移します。次に、SDバッファーを追加し、サンプルを12, 000倍の重力と摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離管から限外濾液を取り出します。200マイクロリットルのSDバッファーをフィルター装置に加え、サンプルを再度遠心分離します。このプロセスを少なくとも 3 回繰り返します。ろ過装置を裏返してバッファー交換したサンプルを採取し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。サンプルを重力の 2, 000 倍、摂氏 4 度で 5 分間遠心分離します。サンプルは氷上に置いておいて、すぐに使用できます。BLIアッセイを実施するには、研究の30分前に、装置の電源を入れて装置を予温します。装置のステータスウィンドウをチェックして、マシンが準備完了状態にあることを確認してから開始します。データ集録ソフトウェアを開く前に、装置のドアが閉じていることを確認し、実験ウィザードで「New Kinetics Experiment」を選択します。96ウェルプレートで使用するウェルを定義するには、右クリックしてバッファー、負荷量、およびサンプルを選択します。サンプルウェルの場合、PIP2の濃度の単位をモルとして入力する必要があります。アッセイステップを定義するには、ステップを選択し、それぞれのカラムをダブルクリックします。アッセイ定義の複製がコントロールセンサーに設定されます。rpm を 1, 000 に設定します。ベースラインステップに1分、ロード、関連付け、および解離にそれぞれ5分から10分を選択します。室温でテストを実行します。センサーを含む列をクリックし、[塗りつぶし] をクリックして、センサー トレイ内のセンサーの位置を示します。計画されたすべての手順を確認して間違いを確認し、修正するために戻ってください。BLIアッセイの全体的な操作では、計画されたすべてのステップをレビューするステップは、研究者によって無視される可能性があります。ただし、計画されたすべての手順が正しいことを確認することが非常に重要です。データファイルの場所を設定し、[Go]をクリックしてアッセイを開始します。アッセイを実行し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。このパッチクランプ実験でhEAG1を安定して発現するHEK293 T細胞で見られるように、電位依存性の外向きカリウム電流は、機能的なhEAG1チャネルが細胞内で高度に発現していることを示唆しています。抗FLAG抗体を使用すると、精製されたタンパク質サンプルからのhEAG1のウェスタンブロットは、精製されたタンパク質の品質と特異性を示しています。精製したチャネルタンパク質をビオチン化して、リアルタイムBLIアッセイを用いて脂質PIP2との相互作用アッセイを行った。hEAG1とPIP2の間の典型的な結合曲線をここに示しています。hEAG1は濃度依存的にPIP2に結合しています。PIP2の蓄積濃度は、バイオセンサーのデータトレースに対応します。この代表的なアッセイは、PIP2の異なる濃度における光干渉の変化を示しています。最後に、異なるPIP2濃度で測定した光干渉信号のピーク値からヒル方程式に適合する曲線を取得し、hEAG1とPIP2の間の平衡解離定数を決定しました。このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば1時間ほどでできるようになります。この手順を試みるときは、この手順が正しいことを確認するために、計画されたすべての手順を確認することを忘れないでください。この手順に続いて、小分子に結合した後のこのイオンチャネルの機能を特定するなどの追加の質問に答えるために、パッチクランプなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、イオンチャネルのリガンドスクリーニングの分野の研究者がイオンチャネル創薬における新しいリガンドを探求する道を開きました。このビデオを見れば、BLI法を使用してイオンチャネルタンパク質を調製する方法と、低分子との相互作用をテストする方法について十分に理解できるはずです。

capturing-interaction-kinetics-an-ion-channel-protein-with-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、リガンドと標的分析物との間の分子間相互作用をリアルタイムで検出するバイオレイヤー干渉法(BLI)技術を実演します。BLIは、バイオセンサー表面の固定化されたリガンドの層から反射された白色光が溶液中の分析対象物と相互作用する際の干渉パターンの変化を測定します。...

リガンドと分析物間の相互作用を検出するためのバイオレイヤー干渉法技術

ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 - タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法を適応している。...

タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

RNAポリメラーゼとの転写因子(TF)の相互作用は、通常、プルダウンアッセイを用いて研究される。我々は、クラミジアRNAポリメラーゼとのGrgAの相互作用を特徴付けるためにバイオレイヤー干渉計(BLI)技術を適用する。プルダウンアッセイと比較して、BLIはリアルタイムの関連付けと解離を検出し、より高い感度を提供し、高い定量性を提供します。...

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

このプロトコルでは、TIRF顕微鏡を使用して個々のイオンチャネルを追跡し、支持された脂質膜におけるそれらの活性を決定し、それによって側方膜の動きとチャネル機能の間の相互作用を定義する方法について説明します。メンブレンの準備、データの記録、および結果の分析方法について説明します。...

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

この記事では、ストレプトアビジンベースの生体層干渉法(BLI)システムを使用してDNA-タンパク質相互作用を研究するためのプロトコルについて説明します。本稿では、相互作用の平衡結合親和性(KD)を決定するために、基本的または高度な結合動力学を利用するための基本的なステップと考慮事項を概説しています。...

ストレプトアビジンベースの生体層干渉法によるDNA-タンパク質相互作用の解析

HCNチャネルとそれらの補助サブユニット間の相互作用は、大うつ病性障害における治療標的として同定されています。ここで、このタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための蛍光偏光ベースの方法が提供されます。...

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

機械刺激感受性イオン チャネルは、パッチク ランプ記録を持つ流体の流れ/せん断力感度の面でよく勉強しました。ただし、実験的プロトコルによってイオン...

オープン パッチ ・ クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオン チャネルの制御の流れ

学ぶバイオ層干渉法によるhEAG1イオンチャネルとPIP2の相互作用測定法。少量のタンパク質で高スループットなリガンドスクリーニングが可能です。イオンチャネル創薬研究に応用できます。

バイオ層干渉法による小分子とイオンチャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

さらに動画を探す

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

さらに動画を探す

バイオ層干渉法による小分子とイオンチャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ