バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

このバイオレイヤー干渉法またはBLIアッセイの全体的な目標は、精製されたhEAG1イオンチャネルタンパク質と低分子脂質との間の潜在的な相互作用を測定することです。この方法は、目的の小分子がこのイオンチャネルと直接相互作用できるかどうか、相互作用の速度論は何かなど、イオンチャネル薬理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、手間がかからず、高スループットの方法であることです。

必要なのは、固定化タンパク質の量だけです。一般に、この分析法に不慣れな人は、アッセイを成功させるためには、タンパク質発現、精製、標識、正確に調整されたセンサー、データ解析など、複数のステップが必要なため、苦労するでしょう。hEAG1を発現するHEK293 T細胞を2〜3日間培養した後、増殖培地を取り出して細胞を回収し、4ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。

PBSを廃棄します。細胞を皿ごとに2ミリリットルのPBSにスケープし、1ミリリットルのピペットを使用して細胞を15ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を重力420倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

次に、上清をデカントし、4ミリリットルの溶解緩衝液を使用してペレットを再懸濁します。懸濁液を氷上で30分間インキュベートし、10分ごとにライセートを完全にボルテックスします。次に、細胞溶解物を重力の12,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。

次に、上清を5ミリリットルのチューブに移し、すぐに使用できるように氷の上に置いておきます。抗FLAG M2アフィニティー樹脂を調製するには、抗FLAG M2フィニティゲルのボトルがゲルビーズの均一な懸濁液であることを確認するために、樹脂を穏やかに反転して樹脂を完全に懸濁します。すぐに400マイクロリットルの懸濁液を冷やした1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、懸濁液を重力8,000倍、摂氏4度で30秒間遠心分離し、上澄みを慎重に廃棄して貯蔵バッファーを洗い流します。樹脂ペレットを再懸濁するには、500マイクロリットルのタンパク質抽出物上清を樹脂に加え、懸濁液を新しい冷却された5ミリリットルのチューブに移します。さらに500マイクロリットルのタンパク質抽出物を元のチューブにピペットで入れて残りのビーズを収集し、抽出物を5ミリリットルのチューブに移します。

混合物をシェーカーで8rpm、摂氏4度で一晩インキュベートし、FLAG融合タンパク質を樹脂に結合させます。次に、混合物を重力の1, 000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルの1 x PBSで3回洗浄します。

すぐに使用できるように氷の上に置いてください。390マイクロリットルのPBSに10マイクロリットルの3 x FLAG溶出溶液を添加し、最終濃度を200ナノグラム/マイクロリットルにします。次に、400マイクロリットルの3 x FLAG溶出溶液を、あらかじめ調製したゲルビーズに加えます。

サンプルを8rpm、4°Cの振とうインキュベーターで2時間インキュベートします。次に、レジンを重力8000倍で30秒間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、すぐに使用できるように摂氏4度で保管します。

製造元の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを使用し、精製されたタンパク質の濃度を測定してください。次に、30 μLのサンプルを抗Flag抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用し、目的のタンパク質が精製されたことを確認します。精製したタンパク質をビオチンで標識するには、PBS中のビオチンストック溶液1ミリリットルあたり5ミリグラムを調製します。

2つのバイオセンサーの各試験で、精製タンパク質20μgに3倍モル過剰のビオチンを添加して、PBS中の精製タンパク質の好ましいN末端ビオチン化を達成します。サンプルを氷上で暗所で少なくとも30分間インキュベートします。未結合のビオチンとバッファーを除去するには、タンパク質をSDバッファーに交換します。

タンパク質を30キロダルトンの分子カットオフを備えた限外ろ過装置に移します。次に、SDバッファーを追加し、サンプルを12, 000倍の重力と摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離管から限外濾液を取り出します。

200マイクロリットルのSDバッファーをフィルター装置に加え、サンプルを再度遠心分離します。このプロセスを少なくとも 3 回繰り返します。ろ過装置を裏返してバッファー交換したサンプルを採取し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。

サンプルを重力の 2, 000 倍、摂氏 4 度で 5 分間遠心分離します。サンプルは氷上に置いておいて、すぐに使用できます。BLIアッセイを実施するには、研究の30分前に、装置の電源を入れて装置を予温します。

装置のステータスウィンドウをチェックして、マシンが準備完了状態にあることを確認してから開始します。データ集録ソフトウェアを開く前に、装置のドアが閉じていることを確認し、実験ウィザードで「New Kinetics Experiment」を選択します。96ウェルプレートで使用するウェルを定義するには、右クリックしてバッファー、負荷量、およびサンプルを選択します。

サンプルウェルの場合、PIP2の濃度の単位をモルとして入力する必要があります。アッセイステップを定義するには、ステップを選択し、それぞれのカラムをダブルクリックします。アッセイ定義の複製がコントロールセンサーに設定されます。

rpm を 1, 000 に設定します。ベースラインステップに1分、ロード、関連付け、および解離にそれぞれ5分から10分を選択します。室温でテストを実行します。

センサーを含む列をクリックし、[塗りつぶし] をクリックして、センサー トレイ内のセンサーの位置を示します。計画されたすべての手順を確認して間違いを確認し、修正するために戻ってください。BLIアッセイの全体的な操作では、計画されたすべてのステップをレビューするステップは、研究者によって無視される可能性があります。

ただし、計画されたすべての手順が正しいことを確認することが非常に重要です。データファイルの場所を設定し、[Go]をクリックしてアッセイを開始します。アッセイを実行し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。

このパッチクランプ実験でhEAG1を安定して発現するHEK293 T細胞で見られるように、電位依存性の外向きカリウム電流は、機能的なhEAG1チャネルが細胞内で高度に発現していることを示唆しています。抗FLAG抗体を使用すると、精製されたタンパク質サンプルからのhEAG1のウェスタンブロットは、精製されたタンパク質の品質と特異性を示しています。精製したチャネルタンパク質をビオチン化して、リアルタイムBLIアッセイを用いて脂質PIP2との相互作用アッセイを行った。

hEAG1とPIP2の間の典型的な結合曲線をここに示しています。hEAG1は濃度依存的にPIP2に結合しています。PIP2の蓄積濃度は、バイオセンサーのデータトレースに対応します。

この代表的なアッセイは、PIP2の異なる濃度における光干渉の変化を示しています。最後に、異なるPIP2濃度で測定した光干渉信号のピーク値からヒル方程式に適合する曲線を取得し、hEAG1とPIP2の間の平衡解離定数を決定しました。このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば1時間ほどでできるようになります。

この手順を試みるときは、この手順が正しいことを確認するために、計画されたすべての手順を確認することを忘れないでください。この手順に続いて、小分子に結合した後のこのイオンチャネルの機能を特定するなどの追加の質問に答えるために、パッチクランプなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、イオンチャネルのリガンドスクリーニングの分野の研究者がイオンチャネル創薬における新しいリガンドを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、BLI法を使用してイオンチャネルタンパク質を調製する方法と、低分子との相互作用をテストする方法について十分に理解できるはずです。