4.11: 密度勾配遠心

密度勾配超遠心分離は、生化学実験のために細胞構造を単離および精製するための一般的なアプローチです。この手法では、高速または超遠心分離機を使用して、密度勾配で細胞成分を非破壊的に分離します。このビデオでは、密度勾配超遠心分離の原理を説明し、ショ糖勾配を使用した一般的な手順を提供し、いくつかのアプリケーションについて説明します。

まず、超遠心分離機と密度勾配の原理を調べることから始めましょう。懸濁液は、液体溶媒中に粒子を含んでいます。重力により、溶剤よりも密度の高い粒子は沈殿物から排出されますが、溶剤よりも密度の低い粒子は浮かびます。粒子と溶媒の密度差が大きいほど、分離は速くなります。

超遠心分離機にはローターと呼ばれるユニットが含まれており、ローターは高度に制御された速度で回転し、強い重力場をシミュレートします。このフィールド内では、粒子と溶媒の間の密度の違いが拡大されます。

磁場の強さは、回転速度に依存します。比較的低い回転速度の小さなローターでさえ、地球の重力場の数千倍の力を生み出すことができます。

チューブに密度の異なる複数の液体が含まれている場合、遠心分離により、密度の順に別々の層に保持され、最も密度の高い液体がベースに最も近いものになります。このような複数の液体の層を「密度勾配」と呼びます。2つのタイプがあります。ステップグラデーションでは、密度が減少する液体が慎重に重ねられます。連続的なグラジエントでは、液体はさまざまな比率で混合されるため、密度はベースから上に向かって滑らかに減少します。

細胞小器官は、「等比密度勾配遠心分離法」により、ステップ勾配を用いて分離することができます。これは、最も簡単で最も一般的な遠心分離手順です。

この手順は、細胞構造を分離するために使用されます。細胞小器官の密度が高いほど、細胞小器官は下降し、上部にミトコンドリア、下部に核酸があります。

この手法の背後にある原理がわかったところで、研究室で見てみましょう。

手順を開始する前に、メーカーの速度と密度の定格に注意し、超遠心分離機に腐食がないか確認する必要があります。この手順では、スイングバケットローターを使用します。

まず、細胞材料は細胞を均質化することによって調製され、細胞小器官が非破壊的に放出されます。ホモジネートは、低密度成分を除去するために、予備的な低速遠心分離によって分画することができます。次に、スクロース溶液を調製します。

ショ糖は量を増やして添加されるため、各溶液は前の溶液よりも濃縮され、したがって密度が高くなります。溶液の正確な密度は、分離する成分に依存し、生物によって異なります。溶液は、分離する成分の密度間に密度があり、最後の溶液は分析物の最も密度の高い成分よりも密度が高い必要があります。ここでは、核酸など、ショ糖よりも密度の高い成分を分離する技術について説明します。

これで、スクロースの勾配がきれいな遠心分離チューブで作成されます。ピペットを使用して、最も濃縮されたショ糖溶液を吸い上げます。チューブを直立させた状態で、ピペットの先端を壁に対して高い位置に置き、液体を着実に分注します。作業エリアに振動やその他の障害がないようにすることが重要です。

チップを交換した後、残りの溶液は密度が小さい順に追加されます。それらは、明確な層を形成し、混合を避けるために慎重に分配されます。最後に、約半ミリリットルの細胞サンプルをグラジエントの上に加え、チューブを秤量します。これは、プロセスの次のステップである重量配分のバランスをとるために使用されます。

遠心分離はできるだけ早く開始する必要があります。チューブはローターに配置され、ローターは、同じ重量のブランク溶液を反対側のスロットに配置することによってバランスを取ります。ローターは超遠心分離機に配置され、システムは密閉されます。温度と回転速度と時間が設定されます。一般的な値は 4 ?100,000 x g以上の力で16時間かけてC.

遠心分離後、チューブをローターから引き抜き、ローターを直立させて邪魔されないように注意します。異なる細胞成分は、溶液層間で個別のバンドに分画されています。フラクションはシリンジで収集できます。あるいは、チューブの底部を滅菌した細い針で穴を開け、流出物を滅菌チューブに集めることもできます。これで、細胞成分が分離されました。これらは -80 ?C.

基本的な手順を見てきましたので、いくつかのアプリケーションを見てみましょう。

典型的な用途は、植物細胞における多タンパク質複合体の単離です。この例では、光合成における光反応の部位であるチラコイドから、周期的な電子の流れに関与する錯体が単離されています。この手順では、14〜45%のスクロースの離散溶液を使用します。遠心分離は、100,000 x gで14時間、4°Cで行われます。

核酸はショ糖よりも密度が高いため、アイソピクニック遠心分離では細胞小器官から非破壊的に核酸を分離することはできません。

「レートゾーン遠心分離」として知られる別の技術が使用されます。それは、その密度だけでなく、それらの立体配座にも依存する沈降速度に基づいてオルガネラを分離します。連続グラデーションは、このプロパティに基づいてコンポーネントを分離するために使用されます。

手続きの手順は、等精度の場合の手順と似ています。この例では、RNA-リボソーム複合体を5%〜20%の連続グラジエントを用いて単離し、230,000 x gで遠心分離します。遠心分離は、共沈を防ぐために数時間後に中断されます。

核酸鎖は、密度に基づいて互いに分離することができます。

これは、グアニンとシトシンが豊富なストランドは、アデニンとチアミンが豊富なストランドよりも密度が高いためです。この場合、スクロースは核酸よりも密度が低いため、勾配をスクロースで作ることはできません。代わりに、十分な密度と低粘度を持つ塩化セシウムグラジエント、通常は1.65〜1.75 g / mLが使用されます。

ここでは、プランクトンDNAが連続的な塩化セシウム勾配を使用して精製されていることがわかります。遠心分離は、真空下で1,000,000 x g以上で18時間行われます。

JoVEのショ糖密度勾配による超遠心分離に関するビデオをご覧になりました。これで、密度勾配の仕組み、ステップ勾配の構築方法、超遠心分離機の装填方法と操作方法を理解できたと思います。ご覧いただきありがとうございます!