4.10: タンパク質の吸光光度定量

サンプル中のタンパク質の濃度を測定することは、多くの生化学アッセイにおける基本的なステップです。測光測定は、小さなサンプルサイズで行うことができます。サンプルに含まれる光吸収物質が多いほど、光がサンプルを通過する光は少なくなります。これにより、吸収物質の定量的測定が可能になります。これらの概念は科学にとって非常に基本的なものであり、そのうちの2つの手法を紹介した記事は、史上最も引用された3つの論文に含まれています。このビデオでは、最も一般的な測光タンパク質測定技術の背後にある概念、それらがどのように実行されるか、および収集されたデータがどのように分析されるかを示します。

フォトメトリックタンパク質の測定は、濃度と光吸収性の関係に基づいています。これはランベルトベールの法則として知られており、光を吸収する種の濃度はその吸光度に比例すると述べています。

この原理は、すべての測光タンパク質測定法の基礎となっています。

直接吸収分析では、未修飾のタンパク質サンプルの吸光度値が測定されます。トリプトファン残基とチロシン残基は、芳香族側鎖があるため、280nmの波長で最高の吸光度測定値が得られます。

しかし、これらのアミノ酸は、タンパク質の中で最も頻度の低い2つであり、すべてのタンパク質に異なる量で存在するため、各測定は異なります。この制限を克服するために、これらのアミノ酸に依存しない、より複雑なアッセイが開発されました。

一例は、着色色素をサンプルに添加するBradford Assayです。クマシーブルーとして知られるこの染料は、タンパク質が多ければ多いほど、色素との結合イベントが多くなるほど、比例して反応します。

次に、594 nmで光を吸収する結合したCoomassie Blue色素の吸光度を測定することにより、タンパク質濃度を決定します。ただし、Bradfordアッセイは短範囲の濃度で直線的であるため、分析前に希釈が必要になることがよくあります。

Lowry法は、銅イオンをアルカリ性にしてペプチド結合と反応させるBiuret試薬と、芳香族タンパク質残基を酸化するFolin-Cioc?lteu試薬を組み合わせたものです。結果として生じるサンプルの色の変化は、タンパク質濃度に比例します。

還元されたFolin試薬の吸光度は、750 nmで測定できます。直接吸収と同様に、各タンパク質には独自の応答があり、目的のタンパク質に合わせて調整する必要があります。さて、最も一般的なアッセイのいくつかの背後にある基本原理を確認したので、直接吸収とブラッドフォードアッセイがどのように行われるかを見てみましょう。

直接吸収分析を開始するには、分光光度計をブランクで校正して吸光度がゼロかどうかを判断します。検量線の作成に使用するための標準溶液が用意されています。次に、最初の標準のアリコートをキュベットに加え、分光光度計に入れます。

次に、280 nmでの吸光度値を記録します。このプロセスは、各標準に対して繰り返され、実行ごとに清潔なキュベットを使用します。完了すると、吸光度と濃度をプロットして検量線が作成されます。この線の傾きはモル減衰係数であり、吸光度と濃度を関連付けます。

次に、未知のサンプルをキュベットに加え、吸光度値を記録します。異なる測光測定法のデータ分析は類似しているため、Bradfordアッセイを見た後にそれについて説明します。

ここでは、Bradfordタンパク質アッセイをBSA標準試料を用いて96ウェルプレートで実施します。まず、BSAストック溶液を準備します。

未知化合物の溶液を脱イオン水で希釈し、濃度がアッセイの範囲内にあることを確認します。キットによっては、クマシー染料も希釈が必要な場合があります。次に、BSA標準試料を96ウェルプレートに添加することにより、検量線を設定します。

脱イオン水は、標準曲線を生成するために必要な濃度に達するまで追加されます。未知のサンプルは、正確な測定が行われるように、プレートに3回で追加する必要があります。次に、クマシー染料を各ウェルに加え、ピペットと混合します。

脱イオン水は、吸光度を測定するために、空の井戸にブランクとして加えられます。色素が結合するまで5分間待った後、吸光度をプレートリーダーで590nmで測定します。

いくつかのアッセイを実行したので、データの分析方法を見てみましょう。各測光タンパク質測定法は、ランベルトベールの法則に基づいています。

測定された標準試料の吸光度は、検量線を作成するために使用され、その後、未知のサンプルの濃度を決定するために使用されます。この曲線は手動でプロットできますが、すべての標準が測定されると、新しい分光光度ツールによって検量線が作成されます。これらのシステムは、未知のサンプルが分析されるときにタンパク質濃度も計算します。

フォトメトリックタンパク質測定データの解析方法を確認したところで、これらの手順がどのように活用されているかを見てみましょう。

光度タンパク質測定の原理は、核酸濃度を直接測定するためにも使用できます。nanodrop分光光度計は、光学的に活性な台座に非常に少量のサンプルを受け入れます。その後、吸光度が測定され、システムが自動的に核酸濃度を決定します。タンパク質やその他の供給源が測定に干渉する可能性があるため、サンプルの純度は、260 nm から 280 nm と 260 から 230 nm の吸光度比を分析することによって決定されます。純粋な核酸は、通常、DNAとRNAでそれぞれ約1.8と約2.0の比率をもたらします。

光度タンパク質測定は、特定の細胞応答を誘発するために自然から着想を得た生体模倣材料の製造にも使用できます。組換えアドヘシンはポリスチレンビーズに結合し、宿主細胞への細菌の付着をシミュレートします。Bradfordアッセイは、生体模倣材料の製造におけるビーズへの組換え接着の結合効率を決定するために使用されます。

代替のフォトメトリックタンパク質アッセイは、タンパク質抗菌薬の検出と特性評価に使用できます。レマゾールブリリアントブルーR色素は、熱死菌に共有結合しています。タンパク質抗菌剤は、染色溶液中でインキュベートされます。次に、サンプルを遠心分離し、マイクロプレート分光光度計を使用して595nmの上清の吸光度を測定します。標識された細菌から上清に放出される可溶性色素による吸光度の増加は、酵素活性の定量的測定です。

JoVEのフォトメトリックタンパク質測定に関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、測光測定の基本原理を説明し、いくつかの一般的なアッセイの一般的な手順について説明し、技術の新たな進歩を取り上げました。ご覧いただきありがとうございます!