副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして OTX1、OTX2 の同定

この実験の全体的な目的は、単純かつ効率的な方法で、正気癌および嗅覚神経芽細胞腫に有用な分子マーカーを同定することです。この方法は、腫瘍サブタイプを識別するための分子マーカーの同定など、嗅覚神経芽細胞腫および副癌の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、6時間以内、または病院の報告書のために1日以内に結果を得ることができるということです。

RNA抽出とリアルタイムPCRの手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生であるジョルジア・ミレファンティ博士です。そして、免疫染色法の手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生でもあるジョヴァンニ・ミケロニです。処置を開始するには、頭頸部腫瘍のWHO分類に従って、すべてのヒトFFPEサンプルを収集し、異なるサブグループに分ける。

サンプルスライドをオーブンで60°Cで30分間加熱します。次に、3マイクロメートルの厚いFFPE切片を10分間、キシレンで短時間洗浄して水分補給を行います。その後、100%95%85%および75%アルコールで、各洗浄を5分間連続して洗浄します。

蒸留水でスライドを5分間すすます。続いて、12分間、3%過酸化水素水にスライドを入れることにより内因活性を遮断する。その後、10ミリモルのクエン酸バッファーでスライドを処理し、10分間マイクロウェーブすることにより抗原検索を行う。

10分後、TBSバッファーでセクションを洗浄します。その後、トリトンXの0.2%を加え、ヤギ抗ヒトOTX2抗体で摂氏4度で一晩インキュベートし、1〜100倍に希釈します。翌日、ビオチン化ウサギの抗ヤギ二次抗体を1~200で希釈し、室温で1時間培養します。

次いで、ABCペルオキシダーゼ複合体でサンプルを処理する。その後、ジアミノベンゼンテトラヒドロクロリドを用いた免疫反応を開発し、ハリスヘマトキシリンで核を逆染色する。次いで、三日月のアルコールスケールでセクションを脱水し、ターピン起源のクリア物質でそれらを明確にします。

次に、取り付け媒体付きスライドにセクションを取り付けます。RNA抽出と逆転写の後、プローブベースの技術とサーマルサイクラーを用いて定量的なリアルタイムPCR解析を行います。12.5マイクロリットルのプローブベースのマスターミックス、各OTX1、OTX2、およびACTBプローブの1.25マイクロリットル、CDNAの50ナノグラム、およびヌクレアーゼフリーウォーターを使用して、総体積の25マイクロリットルまでPCR反応ミックスを調製します。

遺伝子発現レベルを正常化する内因性制御としてACTB遺伝子を用いて、三重化中のすべての反応を行う。次に、プレートを1109倍の重力で3分間遠心する。その後、実験まで、光から保護されたプレートを摂氏4度で保管します。

リアルタイム PCR を実行するには、サンプルを機械に入れます。次に、最初のホットスタートサイクルを摂氏50度で2分間、摂氏95度で10分間設定し、続いて摂氏95度で40サイクル、摂氏60度で1分間最終サイクルを設定します。遺伝子発現量解析では、内因性制御としてACTB遺伝子を用いた比較サイクル閾値法を経て遺伝子発現レベルを正常化する。

比較サイクル閾値法を用いて遺伝子発現レベルを評価し、その結果をプロットする。次に、学生のt検定を用いて統計解析を行い、統計的に有意な結果をp

OTX1の核発現は、すべての非腸管型腺癌サンプルで発見されたが、ほとんどまたは存在しない免疫反応性は、腸内型腺癌において強調された。全ての嗅覚神経芽細胞腫に強い免疫反応性が存在していた。すべての分化不良の神経内分泌癌の中で、OTX発現は陽性細胞の強度および割合が変化した。

この手順を試みている間、滅菌装置も使用して無菌状態でRNA抽出の一歩一歩を行うことを覚えておくことが重要です。この手順と並行して、X線分析、鼻腔の内視鏡検査、CTスキャン、磁気共鳴画像法、生検などの他の方法を、我々の技術から得られた結果を確認するために行うことができる。その開発後、この技術は、腫瘍学の分野の研究者が細胞モデルでこの病気を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、免疫組織化学とリアルタイムPCRを使用して腫瘍サブタイプを識別する分子マーカーを同定する方法をよく理解する必要があります。これらの試薬、計装、サンプルの使用は非常に危険であり、DPIなどの予防措置は常にこれらの手順を実行する際に必ず取られるべきであることを忘れないでください。