Name: 副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして OTX1、OTX2 の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶ免疫組織化学とリアルタイムPCRによる副鼻腔癌および嗅神経芽細胞腫の分子マーカー同定法。OTX1・OTX2発現解析により腫瘍亜型の迅速な鑑別診断が可能となり、臨床現場での効率的な診断プロトコール構築に貢献する。

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この仕事に支えられセントロ グランディ楽器そして dell'Insubria、財団 Comunitaria ・ デル ・ Varesotto 財団・ デル ・ モンテ ・ ディ ・ ロンバルディアとスタンパーリアラヴェッロ アンナ ヴィラ e フェリーチェ Rusconi。

インフォームド コンセントを書かれており、ヴァレーゼの Insubria 大学の倫理委員会の承認とヘルシンキ (1975 年) の宣言によるとすべての研究を行った。
1. サンプルの収集
<ol><li>収集し、すべての人間の Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) サンプルを14頭と首の腫瘍の WHO の分類によると別のサブグループに分けます。 注:ここで次のサンプルを使用: コントロール (10 サンプル); として通常副鼻腔粘膜倒立乳頭腫 (ICD-O コード 8121/1 IP)副鼻腔 ITAC (ICD-O コード 8144/3 32 サンプル);NITAC (ICD-O コード 8140/3 12 サンプル);腺様嚢胞癌 (ACC、ICD-O コード 8200/3);多形性腺腫 (ICD-O コード 8941/3 PA)(ICD-O コード 9522/3 13 サンプル);不十分な低分化神経内分泌癌 (PDNEC、ICD-O コード 8041/3 19 サンプル);神経内分泌腫瘍 (NET、ICD-O コード 8041/3)。</li>
</ol>2. 免疫
<ol><li>
Deparaffinization セクションの退避とステータス復元
	<ol>
<li>30 分の 60 ° C のオーブンでスライドのサンプルを加熱し、水にアルコール系を使用して 3 μ m 厚 FFPE セクションを水分補給。</li>
		<li>簡単に 10 分のキシレンのスライドを洗浄し、この手順を繰り返します100% アルコールに 5 分用のスライドを洗浄し、連続 95%, 85%, 75% のアルコールを使用してこの手順を繰り返します。蒸留水で 5 分用のスライドをすすいでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
内因性のアクティビティをブロック
	<ol>
<li>12 分間 3% 過酸化水素でスライドを配置することによって、内因性の活動をブロックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗原検索
	<ol>
<li>10 mm クエン酸緩衝液 (6) マイクロ波治療で 10 分間処理することによって抗原検索を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
一次抗体の孵化
	<ol>
<li>TBS バッファー (pH 7.4) のセクションを洗浄し、ブロッキング溶液中 10 分間を追加します。</li>
		<li>TBS バッファー (pH 7.4) のセクションを洗浄し、0.2% トリトン X を追加します。</li>
		<li>ヤギ抗ひと OTX2 抗体希釈 1: 100 で 4 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
二次抗体の孵化
	<ol>
<li>ビオチン標識ウサギの反やぎ二次抗体希釈 1: 200 ABC ペルオキシダーゼ複合体が続くと部屋の温度で 1 時間セクションを孵化させなさい (教材の一覧表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
導管を開発
	<ol>
<li>3, 3'-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride を用いた抗原抗体反応の開発および counterstain ハリス ヘマトキシリンで核。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
取り付けとイメージング
	<ol>
<li>三日月のアルコール スケールを使用してセクションを脱水してテルペン由来の清算物質を使用してそれらを明らかにする (材料の表を参照してください)。メディアをマウントのセクションを埋め込む、顕微鏡スライドの上セクションに配置およびセクションを光学顕微鏡で観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RNA の抽出および逆のトランスクリプション
<ol><li>
RNA の抽出
	<ol>
<li>免疫沈降プロトコル (セクション 2.1 を参照) の最初のステップを実行することによって、セクションから RNA を抽出し、蒸留水でスライドを保ちます。対応するヘマトキシリン-エオシン染色が関心のフラグメントを識別するためにセクションを染色無染色のセクションをオーバー ラップします。</li>
		<li>FFPE サンプル (材料の表を参照)、次の製造元の指示の商業 RNA 抽出キットを使用して RNA の抽出を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 逆転写
	<ol>
<li>レトロは cDNA に、RNA を転写する市販のキットを使用して (材料表参照) プロトコルに従います。いくつかを分析するための総 RNA の少なくとも 1,000 のレトロ-議事録 ng。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. リアルタイム PCR およびデータ解析
<ol><li>
リアルタイム PCR
	<ol>
<li>プローブ ベースの技術と定量的リアルタイム PCR 解析 (qRT PCR) を実行 (材料の表を参照してください)、サーマルサイクラー。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR の反作用の組合せの準備
	<ol>
<li>プローブ ベースのマスターの組合せの 12.5 μ L を使用して PCR 反応混合物の準備、ACTB、OTX2、OTX1 各 1.25 μ プローブ (材料の表を参照)、50 ng の cDNA とヌクレアーゼ フリー水総量の最大 25 μ L。</li>
		<li>遺伝子発現のレベルを正規化する内因性制御として ACTB 遺伝子を用いた 3 通すべての反応を実行します。</li>
		<li>3 分間 1,109 x gでプレートを遠心し、実験まで 4 ° C で光から保護プレートは保管します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
熱 cycler を設定
	<ol>
<li>50 ° c 2 分、95 ° C 10 分サイクルの初期のホット スタートでサーマルサイクラー プロファイル設定は続いて 40 サイクル 95 ° C で 15 秒と 1 分の 60 ° C で最終的なサイクル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
遺伝子発現レベル解析
	<ol>
<li>内因性制御として ACTB 遺伝子を用いた比較サイクルしきい値 (ΔCt) による遺伝子発現レベルを正規化します。</li>
		<li>2-ΔCt法を用いた遺伝子発現レベルを評価し、結果をプロットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
統計解析
	<ol>
<li>学生のtを使用して統計解析の実行-テスト、 p < 0.05 と統計的に有意な結果を考慮しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+genes+in+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+genet%22%5BJournal%5D)">Homeobox genes in the developing central nervous system.</a> Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).</li>
<li>Omodei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Brain+Transcription+Factor+OTX1+Occurs+in+a+Subset+of+Normal+Germinal-Center+B+Cells+and+in+Aggressive+Non-Hodgkin+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma.</a> American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).</li>
<li>Levantini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsuspected+role+of+the+brain+morphogenetic+gene+Otx1+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).</li>
<li>Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+homeobox+OTX2+and+OTX1+in+the+early+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).</li>
<li>Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+homeobox+gene+expression+in+cancer%3A+cause+or+consequence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence?</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).</li>
<li>de Haas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTX1+and+OTX2+expression+correlates+with+the+clinicopathologic+classification+of+medulloblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).</li>
<li>Terrinoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTX1+expression+in+breast+cancer+is+regulated+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53.</a> Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).</li>
<li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTX1+promotes+colorectal+cancer+progression+through+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+CRX+and+OTX2+expression+in+human+retina+and+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma.</a> J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).</li>
<li>Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+the+cell+cycle+in+mammary+gland+development+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+mammary+gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis.</a> J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).</li>
<li>Cordes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+phenotypic+analysis+of+poorly+differentiated+sinonasal+neoplasms%3A+an+integrated+approach+for+early+diagnosis+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification.</a> Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).</li>
<li>Stelow, E. B., Bishop, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+from+the+4th+Edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Head+and+Neck+Tumours%3A+Tumors+of+the+Nasal+Cavity%2C+Paranasal+Sinuses+and+Skull+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Pathol%22%5BJournal%5D)">Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base.</a> Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).</li>
<li>Llorente, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinonasal+carcinoma%3A+clinical%2C+pathological%2C+genetic+and+therapeutic+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).</li>
<li>Sidransky, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Lester_Thompson/publication/7200778_World_Health_Organization_classification_of_tumours_Pathology_and_genetics_of_head_and_neck_tumours/links/09e415102df86bd4a2000000.pdf">World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors</a>. 9, WHO Press. (2005).</li>
<li>Radulesku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+surgery+for+sinonasal+tumors%3A+The+transcribriform+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stomatol+Oral+Maxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach.</a> J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).</li>
<li>Muller, P. A. J., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/ncb2641">p53 mutations in cancer.</a> Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Holmila, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+TP53+gene+mutations+in+sinonasal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer.</a> Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本研究は、はじめてであり、mRNA レベルに基づいて HB 遺伝子 OTX1 OTX2 通常副鼻腔粘膜と粘膜下腺、炎症性ポリープ、副鼻腔 Schneiderian 乳頭腫と別の表現と神経外胚葉性上皮腫瘍、扁平上皮癌、非腸型副鼻腔腺癌、唾液腺型腫瘍、神経内分泌腫瘍、およびアドオンを含みます。
変更とトラブルシューティング:
RNA の劣化を避けるためには、病理研究室で deparaffinization プロトコルを実行します。我々 はスライド傷後、すべてのサンプルが急速に冷却し、さらに使用までドライアイスに保管されます。無菌実験条件を維持するために、RNA の汚染を避けるために、滅菌のヒントと専用ピペットのセットを使用して層流安全フードの以降のすべての解析を行った。
技術の制限:
技術の主要な制限は、副鼻腔の空洞の腫瘍は、まれなので、サンプルの可用性に依存します。抽出した RNA の量は別の重要な問題、FFPE サンプルからの ...

OTXHB 遺伝子ショウジョウバエ orthodenticle 遺伝子 (otd) の脊椎動物ホモログと彼らは転写因子が胚の形態形成時に通常のエンコードしますが、異なる機能を持った大人の有機体で表すこともできます。.萌芽期の開発の間に細胞の識別、細胞分化および体 axis¹ の位置決めの仕様を制御します。OTXファミリには、さまざまな機能を表示するOTX1 、 OTX2遺伝子が含まれています。OTX1は脳および感覚的な器官の開発に関与しています。大人の有機体のそれは感覚器官で表され、下垂2; の前葉の低レベルで転写されます。また、多能性造血前駆細胞3で表現される造血に役割を果たしています。OTX2は吻側のヘッドの開発に関与し、モルフォゲンとして翻訳されたタンパク質行為を他の遺伝子をグラデーションを生成するのでがアクティブ化またはセルに貢献時空間的な抑圧増殖・分化します。大人の有機体では、 OTX2は脈絡叢および pineal 腺4排他的に見られます。
OTX遺伝子の突然変異は先天性、体や代謝の不具合に人間の姿によく関連しています。OTX遺伝子の利得または損失の突然変異は、細胞の成長や分化5を正しく制御することがされていない場合、腫瘍を促進でした。白血病や悪性リンパ腫も多くの固形腫瘍 (あり髄芽腫6など、積極的な非ホジキン リンパ腫2乳房癌7、大腸癌8、および網膜芽細胞腫9) のように、OTX HB 遺伝子の発現はよくとり上げられる10です。また、 OTX2突然変異は、無眼球、microphtalmia11目の開発の制御のこの遺伝子の重要な役割のための例で実証されています。
固形腫瘍の中では、分子および表現型マーカーの発見、診断、分類、および腫瘍の11鼻腔と副鼻腔で発生するものを含むいくつかの種類の治療のための重要な課題副鼻腔。実際には、それにもかかわらずこれらの区域を占めるのみささやかな解剖学的スペース、粘膜上皮、腺、軟部組織、骨、軟骨または神経/神経と hematolymphoid 細胞はしばしば複雑で、組織学的に別の起源のサイトをすることができます。腫瘍のグループ。副鼻腔管を含む腫瘍の種類は、通常上部延びる気道消化管または12体のほとんどの部分も全体に見られるものを克服するための機能の様々 なを紹介します。副鼻腔の悪性腫瘍はまれであり、1: 100,000 人の住民の年間発生率を世界中に存在、ので、腫瘍と代替治療戦略のテストに関与する経路に関する研究できません。これ、画像診断の進歩にもかかわらず、外科的アプローチと放射線治療副鼻腔癌の臨床管理を改善しています。さらに、細胞株、動物モデル、がん遺伝プロファイリングの開発現在将来癌標的治療13の基礎となります。日には、鼻腔、副鼻腔、上咽頭の腫瘍におけるOTX1および/またはOTX2式に関する報告はありません。以来、我々 は以前OTX1 、 OTX2が乳房癌7で関与していることを観察している、我々 はこれらの遺伝子が通常鼻の粘膜だけでなく、鼻腔内の腫瘍だけではなく存在できれば疑問。我々 は、「オスペダーレ ・ ディ ・ Circolo」ヴァレーゼ サンプルで正常粘膜および 2012 年までの 1985 年から収集し、分類される世界保健機構 (WHO) によると鼻腔と副鼻腔の腺癌の病理科から得られるこの目標を達成するには頭と首の腫瘍の分類。リアルタイム PCR および免疫組織化学的解析を通じてそれらを分析することを選択し、彼らがこれらのタイプの腫瘍の分子マーカーを考えることができるかどうかを決定するOTX1 、 OTX2式を評価しました。

<table><tbody><tr><td>RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation</td><td>Applied Biosystem</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystem</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystem</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7000&nbsp;</td><td>Applied Biosystem</td><td>270001857</td><td></td></tr><tr><td>ACTBプローブ</td><td>Applied Biosystem</td><td></td><td>生産終了。著作権</td></tr><tr><td>OTX1プローブ</td>によって保護されている配列Applied <td>Biosystem</td><td></td><td>生産終了。著作権OTX2プローブによって保護されている配列</td></tr>Applied <tr><td></td><td>Biosystem</td><td></td><td>は生産終了です。著作権により保護されている配列</td></tr><tr><td>Acqueous Hydrogen Peroxide</td><td>Merk</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>Citrate Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20276292</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101473728</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk</td><td>108382</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-OTX2 Antibody</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>生産終了。カタログ番号はありません</td></tr><tr><td>ウサギ 抗ヤギ抗体</td><td>ベクター研究所</td><td>BA5000</td><td></td></tr><tr><td>ABC-ペルオキシダーゼ 複合体</td><td>ベクター研究所</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン テトラヒドロクロライド (DAB)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>ハリス ヘマトキシリン</td><td>バイオプティカ</td><td>0506004/L</td><td></td></tr><tr><td>ペルテック</td><td>カルテック SRL</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>バイオクリア</td><td>バイオプティカ</td><td>W01030799</td><td></td></tr></tbody></table>

副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして otx1、otx2 の同定

Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas

OTX (HB) ホメオ ボックス遺伝子は胚形態形成期および大人の有機体の嗅上皮の開発中に表されます。これらの遺伝子で発生する突然変異は人間の腫瘍頻繁に関連しています。OTX遺伝子と鼻腔内の腫瘍の可能な相関について現在利用可能なデータはありません。この作業の目的は、 OTX1 、 OTX2を鼻腔内腫瘍の開発の分子マーカーとして考えることがかどうかを理解することです。我々 は、鼻腔と副鼻腔の腺癌の免疫組織化学的およびリアルタイム PCR 解析を通じてOTX1 、 OTX2遺伝子の発現を調査するを選択します。OTX1 、 OTX2欠席した副鼻腔腸型腺癌 (ITACs) のすべてのサンプルで。OTX1 mRNA は、嗅神経芽細胞腫 (アドオン) でのみ発現していたOTX2 mRNA 中非腸型腺癌 (NITACs) でのみ確認されました。副鼻腔腫瘍の種類を区別するために有用な分子マーカーをことがありますOTX1 、 OTX2遺伝子の遺伝子発現を確認しました。

正常粘膜 OTX 遺伝子繊毛の偽重層型呼吸上皮と粘膜下腺細胞 (図 1 a) の両方の強く、同種原子力反応が見られました。すべて NITACs のサンプル (図 1 b)、少し中または不在の免疫で OTX1 の核式 ITACs (図 1) で強調表示されたが分かった。強い免疫反応性があったすべてのアドオン (図 1)。PDNECs、間 OTX 式は強度と陽性細胞 (図 1E) の割合で変化。免疫組織化学的統計解析実行 Chi 正方形やフィッシャーの正確確率検定と実証 ITAC サンプル OTX 遺伝子の不在が有意 (n = 23、 p &lt; 0.01)。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

ホメオ ボックス遺伝子は遺伝子発現しばしば大人の有機体の腫瘍に関連付けられています。免疫組織化学的および正常および炎症性鼻粘膜や副鼻腔腫瘍診断と治療対象としてそれらを使用するためにリアルタイム PCR 解析による発現の比較を行った。

副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして OTX1、OTX2 の同定

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations ...

この実験の全体的な目的は、単純かつ効率的な方法で、正気癌および嗅覚神経芽細胞腫に有用な分子マーカーを同定することです。この方法は、腫瘍サブタイプを識別するための分子マーカーの同定など、嗅覚神経芽細胞腫および副癌の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、6時間以内、または病院の報告書のために1日以内に結果を得ることができるということです。RNA抽出とリアルタイムPCRの手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生であるジョルジア・ミレファンティ博士です。そして、免疫染色法の手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生でもあるジョヴァンニ・ミケロニです。処置を開始するには、頭頸部腫瘍のWHO分類に従って、すべてのヒトFFPEサンプルを収集し、異なるサブグループに分ける。サンプルスライドをオーブンで60°Cで30分間加熱します。次に、3マイクロメートルの厚いFFPE切片を10分間、キシレンで短時間洗浄して水分補給を行います。その後、100%95%85%および75%アルコールで、各洗浄を5分間連続して洗浄します。蒸留水でスライドを5分間すすます。続いて、12分間、3%過酸化水素水にスライドを入れることにより内因活性を遮断する。その後、10ミリモルのクエン酸バッファーでスライドを処理し、10分間マイクロウェーブすることにより抗原検索を行う。10分後、TBSバッファーでセクションを洗浄します。その後、トリトンXの0.2%を加え、ヤギ抗ヒトOTX2抗体で摂氏4度で一晩インキュベートし、1〜100倍に希釈します。翌日、ビオチン化ウサギの抗ヤギ二次抗体を1~200で希釈し、室温で1時間培養します。次いで、ABCペルオキシダーゼ複合体でサンプルを処理する。その後、ジアミノベンゼンテトラヒドロクロリドを用いた免疫反応を開発し、ハリスヘマトキシリンで核を逆染色する。次いで、三日月のアルコールスケールでセクションを脱水し、ターピン起源のクリア物質でそれらを明確にします。次に、取り付け媒体付きスライドにセクションを取り付けます。RNA抽出と逆転写の後、プローブベースの技術とサーマルサイクラーを用いて定量的なリアルタイムPCR解析を行います。12.5マイクロリットルのプローブベースのマスターミックス、各OTX1、OTX2、およびACTBプローブの1.25マイクロリットル、CDNAの50ナノグラム、およびヌクレアーゼフリーウォーターを使用して、総体積の25マイクロリットルまでPCR反応ミックスを調製します。遺伝子発現レベルを正常化する内因性制御としてACTB遺伝子を用いて、三重化中のすべての反応を行う。次に、プレートを1109倍の重力で3分間遠心する。その後、実験まで、光から保護されたプレートを摂氏4度で保管します。リアルタイム PCR を実行するには、

identification-otx1-otx2-as-two-possible-molecular-markers-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ここでは、ラットおよびヒトの鼻腔から嗅粘膜をbiopsyingための方法を説明します。これらの生検は、脳疾患の分子異常を識別したり、脳の外傷/疾患の動物モデルの細胞移植に利用することができる多能性成体幹細胞を単離するどちらにも使用できます。...

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

本研究では、双極性障害（BD）で治療反応のニューロン内の分子の署名を調査する新たなプラットフォームを開発し、検証した。 BD患者から嗅上皮は、鼻の生検によって得られた。その後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、BDにおけるリチウム応答の分子署名を調査するために、リアルタイムRT PCRと組み合わせた。...

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ

嗅覚ニューロンは、種々の軸索選別分子を発現して適切な神経回路を確立する。このプロトコルは、嗅覚ニューロンの軸索末端における軸索ソーティング分子のコンビナトリアル発現を視覚化する免疫組織化学的染色方法を記載している。...

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。...

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

バイオインフォマティクスは、大規模なデータセットを処理するのに便利な方法です。バイオインフォマティクスアプローチの実装を通じて、研究者は洞察力に富んだ応用や科学的発見を迅速かつ確実に、効率的に得ることができます。本稿では、卵巣癌研究におけるバイオインフォマティクスの活用を実証する。また、実験によるバイオインフォマティクスの所見の検証にも成功しています。...

卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の役割を理解するためのバイオインフォマティクスアプローチと実験的検証の統合

私たちは、遺伝子改変マウスの神経系新生物がヒトの病理を正確に再現しているかどうかを評価するための方法論を開発しました。本研究では、これらの組織学的手法、定義された病理学的基準、および培養方法論を、P...

遺伝子改変マウスモデルにおける悪性末梢神経鞘腫瘍の同定、診断、および悪性度判定

当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。...

病変同定のための乳腺全体マウントの分割

遺伝子改変マウスは、前立腺癌のメカニズムを調査するための有用なモデルです。識別とマウス泌尿生殖器から前立腺の丸い突出部を解剖、組織学に基づく区別と分離および下流解析の回転楕円体として体外主な前立腺細胞文化プロトコルをご紹介します。...

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュを宿主として用いたウイルスベースの二重蛍光標識腫瘍異種移植片モデルにおける最適化手順について説明する。この異種異種異種移植片モデルは、生体内の膵臓癌微小環境の組織組成を模倣し、パーソナライズされたzPDX(ゼブラフィッシュ患者由来異種移植片)モデルにおける薬物応答を評価するためのより正確なツールとして機能する。...

比較薬評価の宿主としてゼブラフィッシュ幼虫を用いた膵臓癌の患者由来異種異種移植片モデル

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs...

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

学ぶ免疫組織化学とリアルタイムPCRによる副鼻腔癌および嗅神経芽細胞腫の分子マーカー同定法。OTX1・OTX2発現解析により腫瘍亜型の迅速な鑑別診断が可能となり、臨床現場での効率的な診断プロトコール構築に貢献する。

副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして OTX1、OTX2 の同定

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