4.4: タンデム質量分析法

タンデム質量分析は、質量分析の複数の段階をリンクして、最初に生体分子を分離し、次にその化学組成の側面を決定します。生体分子は大きく複雑な構造を持っているため、その分子組成を決定することは困難です。タンデム質量分析は、目的の分子を選択し、後で複数のサブユニットに断片化することで、その同定と配列の解明に役立ちます。このビデオでは、タンデム質量分析の概念、一般的な手順、および生化学におけるその使用の一部を示します。

タンデム質量分析は、サンプルをイオンに変換するイオン源と、イオンを質量電荷比に基づいて分離する質量分析器を備えた典型的な質量分析装置として始まります。一般的な質量分析器である四重極は、特定の比率のイオンのみを通過させますが、他のイオンは装置のロッドに衝突します。通過を許された分子種は、プリカーサーイオンと呼ばれ、目的の生体分子です。イオンはコリジョンセル(通常は別の四重極)に移動し、そこでエネルギーが印加されて予測可能なパターンでイオンが断片化されます。

これらのフラグメントは、Time-of-Flightなどの別の質量分析器に移動し、これらの「プロダクトイオン」を分離します。その後、プロダクトイオンは、通常のMS装置と同様に検出器に送られます。未知のタンパク質の場合、得られるスペクトルには多数の重なり合うフラグメントが含まれているため、生体分子の決定的な完全な配列を生成することが困難になります。ただし、スペクトルパターンは特定のタンパク質に対して一意です。解析ソフトウェアは、スペクトルを既知のペプチド配列のデータベースと比較し、オーバーラップするフラグメントから未知のタンパク質を解明します。

サンプルと必要なフラグメンテーションの程度に応じて、複数のフラグメンテーション方法が可能です。フラグメンテーションパターンは、エネルギーの移動方法、その量、およびプリカーサーイオンを介したエネルギーの分布方法によって異なります。エネルギーは、中性粒子、放射線、または電子を介して伝達できます。中性原子を用いることで、衝突誘起解離(CID)と呼ばれるプロセスは、主にアミノ酸間のペプチド結合で切断され、アミノ酸の同定に理想的です。

この手法の基本がわかったところで、細菌細胞エンベロープの成分を研究するために使用されているCIDタンデム質量分析を見てみましょう。

すべての質量分析実験と同様に、最初のステップはサンプルをイオン化することです。生体分子の場合、これは通常、マトリックス支援レーザー脱離またはエレクトロスプレーイオン化によって行われます。次に、イオン光学系のチューニングにより、プリカーサーイオンシグナルが最適化されます。完了すると、ターゲットが分離され、CIDなどのフラグメンテーション方法が選択されます。

プリカーサーイオンをコリジョンセルに加速する印加電圧の強度は、フラグメンテーションの程度に影響します。この電圧は、前駆体が最高生成物イオンと比較して約10%の存在量になるまで増加します。複数のスペクトルが取得され、十分なS/N比が達成されるまで平均化されます。必要なスキャン回数は、元のプリカーサーイオンのシグナル強度に依存し、3〜300の範囲です。

この例の分析種は、大腸菌K-12由来の脂質Aで、CID後に19の主要なフラグメントがありました。脂質Aの一般的な構造はよく知られているため、ソフトウェアはサンプルから特定の組成を再構築できます。

手順を見てきたところで、生化学におけるタンデム質量分析の使用方法をいくつか見てみましょう。

タンデム質量分析の一般的なスキャンモードは、選択反応モニタリング(SRM)です。SRMでは、両方の質量分析計が選択した質量電荷比に固定され、特定のプリカーサーイオンと製品イオンに焦点を当てています。SRMは感度が高いため、既知の濃度のペプチドスタンダードのスペクトルを利用して、未知のサンプルのスペクトルと比較することで、目的のタンパク質を定量することができます。

タンパク質は、通常、メチル基、リン酸基、糖などの官能基(グリカン)の付加によって、翻訳後に修飾されます。これらは細胞シグナル伝達プロセスにおいて重要であり、細胞が互いにどのように通信するかを解明します。タンデム質量分析はタンパク質をより小さな成分に断片化するため、PTMが特定のフラグメントやアミノ酸に位置を特定することができます。アセチル化やトリメチル化などの一部の修飾は、質量だけでは区別が難しいため、質量分析の前にクロマトグラフィー分離を行います。

患者の血液中の多くの分析種は、一般的な質量分析の検出限界を下回る濃度で検出されます。SRMのもう一つの利点は、1つの製品イオンを除くすべての製品イオンを破棄し、感度を向上させ、検出下限を最大100倍に向上させることです。この例では、免疫抑制剤であるタクロリムスを 1 ng/mL のレベルで検出できます。

JoVEのタンデム質量分析に関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、機器の理論を説明し、一般的な手順を説明し、現在この技術がどのように利用されているかを説明しました。ご覧いただきありがとうございます!